蔣龍波++張依人++張可人++陳葉童

[摘要] 目的 優(yōu)選骨刺康復(fù)丸的提取工藝參數(shù)，為該制劑工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。 方法 以浸膏得率與青藤堿含量為評價指標，采用流動相：乙腈-乙二胺（32∶68），流速1.0 mL/min，檢測波長262 nm；柱溫30℃的HPLC Welchrom C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）測定青藤堿含量，單因素試驗考察藥材吸水率、提取次數(shù)，正交設(shè)計試驗法考察加水量、煎煮時間、浸泡時間三個因素在不同水平對實驗結(jié)果的影響。 結(jié)果 骨刺康復(fù)丸最佳水提工藝參數(shù)為：藥材吸水率為180.9%，提取2次 ，第一次加10倍量水，提取2.5 h，第二次加8倍量水，提取2 h。按最佳水提工藝參數(shù)驗證試驗結(jié)果表明，浸膏得率可達33.08%、RSD為0.64%、青藤堿含量可達16.70 mg/mL、RSD為1.99%。 結(jié)論 優(yōu)選的水提工藝參數(shù)科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可行，適應(yīng)于該制劑的工業(yè)化生產(chǎn)。

[關(guān)鍵詞] 骨刺康復(fù)丸；浸膏得率；青藤堿含量；正交設(shè)計試驗；提取工藝

[中圖分類號] R284.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（a）-0016-05

Optimum water-extracting technology parameter of Guci Kangfu pill by orthogonal design test

JIANG Longbo1 ZHANG Yiren1 ZHANG Keren1 CHEN Yetong1 JIANG Cuiping2 ZENG Rong1 PENG Maijiao1 ZOU Long1

1.School of Pharmacy， Hu′nan University of Chinese Medicine， Hu′nan Province， Changsha 410208， China； 2.Pharmacy Department， Liuyang Chinese Medicine Hospital， Hu′nan Province， Liuyang 410300， China

[Abstract] Objective To optimize extraction technical parameters of Guci Kangfu pills， and to provide the evidence for industrial production. Methods The rate of extractum and sinomenine contents were selected as evaluation index； Sinomenine content was determined with the mobile phase of acetonitrile-ethlenediamine（32：68）， the flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength 262nm，and HPLC welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） with column temperature of 30℃. The water absorption rate and the number of extraction times were investigated by the single factor experiment. The effects on the experimental results with different levels of the soaking time， the amount of water and the time of extraction was studied by orthogonal method. Results The Guci Kangfu pills optimum water extraction parameters： medicinal water absorption was 180.9%， extracting 2 times， the first with 10 times amount of water， extracting times was 2.5 h， second time with 8 times the amount of water， extracting time was 2 h. The optimum parameters of testing results showed that the extraction rate can reach 33.08%， RSD 0.64% and the content of sinomenine can reach 16.7 mg/mL， RSD 1.99%. Conclusion The optimal water extraction process parameters are scientific， reasonable， stable and feasible， and suitable for the industrial production.

[Key words] Guci Kangfu pill； The rate of extractum； Sinomenine contents； Orthogonal design test； Extraction process

骨質(zhì)增生[1-2]的產(chǎn)生主要由于反復(fù)勞損、外傷或受風(fēng)寒之邪侵襲，致機體氣血運行不暢、閉住經(jīng)絡(luò)，引起疼痛，是人體常見的難以治愈的退行性疾病，也是臨床常見的慢性疾病[3-4]。目前西醫(yī)采用非激素類消炎止痛藥物治療，對緩解癥狀有一定效果，但皆有一定的毒副作用。而中醫(yī)采用辨證論治整體觀對骨質(zhì)增生癥[5-6]進行治療。骨刺康復(fù)丸處方來源于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床經(jīng)驗方（處方組成為：青風(fēng)藤30 g、當(dāng)歸15 g、延胡索15 g、桑寄生15 g、赤芍12 g、枳殼12 g、柴胡10 g、淫羊藿10 g、甘草10 g等），多年來一直以水提制丸入藥。方中青風(fēng)藤[7-8]味苦、性平，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)的功效，治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫脹為君藥；臣藥選以當(dāng)歸、延胡索、桑寄生、枳殼、等具有活血祛瘀、止痛之效的藥材[9]；佐藥選以赤芍、柴胡、淫羊藿等具有補腎陽、強筋骨之藥材。全方具補益肝腎，養(yǎng)血活血祛瘀，祛風(fēng)散寒止痛之功效，療效顯著，充分顯示了中醫(yī)藥治療本病的優(yōu)勢。原工藝未對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，本實驗以方中浸膏得率、青藤堿（止痛活性成分）為考察指標，在單因素試驗確定吸水率和提取次數(shù)的基礎(chǔ)上，采用正交實驗優(yōu)選出最佳水提工藝參數(shù)，為骨刺康復(fù)丸水提工藝提供有效依據(jù)[10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SHB-ⅢA循環(huán)水式真空泵（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；DZF-6020型真空干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；HH-600三用恒溫水箱（金壇市神科儀器廠）；AR124CN電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；萬能粉碎機（長沙宏衛(wèi)科技制藥機械設(shè)備廠）；DZ-20小型多功能中藥制丸機（長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠）。

1.2 試藥

骨刺康復(fù)丸中藥材均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院合格藥材庫，經(jīng)鄒龍教授鑒定均符合《中國藥典》2015年版一部相關(guān)藥材項下的有關(guān)規(guī)定[11]，青風(fēng)藤中青藤堿含量不低于0.5%；青藤堿對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號YY-90116，含量≥98%）；乙腈（色譜純 美國TEDIA）；甲醇（色譜純 美國TEDIA）；乙二胺（分析純 長沙市有機試劑廠）等。

2 方法與結(jié)果

2.1 骨刺康復(fù)丸水提液中青藤堿的含量測定

2.1.1色譜條件 色譜柱為Welchrom C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-乙二胺（32∶68）[12]，流速為1.0 mL/min，檢測波長為262 nm；柱溫為30℃。

2.1.2 對照品溶液的制備 取青藤堿對照品，精密稱定，加甲醇定容至10 mL，制成每毫升含1.16 mg青藤堿對照品的濃儲備液，再取青藤堿對照品濃儲備液5 mL，加甲醇定容到10 mL，制成每1 mL含青藤堿0.58 mg的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 按正交1號制備方法取試驗樣品（提取液）5 mL，加甲醇定容到10 mL，混勻，離心，取上清液，以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，待測。

2.1.4 陰性溶液的制備 取除去青藤藥材外的17味藥材，按正交1號制備方法制成制備液，再按2.1.3處理成分析用陰性供試品溶液。

2.1.5 專屬性試驗 按照2.1.1，分別精密吸取上述三種溶液各10 μL，進針測量，記錄HPLC色譜圖。在陰性樣品的HPLC色譜圖中，未見青藤堿的色譜峰出現(xiàn)，表明陰性樣品對青藤堿的測定無干擾，結(jié)果見圖1。

2.1.6 標準曲線的繪制 精密吸取青藤堿0.58 mg/mL的對照品儲備液適量于2 mL容量瓶中，加甲醇稀釋成濃度分別為580、290、145、58、29、14.5 μg/mL的溶液，精密吸取各濃度梯度對照品溶液各10 μL進樣，以峰面積為橫坐標（X），濃度為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程Y =0.1181 X+2.5978（R2 =0.9999），青藤堿在145～580 μg/mL呈良好的線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗 取2.1.2項下同一對照品溶液10 μL進樣，按照上述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定青藤堿峰面積的RSD值。結(jié)果RSD=0.13%，表明該儀器精密度良好。取正交1號提取液10 μL進樣，按照上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定青藤堿峰面積的RSD值。結(jié)果RSD=1.87%，表明該儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗 取正交1號提取液6份，每份5 mL，分別加甲醇定容到10 mL，混勻，離心，取上清液，以0.45 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進行含量測定，進樣量為10 μL，測定并計算樣品中青藤堿的含量。青藤堿的平均含量為0.1939 mg/mL，RSD值為1.42%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（正交1號提取液），分別于0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，測定青藤堿的峰面積及含量。RSD值為2.34%，表明供試品在24h內(nèi)的含量穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收率試驗 取正交1號提取液6份，每份取3 mL，精密加入濃度為0.58 mg/mL的對照品溶液1 mL，加甲醇定容到10 mL，按供試品制備方法同法處理，0.45 μm微孔濾膜過濾，按2.1.1色譜條件測定，進樣量10 μL，計算樣品中青藤堿的含量及回收率。青藤堿的平均回收率為99.97%，RSD值為2.87%，結(jié)果表明，該分析方法回收率較好，準確度高，結(jié)果表明該方法可用于骨刺康復(fù)丸水提工藝研究。

2.2 骨刺康復(fù)丸水提液與干浸膏得率的測定方法

將處方1/2量青風(fēng)藤，當(dāng)歸等水提藥材，在回流提取裝置上按提取方案分別提取倆次，合并提取液，將每份提取液在60℃、0.0095 MPa條件下減壓濃縮至稠膏狀，并減壓干燥至含水量為（5±0.15%），使試驗結(jié)果具有可比性。

2.3 單因素試驗考察藥材吸水率和提取次數(shù)

2.3.1 藥材吸水率的考察 按處方量稱取青風(fēng)藤、當(dāng)歸等水提藥材，共計219 g，共三份，分別加入10倍量水，浸泡24 h，濾過，測量濾液體積，并計算吸水率。結(jié)果可得藥材吸水率平均值為180.9%，RSD為1.231%，根據(jù)實際操作，可確定第一次提取多加2倍量的水作為提取溶媒量。

2.3.2 提取次數(shù)的選擇 因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，不能列入正交表中考察，因此必須采用單因素試驗，且根據(jù)前期對處方藥材吸水率的研究，按1/2處方量稱取青風(fēng)藤、當(dāng)歸等水提藥材，總量109.5 g，共三份，第一份加熱回流提取1次，加水量10倍，提取時間2.5 h；第二份提取2次，分別加水量10倍、8倍，提取時間分別為2.5 h、2 h，合并2次提取液；第三份提取三次提取，分別加水量10倍，8倍，8倍，提取時間分別為2.5 h、2 h、2 h，合并3次提取液；分別得到1、2、3次提取液，再分別在60℃、0.0095 MPa條件下減壓濃縮定容至500 mL，上述方法重復(fù)2次，同2.2法測定浸膏得率和提取液中青藤堿的含量。見表1。

2.3.3 正交設(shè)計試驗與結(jié)果 通過查閱文獻及前期實驗[13-16]，，按1/2處方量稱取藥材，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選取了加水量（A），煎煮時間（B），浸泡時間（C）三個考察因素，并以浸膏得率和青藤堿含量為考察指標，每個指標分別占40%、60%來進行綜合評分，總分作為優(yōu)化指標，進行方差分析。按正交設(shè)計L9（34）表安排九次試驗，見表2，結(jié)果見表3、4。

由表4因素間方差分析結(jié)果可知，A（P=0.0303）因素、B因素（P=0.0124）有統(tǒng)計學(xué)意義，再進行水平間方差分析，見表5。

由表5正交設(shè)計試驗水平間方差分析可知，A因素在各水平間1與2、1與3間有統(tǒng)計學(xué)意義，按K值大小順序選擇2或3水平，根據(jù)經(jīng)濟學(xué)原則，選擇2水平；B因素在各水平間1與3、2與3間有統(tǒng)計學(xué)意義，按K值大小排序選擇3水平；C因素水平間皆無統(tǒng)計意義，從經(jīng)濟學(xué)角度選擇不浸泡為佳，因此水提取的最佳工藝為A2B3C1，即藥材不浸泡，提取2次，加水量為藥材量的10倍、8倍，煎煮時間2.5 h、2.0 h，該工藝參數(shù)可為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

2.3.4 驗證試驗 對正交試驗設(shè)計優(yōu)選出的最佳提取工藝條件平行進行三次驗證試驗，按1/2處方量稱取青風(fēng)藤，當(dāng)歸等水提中藥，提取2次，第一次加10倍量水，提取2.5 h，第二次加8倍量水，提取2 h，濾過，合并濾液，定容到500 mL，分別按“提取次數(shù)的選擇試驗”項下方法測定浸膏得率和青藤堿含量。結(jié)果見表6。

結(jié)果表明：按最佳提取工藝方案所得浸膏得率和青藤堿含量波動不大，浸膏得率可達33.08%、RSD為0.64%、青藤堿含量可達16.70 mg/mL、RSD為1.99%，綜合評分均值為23.25，RSD為1.05%，可見所確定的提取工藝條件穩(wěn)定、可重復(fù)。

3 討論

骨刺康復(fù)丸是在臨床經(jīng)驗方基礎(chǔ)上將湯劑改變劑型制成水丸，水丸具有溶散、釋藥快，起效快，迅速緩解骨質(zhì)增生引起的劇烈疼痛，可減少不良反應(yīng)。該方中青風(fēng)藤為君藥，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)，治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫脹之功效，其主要有效成分為青藤堿，故選擇青藤堿為考察指標。

本研究首創(chuàng)骨刺康復(fù)丸的最佳提取工藝參數(shù)，為其工業(yè)化生產(chǎn)、質(zhì)量控制研究、穩(wěn)定性研究、藥效、毒理學(xué)和臨床研究提供了依據(jù)。

骨刺康復(fù)丸系大復(fù)方，應(yīng)有兩種有效成分含量測定指標，很遺憾本實驗只做了青藤堿一種指標。原計劃建立延胡索乙素含量測定指標，因水提液中，延胡索乙素含量很低，HPLC檢測不到，故放棄。從理論上講，延胡索應(yīng)采用50%乙醇提取，但本方由湯劑改成丸劑，沿用已久，只能采用水提，若采用乙醇提取，處方劑量與提取方法均相應(yīng)改變，系今后考慮的問題[17]。

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（收稿日期：2016-12-09 本文編輯：占匯娟）