呂南英，張昊，羅逍，范茁

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣州510006)

·基礎(chǔ)研究·

心肌肥厚大鼠心肌細胞KATP對開放劑敏感性的變化

呂南英，張昊，羅逍，范茁

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣州510006)

目的 探討ATP敏感性鉀通道(KATP)在異丙腎上腺素(Iso)誘導的心肌肥厚中對開放劑敏感性的變化。方法 急性分離SD大鼠心肌細胞，隨機分為正常組、肥大組。正常組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，不做其他干預；肥大組以5 μmol/L的Iso處理24 h，成功誘導了心肌肥大模型。采用全細胞膜片鉗記錄兩組開放劑吡那地爾誘發(fā)的心肌細胞膜KATP(sarcKATP)電流密度，采用激光共聚焦顯微鏡記錄兩組開放劑二氮嗪誘發(fā)的心肌細胞線粒體黃素熒光蛋白的熒光強度間接檢測線粒體KATP(mitoKATP)敏感性變化。結(jié)果 正常組心肌細胞和肥大組心肌細胞sarcKATP的電流密度分別為(2.98±0.35)、(6.32±1.00)pA/pF，線粒體黃素熒光蛋白的熒光強度分別為(40.10±2.26)%、(21.88±0.17)%；兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均< 0.05)。結(jié)論 心肌肥厚時sarcKATP對吡那地爾的敏感性增強，mitoKATP對二氮嗪敏感性減弱。

心肌細胞；心肌肥厚；ATP敏感性鉀通道；大鼠

ATP敏感性鉀通道(KATP)按其分布的部位分為兩類：分布于細胞膜上的KATP (sarcKATP)和分布于線粒體膜的KATP (mitoKATP)。KATP受細胞內(nèi)ATP濃度調(diào)節(jié)，當ATP濃度下降時通道開放，反之通道開放被抑制。研究表明KATP的開放是應對缺血、缺氧、心肌肥厚等各種代謝狀態(tài)改變壓力下的內(nèi)源性保護機制。sarcKATP和mitoKATP通過不同的機制參與缺血再灌注損傷的心肌保護作用[1]；mitoKATP的開放劑二氮嗪能夠抑制大鼠心肌細胞去氧腎上腺素引起的心肌肥厚[2]；離心型心肌肥厚sarcKATP對開放劑克羅卡林的敏感性降低[3]以及心肌肥厚代謝壓力下KATP的活化受損[4]。2016年3～11月本研究利用膜片鉗全細胞模式記錄sarcKATP電流、激光共聚焦顯微鏡記錄線粒體黃素熒光蛋白的熒光強度，分別觀察肥大心肌細胞sarcKATP和mitoKATP對吡那地爾和二氮嗪的敏感性。

1 材料與方法

1.1 主要材料 酶Ⅰ：Tyrodes、0.8 mg/mLⅡ型膠原酶、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、50 μmol/L CaCl2。酶Ⅱ：Tyrodes、0.8 mg/mLⅡ型膠原酶、0.1 mg/mL蛋白酶、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、200 μmol/L CaCl2。酶Ⅲ：Tyrodes、0.8 mg/mLⅡ型膠原酶、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、600 μmol/L CaCl2。Buffer B：Tyrodes、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、1 mmol/L CaCl2。KATP外液：NaCl 137 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、CaCl21 mmol/L、NaH2PO41.2 mmol/L、HEPES 20 mmol/L、glucose 10 mmol/L。KATP外液中加入硝苯地平(10 μmol/L) 和色原烷醇B(10 μmol/L)分別阻斷鈣電流和內(nèi)向整流鉀電流，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.30～7.40。KATP內(nèi)液：KCl 140 mmol/L，MgCl22 mmol/L，CaCl21 mmol/L，EGTA 11 mmol/L，Na2ATP 1 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.20。另有異丙腎上腺素(Iso)、戊巴比妥鈉、肝素、吡那地爾、二氮嗪(Sigma，美國)、二硝基苯酚(Sigma，美國)等。

1.2 心肌細胞急性分離及心肌肥厚細胞模型制作 取大鼠26只，用5%的戊巴比妥鈉、肝素(1000 U/kg)腹腔注射后，以75%的乙醇對胸部皮膚進行消毒。迅速開腔取出心臟放在4 ℃預冷的無鈣臺式液沖洗后將心臟主動脈插于灌流裝置上并逆行灌流無鈣臺式液體3～5 min，改用酶Ⅰ消化2 min，再改用酶Ⅱ循環(huán)消化25 min左右，待心臟變軟時于酶Ⅲ中剪碎，于37 ℃水浴鍋震蕩消化3 min，再于200目金屬篩網(wǎng)過濾，細胞濾液500 r/min離心1 min，所得細胞置于bufferB中沉降。在用層粘連蛋白處理過的培養(yǎng)皿中加入分離的大鼠心肌細胞和M199培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，待細胞貼壁后隨機分為正常組和肥大組。正常組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，不做其他干預。肥大組以5 μmol/L的Iso處理24 h，檢測心肌細胞面積以及膜電容顯著增大，ANP、BNP mRNA表達顯著升高，與正常組比較有統(tǒng)計學差異，表明成功建立心肌肥厚細胞模型。

1.3 細胞sarcKATP對開放劑吡那地爾的敏感性檢測 在全細胞記錄模式下，用膜片鉗放大器(HEKA，Lambrecht，德國)記錄KATP電流，采樣頻率為10 kHz。貼有心肌細胞的玻片放于倒置顯微鏡(Nikon，日本)載物臺上的浴槽中，玻璃微電極用電極拉制儀(Sutter，Novato，CA)分五步拉制，電極電阻為2～5 MΩ，浴槽中加入1 mL KATP細胞外液。KATP的刺激程序為：鉗制電壓為-40 mV，刺激脈沖電壓為0 mV，持續(xù)時間均為500 ms，每隔30 s記錄一次由KATP開放劑吡那地爾(100 μmol/L)誘發(fā)的sarcKATP電流密度。

1.4 細胞mitoKATP對開放劑二氮嗪的敏感性檢測 mitoKATP開放會引起由質(zhì)子泵維持的線粒體膜電位降低，加速呼吸鏈的電子傳遞從而引起線粒體氧化。線粒體的氧化還原狀態(tài)間接通過線粒體內(nèi)的黃素熒光蛋白的熒光值來表示[5]。暴露在二硝基苯酚的線粒體會引起ATP合成呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體電勢消失，導致線粒體的最大氧化。因此二氮嗪作用肥大細胞后，mitoKATP變化后線粒體內(nèi)的黃素熒光蛋白熒光強度以二硝基苯酚的熒光值的百分數(shù)表示[6]。以二氮嗪(300 μmol/L)孵育肥大心肌細胞15 min，激光共聚焦顯微鏡(ZEISS,德國)拍攝黃素熒光成像，測定線粒體內(nèi)黃素熒光蛋白熒光值。最大激發(fā)波長為488 nm，最大接收波長為530 nm。用時間序列模式每隔10 s掃描一次，實驗溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為3%。

2 結(jié)果

2.1 心肌肥厚時sarcKATP對吡那地爾的敏感性變化 正常組心肌細胞和肥大組心肌細胞sarcKATP沒有開放劑時都不開放。灌流KATP開放劑吡那地爾(100 μmol/L)后誘發(fā)出了sarcKATP電流。正常組、肥大組的sarcKATP電流密度分別為(2.98 ± 0.35)、(6.32± 1.00)pA/pF，肥大組的sarcKATP電流密度較正常組升高(P<0.05)。

2.2 心肌肥厚時mitoKATP對二氮嗪的敏感性變化 正常細胞和肥大心肌細胞mitoKATP在沒有開放劑時都不開放。灌流KATP開放劑二氮嗪(300 μmol/L)后，正常組心肌細胞和肥大組心肌細胞黃素熒光蛋白熒光強度分別為(40.10±2.26)%、(21.88±0.17)%，肥大組黃素熒光蛋白熒光強度較正常組降低(P<0.05)。

3 討論

心肌肥厚是心肌應對各種刺激的一種適應性反應，心肌肥厚導致的心率失常和心肌重構(gòu)是心肌肥厚致死的重要因素。很多研究表明，心肌肥厚過程中鉀離子通道的活動是引起電生理重塑和心率失常的最重要的因素。KATP是一種內(nèi)向整流式鉀通道，主要受ATP濃度調(diào)節(jié)，在生理條件下細胞內(nèi)ATP的濃度為3～4 mmol/L，KATP處于基本關(guān)閉的狀態(tài)，當細胞缺血等病理狀態(tài)下細胞內(nèi)ATP的濃度低于0.2 mmol/L時，sarcKATP會開放從而產(chǎn)生心肌保護作用[7]。近年來研究表明，KATP開放劑在許多動物品種上證明起到非常重要的心臟保護作用，KATP開放劑廣泛應用于心率失常、心肌缺血、心肌肥厚等各個領(lǐng)域。KATP開放劑吡那地爾可能通過p70S6激酶依賴性的信號通路緩解心肌肥厚[8]；二氮嗪通過開放mitoKATP對去氧腎上腺素誘導的大鼠心肌肥厚具有保護作用[2]。心肌肥厚時KATP的開放起到了重要的心肌保護作用，因此，進一步研究心肌肥厚中KATP的特性以及潛在的機制具有重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常細胞和肥大心肌細胞sarcKATP和mitoKATP在沒有相應開放劑時不開放，當灌流吡那地爾(100 μmol/L)時，sarcKATP打開，心肌肥大組的IKATP電流密度顯著性升高，說明肥大心肌細胞sarcKATP對開放劑吡那地爾的敏感性增強；當二氮嗪(300 μmol/L)孵育15 min后，mitoKATP開放，心肌肥大組的二氮嗪誘發(fā)黃素熒光蛋白的熒光強度顯著性降低，說明肥大心肌細胞對二氮嗪的敏感性減弱。

研究表明，蛋白激酶C(PKC)可能通過降低通道對ATP抑制位點的敏感性增加sarcKATP活性，蛋白激酶AC(PKA)可能通過降鈣素相關(guān)基因肽、腺苷、環(huán)前列腺素和β腎上腺受體激動劑調(diào)節(jié)sarcKATP活性[9]。心肌肥大時sarcKATP對開放劑的敏感性增強，這可能是與心肌肥大時PKA、PKC的激活有關(guān)。Alvin等[3]研究表明體積超載所致的離心型心肌肥厚降低了sarcKATP對開放劑克羅卡林的敏感性，而本研究采用Iso通過β-AR系統(tǒng)誘導心肌肥厚，肥大心肌細胞sarcKATP對開放劑吡那地爾的敏感性增強，這可能與肥大細胞類型不同有關(guān)。一氧化氮(NO)供體能夠通過cGMP信號通路增強mitoKATP開放劑二氮嗪的作用，且PKC活性對二氮嗪開放mitoKATP沒有影響，代謝抑制時mitoKATP對阻斷劑5-HD的敏感性降低[10]。cGMP是心血管系統(tǒng)生理和病理進程中的一個重要調(diào)節(jié)器，生理條件下心肌細胞cGMP主要來源NO激活的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，心肌細胞cGMP主要由蛋白激酶G(PKG)調(diào)節(jié)，研究表明cGMP信號通路在各種心血管疾病中受抑制。mitoKATP對二氮嗪的敏感性降低可能是心肌肥厚時cGMP受抑制導致的。

綜上所述，心肌肥厚時，sarcKATP對吡那地爾的敏感性增強，其機制可能與心肌肥厚時PKA/PKC信號通路激活有關(guān)。心肌肥厚時，mitoKATP對二氮嗪的敏感性降低，其機制可能與心肌肥厚時PKG信號通路受抑制有關(guān)。

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國家自然科學基金資助項目(31300940)，中央高?；究蒲袠I(yè)務費(2015ZM165)。

范茁(E-mail: fanzhuo@scut.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.009

R542.2

A

1002-266X(2017)17-0028-03

2016-12-03)