■魏 莎 梁賢威 梁 辛 李孟偉 郭艷霞 楊承劍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

甲烷是主要溫室氣體之一，其排放總量僅次于二氧化碳，單位質(zhì)量甲烷的全球增溫潛能值是二氧化碳的25倍[1]。全球每年排放的甲烷量約為500 Tg，其中反芻動(dòng)物排放量占排放總量的15%～25%[2]。在全球家畜的甲烷排放量中，反芻動(dòng)物占97%[3]。因此，控制甲烷排放是避免全球氣候變暖影響加重的關(guān)鍵，而其重點(diǎn)之一在于控制反芻動(dòng)物甲烷的排放。反芻動(dòng)物甲烷是由瘤胃內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌生成。當(dāng)前，反芻動(dòng)物瘤胃產(chǎn)甲烷菌的研究已引起各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。水牛是一種典型的以高粗日糧為主的反芻動(dòng)物，其產(chǎn)生的甲烷是草食畜牧業(yè)生產(chǎn)中甲烷排放總量的重要組成部分[4]。我們實(shí)驗(yàn)室通過454平臺對摩拉和尼里-拉菲水牛瘤胃甲烷菌區(qū)系的研究表明，Methanobrevibacter是優(yōu)勢菌，而Thermoplasma屬甲烷菌，即瘤胃古菌C簇（Rumen Cluster C,RCC），為第二優(yōu)勢菌。目前對瘤胃Methanobrevibacter屬和Methanomicrobiums屬甲烷菌進(jìn)行了大量研究，相比較而言，對Rumen Cluster C的研究還少，其原因在于該屬甲烷菌難以采用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行分離培養(yǎng)。因此，綜合運(yùn)用傳統(tǒng)微生物學(xué)，不依賴于培養(yǎng)的分子生物學(xué)、宏基因組學(xué)和生物信息學(xué)等工具研究該類甲烷菌的生理代謝特點(diǎn)對調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵，抑制甲烷生成具有重要意義。本文介紹了RCC近年來的研究成果，為進(jìn)一步研究RCC的生理代謝機(jī)制提供了研究思路。

1 瘤胃古菌C簇

瘤胃微生物是共生在牛、羊、鹿等反芻動(dòng)物瘤胃中的細(xì)菌和原生動(dòng)物等微生物的總稱,包括厭氧性的細(xì)菌、真菌、古菌和原蟲四大類。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃內(nèi)存在著一大群未分類未培養(yǎng)古菌。這群未培養(yǎng)古菌的序列經(jīng)常出現(xiàn)在古菌16S rRNA基因文庫中[5-8]。由于這群古菌尚未成功分離培養(yǎng)，因此目前大多數(shù)相關(guān)研究是采用16S rRNA等不依賴培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行。Tajima等[5]通過16S rRNA的分子生物學(xué)方法分析牛瘤胃古菌的多樣性，其研究首次報(bào)道了瘤胃中存在RCC古菌。Kim等[9]基于16S rRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn)，這群古菌在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上與熱源體古菌相近，同時(shí)又存在較大差異。Janssen等[10]在全球數(shù)據(jù)組分析的基礎(chǔ)上，將瘤胃內(nèi)容物中檢測到的92.3%瘤胃古菌分成三個(gè)屬；其中，61.6%瘤胃古菌屬于甲烷短桿菌（Methanobrevibacter），14.9%瘤胃古菌屬于甲烷微菌（Methanomicrobium），15.8%的瘤胃古菌屬于未培養(yǎng)古菌，這群未培養(yǎng)古菌被標(biāo)記為瘤胃古菌C簇（Rumen Cluster C,RCC）。

2 RCC的分布

2.1 RCC在自然環(huán)境中的分布

RCC不僅存在于牛的瘤胃中，還廣泛分布于其他動(dòng)物的消化道、海洋、土壤等自然環(huán)境中。RCC最早在海洋環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)[11]。隨后，在水稻田土壤[12]、湖水[13]、垃圾填埋場滲濾液[14]、豬糞便[15]等環(huán)境中均發(fā)現(xiàn)RCC的存在。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物的消化道內(nèi)亦存在RCC。Wright等[16]以美利奴羊?yàn)檠芯繉ο?，發(fā)現(xiàn)其瘤胃中存在RCC古菌。Evans等[17]對尤金袋鼠前腸的甲烷菌群落組成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)RCC古菌的存在。Jeyanathan等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊、牛、馬鹿的瘤胃中均存在RCC古菌群落。不僅在動(dòng)物體內(nèi)，研究還發(fā)現(xiàn)在人的齦袋和腸道中存在RCC古菌[19-22]。除了哺乳動(dòng)物，在白蟻[23-25]、食木蟑螂[26]及圣甲蟲幼蟲[27]的腸道內(nèi)均存在RCC古菌。綜上所述，RCC古菌廣泛分布于海洋、土壤、白蟻和哺乳動(dòng)物的腸道等自然環(huán)境中。

2.2 RCC在瘤胃中的分布

到目前為止，RCC已在很多反芻動(dòng)物瘤胃中被發(fā)現(xiàn)，其中包括牛[5-6，18，28-30]、綿羊[18，31-32]、山羊[33-34]、水牛[35]和馬鹿[18]。雖然大量研究證明瘤胃產(chǎn)甲烷菌中的優(yōu)勢菌是Methanobrevibacter，但另一些研究發(fā)現(xiàn)，其他種屬的產(chǎn)甲烷菌（例如：RCC）在瘤胃中也占有一定的比例。我們實(shí)驗(yàn)室通過454平臺對摩拉和尼里-拉菲水牛瘤胃甲烷菌區(qū)系的研究表明，Methano?brevibacter是優(yōu)勢菌，而Thermoplasma屬甲烷菌，即瘤胃古菌C簇（Rumen Cluster C,RCC），為第二優(yōu)勢菌。Jeyanathan等[18]以綿羊和牛為研究對象，結(jié)果顯示RCC占總古菌數(shù)量的平均比例是26.5%。Janssen等[10]報(bào)道，RCC在瘤胃中的平均比例大約為15.8%。金巍[36]對山羊進(jìn)行研究，結(jié)果顯示高粗料組瘤胃內(nèi)容物中RCC占總古菌數(shù)量的平均比例是26.7%，而高精料組的大幅度下降到3.1%。Pei等[28]對晉南牛進(jìn)行研究，結(jié)果顯示RCC占總甲烷菌的比例在瘤胃上皮黏膜中是25.5%，在瘤胃內(nèi)容物液相中是12.4%，在瘤胃內(nèi)容物固相中是23.7%。Chaudhary等[37]對印度摩拉水牛進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其瘤胃內(nèi)容物中RCC是第一優(yōu)勢菌。Huang等[32]對中國青藏高原奶牛和耗牛的研究，其結(jié)果亦顯示其瘤胃中RCC最豐富。綜上，RCC在反芻動(dòng)物瘤胃中占有一定的比例，而且其在特定條件下會取代甲烷短桿菌成為瘤胃甲烷菌最優(yōu)勢菌群。因此，RCC是調(diào)控反芻動(dòng)物甲烷產(chǎn)量的目標(biāo)甲烷菌。

3 RCC的生物學(xué)特性

3.1 RCC的營養(yǎng)需求

產(chǎn)甲烷菌不能利用復(fù)雜的有機(jī)物，其主要能源和碳源物質(zhì)有5種，即H2/CO2、甲酸、甲醇、甲胺和乙酸。根據(jù)底物類型，反芻動(dòng)物瘤胃甲烷生成機(jī)制可分為四種：①氫營養(yǎng)型：利用氫氣還原二氧化碳或利用甲酸生成甲烷；②乙酸鹽營養(yǎng)型：裂解乙酸生成甲烷；③甲基營養(yǎng)型：利用甲醇、甲胺、二甲胺和三甲胺等甲基化合物生成甲烷；④氫+甲基營養(yǎng)類型：利用氫氣還原甲醇或甲胺、二甲胺、三甲胺等甲基化合物生成甲烷[38]。

在反芻動(dòng)物瘤胃中，氫營養(yǎng)甲烷菌是產(chǎn)甲烷菌群的優(yōu)勢菌[10]，其原因可能是它們具有相對快速的生長能力?？焖俚纳L使氫營養(yǎng)甲烷菌能爭奪到充足的底物，從而維持菌群規(guī)模。RCC極難分離純化，目前尚未從瘤胃中成功分離出RCC的純菌株。對其營養(yǎng)類型進(jìn)行研究，有助于找到適合RCC的培養(yǎng)基，進(jìn)而成功分離出RCC純菌。金巍[36]利用體外共培養(yǎng)模型研究了雞源RCC菌株MGC的氫營養(yǎng)特性。實(shí)驗(yàn)表明了MGC是嚴(yán)格利用氫氣還原甲醇和三甲胺產(chǎn)生甲烷的產(chǎn)甲烷菌。Liu等[38]報(bào)道，RCC菌株MGC利用氫氣還原甲基化合物生成甲烷。Fricke等[39]報(bào)道，RCC古菌利用氫氣還原甲醇產(chǎn)生甲烷。在營養(yǎng)類型方面，甲烷微球菌嚴(yán)格利用氫氣還原甲醇、甲胺、二甲胺和三甲胺產(chǎn)生甲烷[40]，RCC似乎與甲烷微球菌相同。此外，RCC不能利用二氧化碳，能以甲醇或三甲胺為底物生成甲烷。但是，僅在體外共培養(yǎng)模型中添加甲基化合物（甲醇或三甲胺）不能富集RCC菌株[36]。

3.2 宿主特異性和日糧對RCC的影響

RCC在瘤胃中的平均比例大約為15.8%[10]。在印度摩拉水牛[37]、中國青藏高原奶牛和耗牛[32]瘤胃中RCC是第一優(yōu)勢菌。然而，RCC在梅花鹿瘤胃的豐度不足1%[41]。此外，Jeyanathan 等[18]以羊、牛、馬鹿為研究對象，發(fā)現(xiàn)飼喂相同日糧時(shí)RCC古菌群落結(jié)構(gòu)在這三種動(dòng)物之間存在差異。金巍[36]對山羊進(jìn)行研究，結(jié)果顯示精料組的RCC甲烷菌數(shù)量顯著低于粗料組。這些研究認(rèn)為，RCC的豐度和群落結(jié)構(gòu)受宿主特異性和日糧因素影響。

4 基于DGGE技術(shù)和16S rRNA/rDNA技術(shù)的RCC研究進(jìn)展

產(chǎn)甲烷古菌生存于嚴(yán)格厭氧的環(huán)境中，并且其生長速率通常很低，培養(yǎng)方式獨(dú)特（需要Hungate滾管法厭氧培養(yǎng)或厭氧工作站），因此很難采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)對其進(jìn)行研究。目前，尚未有分離得到RCC純培養(yǎng)體的報(bào)道，即便得到了純培養(yǎng)體，其形態(tài)和生理也可能產(chǎn)生很多變化。至今，反芻動(dòng)物瘤胃中只有極小部分產(chǎn)甲烷菌得到分離。因此，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于瘤胃菌群的研究，其可有效地克服傳統(tǒng)分析檢測方法的缺點(diǎn)，更準(zhǔn)確、更靈敏地反映出各種產(chǎn)甲烷菌的分子特性，并且基于基因序列分析的技術(shù)可發(fā)現(xiàn)瘤胃中可能存在的未知產(chǎn)甲烷菌。

變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Elec?trophoresis,DGGE)技術(shù)能夠分離分子量相同而序列不同的DNA片段。DGGE技術(shù)1993年被Muyzer等[42]首次應(yīng)用于分子微生物學(xué)領(lǐng)域研究。成艷芬[43]建立了適用于瘤胃古菌分析的DGGE方法。通過DGGE方法分析發(fā)現(xiàn)，山羊瘤胃中的主要產(chǎn)甲烷菌為甲烷短桿菌和RCC菌株LGM。Jeyanathan等[18]研究發(fā)現(xiàn)，RCC序列在全部古菌16s rRNA基因的DGGE圖譜中不容易檢測到，因?yàn)閱我坏男蛄蓄愋筒蛔阋载S富到形成顯帶。瞬時(shí)溫度梯度電泳（TTGE）是由DGGE改進(jìn)而成。Nicholson等[7]運(yùn)用TTGE技術(shù)對放牧羊和牛的瘤胃甲烷菌菌群多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果證明它們瘤胃內(nèi)存在大量RCC古菌。這些研究表明，DGGE技術(shù)對于瘤胃甲烷菌群多樣性和未知生物群落的鑒定具有很好的效果。但技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)，例如條帶共遷移現(xiàn)象，圖譜分辨率低，結(jié)果分析偏差，反映菌種多樣性有限等等。這些缺點(diǎn)在一定程度上限制了該技術(shù)在瘤胃微生物系統(tǒng)上的應(yīng)用。可以尋求一些方法來完善對菌群信息的揭秘。將DGGE技術(shù)與熒光原位雜交（FISH）、限制性片段長度多態(tài)性（RLFP）等多種生物技術(shù)一起應(yīng)用，可以獲取更完整的微生物信息。

16S rRNA/rDNA技術(shù)是根據(jù)不同微生物在16S rRNA及其基因（16S rDNA）可變區(qū)序列上的差異來進(jìn)行微生物種類的分類和鑒定。近年來，隨著生物技術(shù)的日臻成熟，計(jì)算機(jī)技術(shù)的普及，一些國際公認(rèn)、公開的16S rDNA數(shù)據(jù)庫的建立（如RDP、GenBank、SIL?VA、HOMD），古菌16S rRNA的資料不斷得到完善，古菌的研究不斷取得進(jìn)展。Tajima等[5]通過16S rRNA的分子生物學(xué)方法分析牛瘤胃古菌的多樣性，其研究首次報(bào)道了瘤胃中存在RCC古菌。Wright等[31]通過16S rRNA基因文庫分析羊的瘤胃甲烷菌分子多樣性，其研究首次驗(yàn)證了RCC古菌序列來源于瘤胃。同一作者進(jìn)一步研究，Tymensen等[44]對牛的兩種產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行16S rRNA序列分析和甲基輔酶M還原酶A(mcrA)基因克隆文庫分析。結(jié)果表明，這兩種產(chǎn)甲烷菌群落均是由甲烷短桿菌、甲烷微菌和RCC組成，其中RCC在獨(dú)立生存產(chǎn)甲烷菌群落中更占優(yōu)勢。Paul等[45]對白蟻和蟑螂腸道的古菌進(jìn)行16S rRNA基因分析和mcrA基因分析，結(jié)果表明它們腸道中存在一群與熱源體相關(guān)的古菌，這群古菌實(shí)際上代表著產(chǎn)甲烷古菌的第七個(gè)目“Methanoplasmatales”（在瘤胃中被稱為古菌C簇，簡稱RCC）。Jin等[46]利用16S rRNA基因克隆文庫證明了RCC古菌存在于厭氧真菌培養(yǎng)物中。16S rRNA基因序列分析法具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、效率高、費(fèi)用低等特點(diǎn)。因此，上述以16S rRNA基因?yàn)榛A(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)正日益成為微生物多樣性研究的重要手段，但這些技術(shù)亦存在局限性和偏差，如數(shù)據(jù)庫中部分序列數(shù)據(jù)不夠準(zhǔn)確，16S rRNA基因多拷貝和序列異質(zhì)性的問題，生態(tài)理論模型發(fā)展不足,實(shí)驗(yàn)操作存在諸多影響因素等，對結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)要充分考慮這些因素。雖然基于16S rRNA的微生物多樣性研究方法已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展，但以16S rRNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)并不能完全替代其他的微生物生態(tài)技術(shù)。綜合利用純種分離、電鏡鏡檢、生理生化指標(biāo)檢測、16S rRNA技術(shù)等方法，才能更客觀而全面地反映微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)信息，從而使我們對微生物群落有更深入的認(rèn)識。

除了以上列舉的技術(shù)，還有應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對瘤胃中RCC的分布進(jìn)行研究的報(bào)道[46]。綜上所述，由于RCC未能成功分離培養(yǎng)，因此當(dāng)前許多相關(guān)研究是采用16S rRNA等不依賴培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)和手段進(jìn)行。這類方法雖然進(jìn)一步推動(dòng)了RCC的研究，但是這類方法不以獲取RCC活體菌株為目的，導(dǎo)致我們無法準(zhǔn)確了解RCC活菌的生命活動(dòng)及其與瘤胃中其他微生物間相互作用的規(guī)律，進(jìn)而無法精準(zhǔn)調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵和減少甲烷排放。未來將分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相結(jié)合可能能更全面、真實(shí)地反映出RCC的各種生命活動(dòng)。

5 總結(jié)

RCC是調(diào)控反芻動(dòng)物甲烷產(chǎn)量的目標(biāo)甲烷菌之一，研究RCC古菌對減少甲烷排放具有重要意義。由于RCC極難分離純化，當(dāng)前人們對其了解甚少。導(dǎo)致其難培養(yǎng)的原因有多種，可能是目前培養(yǎng)技術(shù)的限制，也可能是我們對其知之甚少，不了解其合適的生長繁殖條件。因此，RCC未來的研究方向可能是：深入探索它們的培養(yǎng)條件，逐步揭示其與其他瘤胃微生物間的關(guān)系，研究調(diào)控其甲烷生成過程的特定生物學(xué)機(jī)制。