馬振凱，李夢楠，白宏英

(鄭州大學第二附屬醫(yī)院，鄭州450014)

姜黃素對PD模型細胞活性氧簇水平及沉默信息調(diào)控因子3表達的影響

馬振凱，李夢楠，白宏英

(鄭州大學第二附屬醫(yī)院，鄭州450014)

目的探討姜黃素對魚藤酮誘導的帕金森病(PD)模型SH-SY5Y細胞活性氧簇(ROS)水平及沉默信息調(diào)控因子3(Sirt3)表達的影響，為PD的臨床治療提供依據(jù)。方法將體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞分為姜黃素1組、姜黃素2組、姜黃素3組、姜黃素4組、模型組和對照組。姜黃素1、2、3、4組先分別加入0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L的姜黃素培養(yǎng)4 h，然后加入0.1 μmol/L魚藤酮共同培養(yǎng)24 h；模型組直接加入0.1 μmol/L魚藤酮培養(yǎng)24 h；對照組培養(yǎng)基內(nèi)不加任何藥物培養(yǎng)24 h。采用 DCFH-DA染色法檢測各組ROS水平，RT-PCR法測定Sirt3 mRNA相對表達量，Western blotting法測定Sirt3蛋白相對表達量。結(jié)果ROS水平：模型組高于對照組(P<0.05)，姜黃素2組<姜黃素1組<模型組(P均<0.05)，但姜黃素3組、姜黃素4組、模型組兩兩比較P均>0.05。Sirt3 mRNA和蛋白相對表達量：模型組低于對照組(P均<0.05)，姜黃素2組>姜黃素1組>模型組(P均<0.05)，但姜黃素3組、姜黃素4組、模型組兩兩比較P均>0.05。結(jié)論姜黃素可降低SH-SY5Y細胞ROS水平，上調(diào)Sirt3表達；此作用姜黃素濃度為1.0 μmol/L時最為明顯。

帕金森??；姜黃素；SH-SY5Y細胞；魚藤酮；活性氧簇；沉默信息調(diào)控因子3

帕金森病(PD)是老年常見神經(jīng)變性疾病。氧化應激導致的活性氧簇(ROS)過度生成引起多巴胺神經(jīng)元凋亡可能是PD發(fā)生的重要原因[1～3]。研究發(fā)現(xiàn)，沉默信息調(diào)控因子3(Sirt3)能使線粒體內(nèi)相關(guān)的乙酰化蛋白脫乙?；?，通過增加 ROS清除酶活性和穩(wěn)定線粒體功能抑制線粒體內(nèi) ROS的蓄積[4,5]。姜黃素是從姜黃中分離出的多酚化合物。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，預先應用姜黃素對魚藤酮誘導的PD模型細胞有保護作用，我們推測這種保護作用可能與氧化應激有關(guān)。為驗證這一推測，2015年10月～2016年5月本研究觀察了姜黃素對魚藤酮誘導的PD模型SH-SY5Y細胞ROS水平及Sirt3表達的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞株為本實驗室自行傳代。姜黃素、魚藤酮購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司，胰蛋白酶、DMEM-H培養(yǎng)基、PBS購自美國HyClone公司，小牛血清購自美國GEMINI公司，抗Sirt3一抗購自美國Santa Cruz公司，HRP標記羊抗兔二抗購自美國Zymed公司，DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Ⅰ RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 細胞分組干預及PD模型細胞的制作 SH-SY5Y細胞置于含15%小牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2RT-PCR培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，傳代。取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×105個/mL,接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后分為姜黃素1組、姜黃素2組、姜黃素3組、姜黃素4組、模型組和對照組。姜黃素1、2、3、4組細胞先加入0.1 μmol/L魚藤酮共同培養(yǎng)24 h，再向各組加入不同濃度的姜黃素使其終濃度分別達到0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L；模型組直接加入0.1 μmol/L魚藤酮培養(yǎng)24 h。對照組培養(yǎng)基內(nèi)不加任何藥物培養(yǎng)24 h。

1.3 細胞ROS水平檢測 采用DCFH-DA染色法和流式細胞術(shù)。收集各組細胞于15 mL錐形離心管內(nèi)，4 ℃、1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入預冷的PBS 1 mL后移入5 mL EP管中再次離心，去上清液后加入1 mL GENMED 染色工作液吹打均勻后37 ℃溫水浴中避光孵育20 min，500 r/min離心5 min加入GENMED保存液置于冰槽內(nèi)，采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞ROS水平。各組結(jié)果均以平均熒光強度表示。

1.4 細胞Sirt3 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。先用TRIzol法提取各組細胞總RNA。取總RNA 1 μg按照TaKaRa公司cDNA合成試劑盒說明書操作在普通PCR儀上反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，降溫到4 ℃，于-20 ℃保存。用相應的PCR引物在ABI7500 fast system 定量PCR儀器上進行熒光定量PCR。20 μL的PCR反應體系組成如下：cDNA模板2 μL，SYBR(2×)10 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，上下游引物各0.5 μL，無RNA酶水補至20 μL。每組設置3個復孔，并分別設置陰性對照。內(nèi)參基因GAPDH上游引物為5′-ACTCCTCCACCTTTGACGC- 3′，下游引物為5′-GCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′；SIRT3上游引物為5′-CCCGACTGCTCATCAACC-3′，下游引物為5′-CAGCCCAGAAGCTCCACTA-3′。反應條件:95 ℃ 10 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 25 s；循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT法計算Sirt3 mRNA相對表達量。

1.5 細胞Sirt3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞并提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度定量試劑盒測定蛋白濃度后調(diào)整每孔蛋白量為30 μg，按相應比例將其與上樣緩沖液混勻后100 ℃變性5 min，行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST封閉，一抗(稀釋比例1∶800)4 ℃孵育過夜，用TBST液洗膜4次×5 min，二抗(稀釋比例1∶1 000)室溫下孵育2 h，TBST洗膜5 min×4次后于暗室進行ECL顯影，Quantity One圖像分析軟件檢測Sirt3蛋白條帶的積分光密度值，即相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組ROS水平比較 姜黃素1組、姜黃素2組、姜黃素3組、姜黃素4組、模型組、對照組ROS水平分別為172.13±33.71、74.54±7.99、228.63±22.40、233.52±15.33、239.79±35.32、40.28±7.75。ROS水平模型組高于對照組(P<0.05)，姜黃素2組<姜黃素1組<模型組(P均<0.05)，但姜黃素3組、姜黃素4組、模型組兩兩比較P均>0.05。

2.2 各組Sirt3 mRNA相對表達量比較 姜黃素1組、姜黃素2組、姜黃素3組、姜黃素4組、模型組、對照組Sirt3 mRNA相對表達量分別為5.07 ±0.30、6.62±0.71、1.76±0.32、1.87±0.40、2.17±0.15、7.45±0.34。Sirt3 mRNA相對表達量模型組低于對照組(P<0.05)，姜黃素2組>姜黃素1組>模型組(P均<0.05)，但姜黃素3組、姜黃素4組、模型組相比P均>0.05。

2.3 各組Sirt3蛋白相對表達量比較 姜黃素1組、姜黃素2組、姜黃素3組、姜黃素4組、模型組、對照組Sirt3蛋白相對表達量分別為0.43±0.05、0.75±0.09、0.17±0.14、 0.17±0.08、0.14±0.03、0.25±0.05。Sirt3蛋白相對表達量模型組低于對照組(P<0.05)，姜黃素2組>姜黃素1組>模型組(P均<0.05)，但姜黃素3組、姜黃素4組、模型組兩兩比較P均>0.05。

3 討論

PD的發(fā)病機制包括氧化應激、線粒體功能障礙、泛素-蛋白酶體功能障礙、包涵體形成等,最終導致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元喪失而發(fā)病[8]。Jung 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，具有呼吸功能的PD細胞ROS過量產(chǎn)生；何建成等[9]發(fā)現(xiàn)，PD大鼠模型腦組織中清除自由基的相關(guān)酶，如過氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等含量明顯降低，表明PD模型大鼠清除氧自由基的能力降低，ROS在組織細胞內(nèi)蓄積而誘發(fā)PD。氧化應激導致的神經(jīng)元凋亡在PD的發(fā)病過程中起重要作用[10，11]。目前對抗氧化應激已成為治療PD的重要方法之一。魚藤酮可選擇性抑制線粒體復合物Ⅰ, 誘發(fā)ROS的過度生成，而ROS通過導致蛋白質(zhì)變性、改變線粒體膜電位、導致Ca2+失調(diào)等一系列途徑介導細胞凋亡。

姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚性色素，是姜黃的重要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等廣泛的藥理作用[12]。已有實驗證實姜黃素對魚藤酮誘導的PC12細胞有保護作用[13]。但其對魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞是否具有保護作用及其機制尚未見有關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，模型組ROS水平明顯升高，而0.5、1.0 μmol/L姜黃素可明顯拮抗魚藤酮誘導的細胞損傷，顯著降低細胞內(nèi)ROS水平，清除部分氧自由基；但姜黃素濃度超過1.0 μmol/L后細胞內(nèi)ROS水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。崔群力等[14]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素濃度過高時并不能起到保護作用，可能是因為其濃度過高時本身可作為應激因素激活細胞內(nèi)一系列下游分子，如熱休克蛋白、α-突觸核蛋白等。當姜黃素濃度大于10 μmol/L時將會直接損傷細胞。

去乙?；窼irt3是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) 的Ⅲ類去乙?；?，屬于進化上高度保守的Sirtuin 家族成員之一[5]。Sirt3能通過其去乙?；せ畎被岽x[15]、脂肪酸代謝、三羧酸循環(huán)、氧化呼吸電子傳遞鏈等關(guān)鍵酶活性，代償性增強線粒體氧化呼吸功能，減少ROS的生成[16]；亦能提高氧自由基清除酶的活性，增強抗氧化系統(tǒng)的功能。如Sirt3可使乙?；腻i超氧化物歧化酶(Mn-SOD)脫乙?；?，增強Mn-SOD活性；對乙?；腎dh2脫乙?；?，提高NADPH水平[17]；提高線粒體中谷胱甘肽還原型/氧化型(GSH/GSSG)比例；對乙?；腇oxo3a脫乙?；?，提高依賴于Foxo3a的CAT mRNA表達水平[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組細胞Sirt3 mRNA和蛋白表達均明顯降低；0.5、1.0 μmol/L的姜黃素可提高模型組Sirt3表達水平，這可能與上述代償增強線粒體功能及增強抗氧化系統(tǒng)有關(guān)；而5.0、10.0 μmol/L姜黃素干預細胞，細胞Sirt3表達并沒有明顯升高，說明高濃度的姜黃素本身可作為一種應激源，對細胞線粒體產(chǎn)生直接損傷。

綜上所述，姜黃素可降低SH-SY5Y細胞ROS水平，上調(diào)Sirt3表達；1.0 μmol/L姜黃素的上述作用最為明顯。

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河南省科學技術(shù)廳基礎與前沿技術(shù)研究計劃項目(14230-0410461)。

白宏英(E-mail: hybai@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.014

R742.1

A

1002-266X(2017)40-0050-03

2016-09-22)