文德重，周敏，薛松，黃日太

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海200127)

不同濃度依達(dá)拉奉對(duì)低氧環(huán)境下c-kit+心臟干細(xì)胞的影響

文德重，周敏，薛松，黃日太

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海200127)

目的 觀察不同濃度的依達(dá)拉奉對(duì)于低氧環(huán)境下c-kit+心臟干細(xì)胞 (CSCs)的影響。方法 體外灌注酶解成年小鼠心臟，磁珠分選c-kit+CSCs，流式細(xì)胞儀和免疫熒光染色分別檢測(cè)分選后干細(xì)胞純度和表型。將c-kit+CSCs培養(yǎng)基中加入不同濃度依達(dá)拉奉(0、100、300、500、700、1 000 μmol/L)，在1%氧條件下分別通過免疫熒光顯微鏡下DFCH-DA檢測(cè)細(xì)胞活性氧(ROS)生產(chǎn)量、流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率、Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力、RT-PCR檢測(cè)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)mRNA表達(dá)。結(jié)果 依達(dá)拉奉濃度為1 000 μmol/L時(shí)所產(chǎn)生的ROS量最少,與其他濃度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。依達(dá)拉奉濃度為1 000 μmol/L時(shí)細(xì)胞凋亡率最低,與0、100 μmol/L濃度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。依達(dá)拉奉濃度為700 μmol/L時(shí)c-kit+CSCs遷移數(shù)最大,與0 μmol/L比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。依達(dá)拉奉濃度為700 μmol/L時(shí)，c-kit+CSCs bFGF mRNA表達(dá)最高(P均<0.05)。結(jié)論 依達(dá)拉奉通過影響細(xì)胞的凋亡率、遷移率、ROS生成和bFGF mRNA的表達(dá)對(duì)c-kit+CSCs發(fā)揮保護(hù)作用，且在一定濃度范圍內(nèi)存在劑量依賴性。

心臟干細(xì)胞；依達(dá)拉奉；活性氧；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞遷移；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

心臟干細(xì)胞(CSCs)移植為心肌梗死后心功能損傷的治療帶來了希望，目前已成為再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。但是有研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植后的存活率不超過10%，不足以修復(fù)壞死的心肌組織[1, 2]。主要是因?yàn)橐浦驳母杉?xì)胞處于缺血缺氧環(huán)境下，細(xì)胞氧化應(yīng)激過度，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。依達(dá)拉奉是一種新型的氧自由基清除劑，已廣泛應(yīng)用于急性腦缺氧性疾病。研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉能夠清除心肌缺血再灌注后產(chǎn)生的自由基，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌具有一定的保護(hù)作用[3, 4]。但是，依達(dá)拉奉對(duì)于低氧下c-kit+CSCs的影響國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少。2016年4～11月，本文就不同濃度的依達(dá)拉奉對(duì)低氧條件下c-kit+CSCs活性氧(ROS)生成、凋亡率、遷移能力和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)表達(dá)的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF 級(jí)C57雄性小鼠， 6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。胎牛血清(FBS)、Ⅱ型膠原酶、DMEM-F12培養(yǎng)基、N2、B27、胰蛋白酶、白血病抑制因子(LIF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、bFGF、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)、小鼠c-kit磁珠、CD45 磁珠、抗c-kit免疫熒光抗體、抗鼠c-kit PE流式抗體、PE Annexin V凋亡試劑盒、0.5%結(jié)晶紫、Transwell小室、DFCH-DA、依達(dá)拉奉、RNA 抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

1.2 CSCs分離、分選及純度檢測(cè) 成年C57小鼠腹腔注射肝素100 IU，10 min麻醉后無菌條件打開胸腔，小心分離心臟，盡快將心臟懸掛于無菌心臟灌注裝置，6-0絲線固定。用氧飽和的含0.1% Ⅱ型膠原酶的心肌消化液37 ℃灌注10 min，流量控制為4 mL/min。當(dāng)心臟變白變軟停止灌注，并將心臟轉(zhuǎn)移至含預(yù)冷2%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，小心吹打，將心肌組織解離成單個(gè)細(xì)胞。40 μm濾網(wǎng)過濾，300 g離心1 min去除心肌細(xì)胞，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，再330 g離心7 min去除上清。細(xì)胞重懸于100 μL的PBS緩沖液中，加入5μL CD117 PE Labeling Reagent，常溫避光孵育15 min。加入7 μL PE Selection Cocktail，混勻后常溫避光孵育15 min。加入5 μL磁珠，吹打混勻，避光孵育10 min。加入2 mL 的PBS緩沖液混勻，并將流式管放于磁鐵中靜置5 min后，緩慢棄去上清液，重復(fù)4～5次。將分選的細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM-F12，內(nèi)含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10 ng/mL LIF、10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、1% ITS、1% B27、0.5% N2。分選后含有CD117 PE標(biāo)記的CSCs重懸于100 μL的PBS緩沖液中，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)c-kit+CSCs純度達(dá)到89.3%；免疫熒光染色顯示細(xì)胞已經(jīng)貼壁，大部分細(xì)胞為c-kit+CSCs。

1.3 不同濃度依達(dá)拉奉作用后c-kit+CSCs ROS生成檢測(cè) 將培養(yǎng)的CSCs接種于24孔板中，每孔0.5×105個(gè)細(xì)胞，貼壁24 h。用含20 μmol/L DCFH-DA的培養(yǎng)基37 ℃避光孵育30 min后棄去，更換為含不同濃度依達(dá)拉奉(0、100、300、500、700、1 000 μmol/L)的細(xì)胞完全培養(yǎng)基，在37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)8 h。取出細(xì)胞，PBS 洗滌3次，免疫熒光顯微鏡488 nm波長(zhǎng)下曝光1 s拍照。DFCH-DA在細(xì)胞中可被酯酶去乙酰基而變成沒有熒光的DFCH，DFCH可以與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS結(jié)合，生成有綠色熒光的DFC。綠色熒光細(xì)胞數(shù)與ROS的生成呈正相關(guān)，以綠色熒光細(xì)胞數(shù)表示ROS生成數(shù)量。

1.4 不同濃度依達(dá)拉奉作用后c-kit+CSCs凋亡率檢測(cè) 將培養(yǎng)的CSCs接種于24孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，貼壁24 h后，將培養(yǎng)基更換為含不同濃度依達(dá)拉奉(0、100、300、500、700、1 000 μmol/L)的無血清DMEM-F12培養(yǎng)基中，在37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，重懸于50 μL的結(jié)合液中，并加入2.5 μL的PE Annexin V和2.5 μL的7-AAD染色液。另設(shè)3管對(duì)照，分別為空白細(xì)胞管、僅加2.5 μL PE Annexin V 細(xì)胞管和僅加2.5 μL 7-AAD細(xì)胞管?；靹颍覝乇芄夥跤?5 min，加入150 μL的結(jié)合液，混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 不同濃度依達(dá)拉奉作用后c-kit+CSCs遷移能力檢測(cè) 培養(yǎng)的CSCs用無血清的DMEM-F12培養(yǎng)基饑餓12 h。胰酶消化，加入10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中和，1 000 r/min離心5 min。重懸細(xì)胞于無血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105個(gè)/mL。吸取細(xì)胞200 μL，加入到8 μm的Transwell 小室上層。下層加入500 μL含不同濃度依達(dá)拉奉(0、100、300、500、700、1 000 μmol/L)10% FBS 的DMEM-F12培養(yǎng)基中，在37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)8 h。4%的多聚甲醛固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染色30 min。用棉簽將Transwell上層細(xì)胞擦去，顯微鏡下觀察拍照。

1.6 不同濃度依達(dá)拉奉作用后c-kit+CSCs bFGF檢測(cè) 將培養(yǎng)的CSCs接種于24孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，貼壁24 h。更換為含不同濃度的依達(dá)拉奉(0、100、300、500、700、1 000 μmol/L)的無血清DMEM-F12培養(yǎng)基中，在37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h。利用小劑量RNA 抽提試劑盒提取出總RNA，260/280 nm 吸光度用來判斷RNA 的質(zhì)量?？俁NA(0.5 μg)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。之后使用bFGF引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。樣品電泳完畢后，將凝膠放入ChemiDoc MP 凝膠成像系統(tǒng)( Bio-Rad 公司，美國(guó)) 觀察拍照，然后使用ImageLab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度依達(dá)拉奉對(duì)c-kit+CSCs ROS生成的影響 依達(dá)拉奉可以減少低氧下c-kit+CSCs ROS的生成。依達(dá)拉奉濃度為0、100、300、500、700、1 000 μmol/L時(shí)，綠色熒光細(xì)胞數(shù)分別為(81±8)、(56±6)、(45±4)、(27±2)、(22±2)、(13±1)個(gè)。依達(dá)拉奉濃度為1 000 μmol/L時(shí)所產(chǎn)生的ROS量與其他濃度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。依達(dá)拉奉濃度700 μmol/L與500 μmol/L比較，ROS生產(chǎn)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 不同濃度依達(dá)拉奉對(duì)c-kit+CSCs凋亡率的影響 依達(dá)拉奉可以降低細(xì)胞凋亡率。依達(dá)拉奉濃度為0、100、300、500、700、1 000 μmol/L時(shí)，c-kit+CSCs凋亡率分別為(44.6±4.70)%、(36.93±7.81)%、(31.43±5.01)%、(28.57±3.25)%、(28.8±1.75)%、(25.13±2.40)%。依達(dá)拉奉濃度為1 000 μmol/L時(shí)細(xì)胞凋亡率與0、100 μmol/L濃度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。300～1 000 μmol /L濃度之間細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

2.3 不同濃度依達(dá)拉奉對(duì)c-kit+CSCs遷移能力的影響 在低氧環(huán)境中，依達(dá)拉奉處理可以明顯促進(jìn)CSCs的遷移能力。依達(dá)拉奉濃度為0、100、300、500、700、1 000 μmol/L時(shí)， c-kit+CSCs遷移數(shù)分別為(93.3±6.6)、(97.3±4.5)、(120.3±8.3)、(128.0±6.2)、(139.3±2.9)、(138.0±7.9)個(gè)。依達(dá)拉奉濃度為700 μmol/L時(shí)c-kit+CSCs遷移數(shù)與0 μmol/L比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。700 μmol/L與1 000 μmol/L、100 μmol/L與0 μmol/L比較，c-kit+CSCs遷移數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

2.4 不同濃度依達(dá)拉奉對(duì)c-kit+CSCs bFGF表達(dá)的影響 依達(dá)拉奉可顯著促進(jìn)c-kit+CSCs bFGF的表達(dá)。依達(dá)拉奉濃度為0、100、300、500、700、1 000 μmol/L時(shí)，c-kit+CSCs bFGF mRNA 表達(dá)分別為0.59±0.05、1.21±0.03、1.32±0.09、1.46±0.17、1.74±0.09、0.87±0.05。依達(dá)拉奉濃度為700 μmol/L時(shí)，c-kit+CSCs bFGF mRNA表達(dá)最高(P均<0.05)。100～500 μmol /L濃度之間c-kit+CSCs bFGF mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

3 討論

CSCs是一類存在于自體心肌組織中的干細(xì)胞，可以向心肌、血管平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。研究發(fā)現(xiàn)，c-kit+CSCs移植后可通過細(xì)胞分化、新生血管形成、旁分泌等途徑改善心肌梗死后心功能，成為干細(xì)胞移植的研究熱點(diǎn)[5, 6]。但是移植到體內(nèi)的干細(xì)胞長(zhǎng)期存活率較低，并不能持續(xù)改善心功能。

依達(dá)拉奉具有較好的細(xì)胞保護(hù)作用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心血管疾病基礎(chǔ)和臨床研究[7, 8]。但是研究發(fā)現(xiàn)，在不同情況下依達(dá)拉奉表現(xiàn)出不同的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。張?zhí)@玲等[9]研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞，可顯著減少氯化鈷誘導(dǎo)的ROS 生成，還能通過維持線粒體膜電位的穩(wěn)定性起到保護(hù)作用。Sukmawan等[10]研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉可通過提高細(xì)胞一氧化氮水平和降低ROS的產(chǎn)生，保護(hù)犬缺血再灌注冠脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，減輕冠脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。Hassan 等[11]研究顯示，在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌梗死大鼠中，依達(dá)拉奉預(yù)處理可通過減少氧化應(yīng)激、維持細(xì)胞膜的完整性、抗凋亡、抗炎癥等途徑，調(diào)節(jié)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)功能。劉品剛等[12]研究認(rèn)為，依達(dá)拉奉是通過降低心肌半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3及炎癥因子TNF-α、IL-6 的表達(dá)，抑制炎癥誘導(dǎo)的凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。Tsujita 等[13]在對(duì)50例急性心肌梗死患者注射30 mg依達(dá)拉奉后發(fā)現(xiàn)可顯著改善灌注后心肌梗死面積，有效減少灌注心律失常的發(fā)生。蔡志福等[14]研究結(jié)果顯示，在心臟直視手術(shù)中，依達(dá)拉奉可以減少血清中的丙二醛含量，降低心肌酶漏出量，提高心肌細(xì)胞SOD的活性，減輕心肌細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，不同濃度依達(dá)拉奉處理都可以降低低氧環(huán)境下c-kit+CSCs ROS的含量。且隨著依達(dá)拉奉濃度的增加，ROS的含量逐漸減少；當(dāng)濃度為1 000 μmol/L時(shí)，ROS的含量達(dá)到最小值。在晚期凋亡率方面，當(dāng)依達(dá)拉奉濃度在300～1 000 μmol/L時(shí)，雖然隨著濃度增加細(xì)胞凋亡率逐漸下降，但這種下降的幅度越來越小。依達(dá)拉奉處理可以促進(jìn)低氧環(huán)境下c-kit+CSCs的遷移和bFGF的生成。濃度為100～700 μmol/L時(shí)，隨著濃度的增加，遷移細(xì)胞數(shù)逐漸增加，在700 μmol/L濃度時(shí)達(dá)到最高，但當(dāng)濃度達(dá)到1 000 μmol/L時(shí)，遷移率不再增加。依達(dá)拉奉濃度在100～700 μmol/L之間，c-kit+CSCs bFGF mRNA表達(dá)量逐漸升高。這一結(jié)果與其他研究結(jié)果相似[15]。

綜上所述，依達(dá)拉奉對(duì)低氧環(huán)境下c-kit+CSCs損傷具有較好的保護(hù)作用，且在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)c-kit+CSCs的影響具有劑量依賴性。但是，當(dāng)c-kit+CSCs移植到心梗環(huán)境中依達(dá)拉奉的這種保護(hù)作用是否仍然存在還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Effects of different concentrations of edaravone on c-kit+cardiac stem cells under hypoxic conditions

WENDezhong,ZHOUMin,XUESong,HUANGRitai

(RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200127,China)

Objective To observe the effects of different concentrations of edaravone on c-kit+cardiac stem cells (CSCs) under hypoxic conditions. Methods The freshly isolated hearts were perfused with collagenase buffer, and the hearts were dissected into single cells, c-kit+cells were purified from the cells by immunomagnetic beads. Flow cytometric analysis was used to measure the purity of c-kit+cells, immunofluorescence was used to analyze the phenotype. For further study, c-kit+CSCs were treated with different concentrations of edaravone (0, 100, 300, 500, 700, 1 000 μmol/L), and then were divided into six groups. The reactive oxygen species (ROS) production was measured by DFCH-DA, apoptosis rate was analyzed by flow cytometer, cell migration was measured by 8-mm pore-size Transwell migration chamber, and the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) mRNA was determined by RT-PCR. Results The ROS production in the 1 000 μmol/L edavarone group was significantly decreased as compared with that of the other groups (allP<0.05). The apoptosis rate in the 1 000 μmol/L edavarone group was the lowest, and significant difference was found as compared with that in the 0 and 100 μmol/L edavarone groups (allP<0.05). The migration of c-kit+CSCs was the highest when edavarone concentration was 700 μmol/L, and significant difference was found as compared with that of the 0 μmol/L. When the concentration of edavarone was 700 μmol/L, the expression of bFGF mRNA in c-kit+CSCs was the highest (allP<0.05).Conclusion Edaravone has the protective effect on c-kit+CSCs by influencing the apoptosis rate, migration rate, ROS production and bFGF mRNA expression with a dose-dependent manner to some extent.

cardiac stem cells; edaravone; reactive oxygen species; apoptosis; cell migration; fibroblast growth factors

上海市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(134119a5602)。

文德重(1990-)，男，在讀碩士，主要研究方向?yàn)榉款澋陌l(fā)生機(jī)制。E-mail：wendezhongwencong@163.com

黃日太(1970-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，主要研究方向?yàn)榉款澋陌l(fā)生機(jī)制。E-mail: ahtai1018@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.004

R542.2

A

1002-266X(2017)17-0010-04

2016-12-05)