陳 剛 繆 銘 江 波 馮 骉,

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

壓力—溫度協(xié)同作用下華根霉脂肪酶的催化行為研究

陳 剛1繆 銘2江 波2馮 骉1,2

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

研究了高壓處理中壓力和溫度對(duì)華根霉脂肪酶的活力和穩(wěn)定性的影響，并利用活性酶?變性酶的雙態(tài)模型考察了酶的熱變性，并構(gòu)建壓力—溫度二元相圖。研究結(jié)果表明：在0.1～200.0 MPa時(shí)，華根霉脂肪酶活力隨壓力提升而增加，其中在壓力200 MPa時(shí)酶活達(dá)到最高值，是常壓下初始酶活的116%；當(dāng)壓力超過200 MPa時(shí)，酶活開始降低，尤其在400～600 MPa范圍內(nèi)迅速降低。壓力—溫度協(xié)同作用下華根霉脂肪酶的加工穩(wěn)定性數(shù)據(jù)顯示，在200 MPa、40 ℃下酶熱穩(wěn)定性最佳，壓力超350 MPa時(shí)酶熱穩(wěn)定性顯著降低。

高壓；脂肪酶；溫度；酶活；熱穩(wěn)定性；催化行為；雙態(tài)模型

高靜壓(高壓)技術(shù)是一種非熱加工技術(shù)，有利于很好地保持和改善食品的功能和品質(zhì)[1]。高壓技術(shù)的一項(xiàng)典型應(yīng)用是滅菌[2]，20世紀(jì)90年代國(guó)外就有高壓處理果汁、肉制品等產(chǎn)品面市。高壓處理也能夠鈍化食品內(nèi)源酶，這一特性已被嘗試應(yīng)用于食品加工和保藏中。超高壓滅菌的效果受環(huán)境因素如溫度、pH、離子強(qiáng)度等的影響，有關(guān)此方面的研究已有相當(dāng)積累[3]。環(huán)境因子的影響也體現(xiàn)在高壓處理對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響[4]，特別是溫度對(duì)酶的催化活性具有重要作用。

高壓環(huán)境對(duì)酶的活力能產(chǎn)生重要的影響[4-5]，這一現(xiàn)象可用于誘導(dǎo)調(diào)節(jié)酶活，脂肪酶可作為典型實(shí)例來研究[6]。脂肪酶屬于絲氨酸水解酶類，能夠打斷酯鍵而水解酯類，在微水的有機(jī)環(huán)境中則能催化醇、酸合成酯的反應(yīng)，近年來非水相合成成為了酶工程的熱點(diǎn)[7]。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)某些脂肪酶經(jīng)高壓處理后活力有所提高，而有些脂肪酶則不存在此現(xiàn)象。本研究擬以華根霉脂肪酶(R.chinensislipase，RCL)為研究對(duì)象，考察其在壓力—溫度協(xié)同處理下的催化特性和穩(wěn)定性變化，以期為調(diào)控與食品相關(guān)的酶類的催化行為提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

華根霉脂肪酶：1 100 U/mg，泰興一鳴公司；

酚酞、95%乙醇、聚乙烯醇、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

橄欖油：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超高壓實(shí)驗(yàn)設(shè)備：MICRO FOODLAB FPG5740型，英國(guó)Standerd Fluid Power公司；

循環(huán)水浴系統(tǒng)：HAAKE SC 100型，美國(guó)Thermo Scientific公司；

電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

pH計(jì)：Delta 320s型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

磁力攪拌器：HS7型，德國(guó) IKA 公司；

精密天平：XS204型，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶活力的測(cè)定 底物溶液的配制：將40 g聚乙烯醇加入1 L去離子水中高溫?cái)嚢枞芙庵翢o顆粒，待冷卻后用3層紗布過濾，得到4%聚乙烯醇溶液。將聚乙烯醇溶液和橄欖油以3∶1的體積比混合均質(zhì)10 min，備用。

脂肪酶活力具體測(cè)定方法參見橄欖油乳化法[8]。除特別指出外，反應(yīng)體系所用的緩沖溶液均為pH 7.5 的磷酸緩沖液；相對(duì)殘余酶活定義為測(cè)得的酶活與40 ℃、0.1 MPa下的酶活之比。

1.2.2 酶液的高壓處理 在高壓設(shè)備上設(shè)定壓力和加壓時(shí)間，以體積分?jǐn)?shù)30% 1,2-丙二醇為傳壓介質(zhì)，并通過循環(huán)水浴穩(wěn)定試驗(yàn)溫度。將盛有酶液的耐高壓密封管放入高壓腔內(nèi)處理，高壓處理完畢后立即取出并測(cè)定酶活。

1.2.3 高壓處理對(duì)RCL活力的影響 將16 mg粗酶粉溶于500 mL pH 7.5的緩沖液，配制為適當(dāng)濃度的酶液。將該酶液裝入耐高壓密封管中，分別在40 ℃下以100，150，200，300，400，500，600 MPa處理10 min,泄壓后立刻取出并測(cè)其相對(duì)酶活。

1.2.4 溫度對(duì)RCL活力的影響 將上述酶液分別在0.1 MPa 和200 MPa下以35，40，45，50，60，70 ℃溫度處理10 min。取出后立刻分別在40 ℃和相應(yīng)溫度下測(cè)定酶活。在相應(yīng)處理溫度下測(cè)定的酶活表示酶在給定壓力下處理后的活力與處理溫度間的關(guān)系，在40 ℃下測(cè)定的酶活表示酶經(jīng)處理后的殘余活力。

1.2.5 壓力和溫度對(duì)RCL熱穩(wěn)定性的影響 將上法配制的酶液(緩沖液改為Tris-HCl，pH 7.5)分別在不同溫度(40，50，55，60 ℃)下以0.1，200.0，350.0，400.0，450.0，500.0 MPa的壓力處理不同時(shí)間，泄壓后立刻取出并測(cè)其活力。

1.2.6 溫度—壓力協(xié)同作用下RCL的熱失活動(dòng)力學(xué) 將上法配制的酶液(緩沖液改為Tris-HCl，pH 7.5)分別在10，15，20，25，30，35，40 ℃下以50，100，150，200，250，300 MPa處理10 min。40 ℃保溫3 min的6個(gè)樣品(4 mL底物溶液和5 mL濃度0.025 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl溶液混合制成)中依序加入0.9 mL處理后的脂肪酶酶溶液，計(jì)時(shí)。在反應(yīng)2，3，4，5，6，7 min時(shí)分別加入15 mL 95%乙醇滅活，以50 mmol/L 的NaOH溶液滴定并記錄數(shù)據(jù)，以NaOH耗用量對(duì)時(shí)間作圖，用線性回歸法得到反應(yīng)速率。

圖中所有數(shù)據(jù)均為多次重復(fù)試驗(yàn)后的均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓處理后RCL活力的變化

圖1表示RCL的水解酶活在40 ℃、pH 7.5下隨壓力的變化情況。由圖1可知，該脂肪酶經(jīng)0.1～200.0 MPa 處理后，其水解活力隨著壓力的提高而提高，在200 MPa 達(dá)到最大值，為常壓下原酶活力的116%，該壓力可當(dāng)作此條件下該酶反應(yīng)的最適壓力。當(dāng)壓力高于200 MPa以后，RCL酶活開始下降，但直到壓力為350 MPa時(shí)仍高于常壓下的酶活。此后，隨著壓力的提高，酶活開始下降到100%以下；在400～600 MPa范圍內(nèi)酶活顯著降低，說明此高壓下RCL快速失活。

大多數(shù)酶在高壓作用下易失活，Noel等[9]研究發(fā)現(xiàn)米黑毛霉脂肪酶在經(jīng)過高壓處理后處于鈍化狀態(tài)。也有部分報(bào)道表明在合適的高壓處理后某些酶的酶活會(huì)得到提升，楊新穎等[8]發(fā)現(xiàn)在低于400 MPa的壓力作用下解脂耶氏酵母脂肪酶的活力會(huì)得到提高，而壓力超過500 MPa時(shí)則急劇下降。杜煥梅等[4]的研究結(jié)果與本研究相似，該研究發(fā)現(xiàn)在0.1～200.0 MPa時(shí)，皺褶假絲酵母脂肪酶的酶活隨壓力的提高而逐漸提高，當(dāng)壓力超過200 MPa時(shí)開始下降，表明只有在合適的壓力范圍內(nèi)才能提高酶的催化能力。李赟高等[3]報(bào)道在200 MPa時(shí)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酶活提高了30%左右，并在600 MPa時(shí)明顯失活。趙偉等[1]發(fā)現(xiàn)在小于200 MPa的壓力作用下，牡蠣中的蛋白酶水解蛋白的活力顯著提高。Chen等[7]報(bào)道，米根霉脂肪酶與假絲酵母脂肪酶的酶活都隨著α-螺旋比例的提高而逐漸提升。劉苗等[10]發(fā)現(xiàn)高壓下菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酶活的變化與高壓誘導(dǎo)內(nèi)源熒光變化存在相關(guān)性。這些現(xiàn)象說明經(jīng)高壓處理后，酶結(jié)構(gòu)的變化與酶活的變化有一定的關(guān)系。

2.2 在不同溫度下經(jīng)高壓處理后的RCL活力的變化

固定壓力為200 MPa，在不同溫度下處理RCL并測(cè)定其活力，得到經(jīng)給定壓力處理后酶的活力與處理溫度間的關(guān)系，見圖2。由圖2可知，200 MPa下脂肪酶RCL的相對(duì)酶活相對(duì)于常壓下的都有提高，兩條曲線幾乎是并行的。在兩種壓力下，該酶的最佳催化溫度均位于40～45 ℃，表明高壓對(duì)該酶的最佳催化溫度幾乎沒有影響。這與某些報(bào)道所觀察到的現(xiàn)象有所不同，楊新穎等[8]發(fā)現(xiàn)高壓處理后解脂耶氏假絲酵母脂肪酶的最適反應(yīng)溫度偏移了5 ℃左右。在催化過程中，溫度不僅可提供酶催化反應(yīng)所需要的能量，促使酶的催化能力提高或者降低；此外，壓力能夠改變酶的構(gòu)象，因此不同壓力處理可能會(huì)使酶的最適催化溫度發(fā)生遷移。

經(jīng)200 MPa和不同溫度處理后測(cè)定RCL在40 ℃下的活力，可得到RCL在處理后的殘余活力，同時(shí)也比較了常壓下的酶活力，見圖3。由圖3可知，在35～50 ℃時(shí)，不同溫度下200 MPa的壓力作用導(dǎo)致的RCL活力提升略有不同，造成了RCL的殘余活力輕微波動(dòng)。隨著溫度繼續(xù)升高，由50 ℃到70 ℃時(shí)，RCL活力明顯下降，但下降速度慢于常壓下的速度。在處理溫度低于55 ℃時(shí)，該酶的殘余活力都高于初始酶活，表明200 MPa的壓力對(duì)該酶有保護(hù)作用。當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，殘余酶活仍有58%。而在0.1 MPa下該酶的活力隨溫度的提高快速下降，至70 ℃時(shí)已經(jīng)完全失活。上述結(jié)果表明，最適壓力下不僅酶的催化性能得到提高，而且酶抵抗熱變性的能力也提高了。其它學(xué)者[3,10]也得到了相似研究結(jié)果，在200 MPa、60 ℃處理?xiàng)l件下，菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的殘余活力明顯提高。

2.3 壓力和溫度對(duì)RCL熱穩(wěn)定性的協(xié)同作用

從上述研究可知，合適的高壓處理既能提高華根霉脂肪酶活力又有助于提高其耐熱性，而過高壓力則會(huì)引起脂肪酶的鈍化。研究[3]發(fā)現(xiàn)離子強(qiáng)度會(huì)影響酶的活力和穩(wěn)定性。為排除鹽離子的影響，試驗(yàn)選取Tris-HCl (pH 7.5)作為緩沖液。

在200，500 MPa下溫度對(duì)脂肪酶熱穩(wěn)定性的影響見圖4?？傮w而言，兩種壓力下熱穩(wěn)定性皆隨溫度的提升逐漸降低。圖4(a)表明，在200 MPa、40 ℃下保壓1 h后，脂肪酶殘余活力仍保持在原酶的100%左右，熱穩(wěn)定性很好。在溫度提升到50 ℃時(shí)，其熱穩(wěn)定性略有降低。當(dāng)提升到55 ℃以上，殘余酶活則顯著降低，熱穩(wěn)定性明顯變差。這表明即使在最適壓力下，脂肪酶在較高溫度下的熱失活作用仍不可避免。盡管在50 ℃時(shí)200 MPa的壓力可以明顯改善酶的催化能力并提高酶的穩(wěn)定性，但當(dāng)溫度提升到60 ℃時(shí)酶的失活速率明顯增加。圖4(b)顯示了500 MPa下RCL的熱穩(wěn)定性，酶活在最佳催化溫度下仍急劇下降，表明該酶熱穩(wěn)定性變差。有報(bào)道[6,11]指出，表面壓力誘導(dǎo)的酶鈍化伴隨著酶蛋白中更多的疏水區(qū)域暴露于水溶液中，在一定程度上會(huì)促進(jìn)熱失活。因此500 MPa的壓力處理將使酶熱穩(wěn)性變差。

結(jié)果顯示，在壓力200 MPa、溫度40～55 ℃時(shí)，RCL活力與處理時(shí)間呈線性關(guān)系；而當(dāng)溫度超過55 ℃時(shí)則呈曲線關(guān)系，這種現(xiàn)象也在其他脂肪酶的高壓熱穩(wěn)定性行為中被觀察到。Noel等[9]報(bào)道經(jīng)過同樣的高壓處理，40～50 ℃時(shí)米黑毛霉脂肪酶的殘余活力與處理時(shí)間呈線性關(guān)系，而在55～60 ℃時(shí)呈非線性關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)壓力的介入使得熱失活發(fā)生改變。通常認(rèn)為酶的熱失活速率服從一階微分方程，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)中活力與時(shí)間為線性關(guān)系。但高壓下RCL的熱失活速率顯然不服從一階微分方程，表明高壓下熱失活的動(dòng)力學(xué)發(fā)生了改變。從圖4(b)可知，酶活與處理時(shí)間呈非線性關(guān)系，說明壓力較高時(shí)，壓力會(huì)加快該酶的失活，這與本研究觀察到在500 MPa下RCL折疊展開而失活的現(xiàn)象相一致。

50 ℃下壓力對(duì)RCL熱穩(wěn)定性的影響見圖5 (a)。由圖5可知，只有200 MPa的處理才能顯著改善RCL的熱穩(wěn)定性；而在350 MPa下處理時(shí)，盡管酶的催化活性并不低于0.1 MPa下的，但熱穩(wěn)定性依然變差，并且隨著壓力的提高變得越來越差。

圖5與圖4(a)中的曲線有相似之處，當(dāng)壓力升高到一定程度后，RCL活力與時(shí)間的關(guān)系開始由直線轉(zhuǎn)變?yōu)榍€，說明酶的熱失活動(dòng)力學(xué)改變了，這對(duì)于超高壓加工技術(shù)在食品殺菌與鈍化酶中的應(yīng)用有重要啟示。60 ℃下壓力對(duì)RCL熱穩(wěn)定性的影響與圖5(a)趨勢(shì)相同，只是在相同壓力下酶的失活速率加快，在350 MPa下RCL活力與時(shí)間的關(guān)系已經(jīng)呈曲線關(guān)系。而壓力超過400 MPa時(shí)，RCL活力下降明顯加快。該結(jié)果表明一定壓力下壓力和溫度共同促進(jìn)了酶的熱失活。

Boulekou等[12]發(fā)現(xiàn)在700 MPa、50 ℃處理1 min后，桃漿中的果膠甲酯酶殘余活為80%左右；但在60 ℃下，果膠甲酯酶已經(jīng)明顯失活，該酶的殘余活力降為40%。曾慶梅等[13]報(bào)道過氧化物酶活力與β-折疊有關(guān)，高壓處理會(huì)減少該酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊含量，由此誘導(dǎo)酶失活；而溫度與高壓的共同作用會(huì)導(dǎo)致β-折疊含量減少，進(jìn)而促使酶活下降。另一方面，Noel等[9]則發(fā)現(xiàn)即使在水相體系中超高壓也可以提高R.miehei脂肪酶的穩(wěn)定性，而且在達(dá)到變性溫度50 ℃時(shí)，高壓(50～350 MPa)能夠保護(hù)脂肪酶的結(jié)構(gòu)，并且隨著溫度的提高，這種保護(hù)效應(yīng)越來越明顯。這些研究表明高壓—溫度協(xié)同作用可能是通過酶構(gòu)象的改變來調(diào)節(jié)酶催化行為。

2.4 溫度—壓力二元作用下的熱變性動(dòng)力學(xué)

上述研究結(jié)果表明，對(duì)于壓力和溫度共同作用下酶的穩(wěn)定性，兩者既可能表現(xiàn)為相互拮抗，也可能表現(xiàn)為相互促進(jìn)，其中的解釋與熱變性動(dòng)力學(xué)有關(guān)。

如果把酶的熱失活(本質(zhì)上是蛋白質(zhì)的熱變性)假設(shè)為一個(gè)雙態(tài)模型：活性酶?變性酶，這個(gè)過程的平衡常數(shù)Keq可以用下列公式表示：

(1)

式中：

[E]A、[E]D——分別表示活性酶與變性酶的濃度，mol/L；

[E]max——活性酶濃度的最大值，mol/L。

根據(jù)米氏方程，酶反應(yīng)速率可以寫為：

(2)

若[S]?Km，則Km可以被忽略，此時(shí)反應(yīng)速率接近于恒定值，反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)：

(3)

本研究中，酶活的測(cè)定均在常壓、40 ℃下進(jìn)行，k值恒定，因而反應(yīng)速率v與活性酶濃度[E]成正比，式(1) 可以寫成：

(4)

式中：

vmax——最適溫度或壓力下對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率，μmol/(mL·min)。

若活性酶?變性酶的可逆變化處于平衡時(shí)，變性酶的含量為零，則Keq的值為0，由式(4)可推得v=vmax。找到常壓下反應(yīng)速率vmax的值所對(duì)應(yīng)的溫度值或者一定溫度下反應(yīng)速率vmax的值所對(duì)應(yīng)的壓力值即可得到100%活性酶的溫度—壓力二元相圖。

本研究證實(shí)試驗(yàn)條件下RCL催化的橄欖油水解速率與底物濃度無關(guān)，并由此得到了vmax。本研究測(cè)定了RCL在不同溫度及壓力處理下的反應(yīng)速率，vmax所對(duì)應(yīng)的溫度分別為10，15，20，25，30，35，40 ℃；而其所對(duì)應(yīng)的壓力分別為50，100，150，200，250，300 MPa，從而得到溫度—壓力二元相圖，見圖6。

圖6中的橢圓代表了活性酶和變性酶的平衡。當(dāng)溫度和壓力均位于橢圓之內(nèi)，酶將處于活性狀態(tài)；而當(dāng)溫度和壓力處于橢圓外部時(shí)，酶則處于失活狀態(tài)。由圖6可知，對(duì)于右半支曲線上的A點(diǎn)，當(dāng)壓力提高時(shí)，同時(shí)需要進(jìn)一步提高溫度，才能使酶失活，說明溫度和壓力對(duì)酶活的影響存在拮抗效應(yīng)，壓力的提高可以將酶于高溫下的穩(wěn)定性提高。因此，可以通過適當(dāng)?shù)膲毫μ幚韥砀纳泼傅姆€(wěn)定性。

在高于42 ℃的溫度下，改變壓力已無法使該酶的狀態(tài)回到橢圓內(nèi)，此時(shí)，隨著溫度的提升，酶的狀態(tài)偏離橢圓曲線的程度不斷加劇，說明壓力已經(jīng)不足以抵抗熱變性導(dǎo)致的酶構(gòu)象變化。而當(dāng)壓力超過325 MPa時(shí)，也使酶的狀態(tài)不斷偏離橢圓曲線，壓力的提升開始對(duì)酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，壓力和溫度之間表現(xiàn)為相互促進(jìn)。

3 結(jié)論

高壓處理能夠改變?nèi)A根霉脂肪酶的活力，但壓力過高會(huì)引起該酶的失活，200 MPa是最適處理壓力，在此壓力下處理可使RCL的活力提高16%。高壓處理并未改變RCL的最佳催化溫度。另一方面，即使在最佳壓力下，該酶的熱失活現(xiàn)象依然存在。壓力—溫度協(xié)同作用下RCL的熱穩(wěn)定行為表明：200 MPa處理能夠顯著改善RCL的熱穩(wěn)定性，而較高壓力將改變RCL的熱失活動(dòng)力學(xué)。在0.1～200.0 MPa范圍內(nèi)壓力和溫度之間存在拮抗效應(yīng)，而當(dāng)壓力超過350 MPa后高壓處理反而降低了RCL的熱穩(wěn)定性，即壓力和溫度之間呈現(xiàn)促進(jìn)效應(yīng)。建立活性酶?變性酶的雙態(tài)模型考察了RCL的熱穩(wěn)定性，本研究測(cè)得的橢圓曲線符合熱力學(xué)理論推導(dǎo)的結(jié)果，同時(shí)也可以解釋壓力和溫度協(xié)同作用下RCL的熱穩(wěn)定性行為。

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Study on catalytic behaviors ofRhizopuschinensislipase under synergic action of high pressure and temperature

CHEN Gang1MIAOMing2JIANGBo2FENGBiao1,2

(1.SchoolofFoodScience,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 2.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

The effects of pressure and temperature on the activity and the stability ofRhizopuschinensislipase during high hydrostatic pressure treatment were studied. Based on the two-state model, the thermal denaturation of the enzyme was investigated and the isokineticity diagram was obtained. Within 0.1～200.0 MPa the enzyme activity increased with the pressure and the maximum activity was achieved at 200 MPa, which was 116% of that at atmospheric pressure. The activity began to decrease at pressure above 200 MPa and this tendency accelerated upon the pressure superior to 400 MPa. The high pressure treatment did not modify the optimal temperature of the enzyme. The enzyme exhibited the highest stability when it was treated at 200 MPa and 40 ℃. Its stability declined obviously when it was treated under pressure above 350 MPa. The above behavior could be explained by the isokineticity diagram.

high hydrostatic pressure; lipase; temperature; relative activity; thermostability；catalytic behavior；two-state model

教育部博士點(diǎn)基金(編號(hào)：20130093110010)

陳剛，男，江南大學(xué)在讀博士研究生。

馮骉(1953—)，男，江南大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，博士。 E-mail：bfeng@jiangnan.edu.cn

2017-01-20

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.001