苗永輝，趙宗江，張新雪，吳阿敏

糖尿病腎病“腎痿”學(xué)說的建立與闡釋＊

苗永輝，趙宗江＊＊，張新雪，吳阿敏

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院北京100029）

糖尿病腎?。―iabetic Kidney Disease，DKD）是糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）嚴重的遠期并發(fā)癥和DM患者主要死因之一，嚴重威脅著人類健康。趙宗江教授首次提出了糖尿病腎病“腎痿”學(xué)說，并領(lǐng)導(dǎo)科研團隊長期致力于“腎痿”學(xué)說指導(dǎo)下的糖尿病腎病研究，取得了一定的成果，歸納起來講，主要在整體動物實驗和體外細胞實驗兩個方面，從藥效學(xué)、氧化應(yīng)激水平和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等角度進行深入研究。圍繞著減少細胞外基質(zhì)在腎小球系膜區(qū)以及腎小管間質(zhì)的沉積、抑制足細胞損傷、抑制足細胞凋亡、抑制和逆轉(zhuǎn)足細胞轉(zhuǎn)分化、抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化等科學(xué)問題，系統(tǒng)地闡明了糖尿病腎病“腎痿”學(xué)說的科學(xué)內(nèi)涵。本文主要對“腎痿”學(xué)說的提出和相關(guān)的研究成果進行歸納整理與總結(jié)，以期補充“臟痿”學(xué)說和發(fā)展中醫(yī)理論。

糖尿病腎病慢性腎臟疾病“腎痿”學(xué)說中醫(yī)理論

隨著社會的發(fā)展、人民生活節(jié)奏的加快和生活方式的轉(zhuǎn)變，DM的發(fā)病率急速上升，中國DM患病率約9.7%[1]。其中，20%-30%的患者發(fā)展為DKD[2]。DKD是DM病程中出現(xiàn)的并發(fā)癥之一，也是臨床引起慢性腎衰竭的主要腎臟疾病之一[3]。如何有效阻止病情進展，已成為世界范圍內(nèi)醫(yī)學(xué)研究的熱點和難點。近年來，趙宗江教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團隊長期致力于糖尿病腎病的科學(xué)研究，在糖尿病腎病的臨床與基礎(chǔ)研究領(lǐng)域做了大量的工作，積累了豐富的經(jīng)驗和豐碩的成果，特別是趙宗江教授創(chuàng)立的DKD“腎痿”學(xué)說和據(jù)此組方的糖腎平和糖腎寧，其相關(guān)的研究在DKD研究領(lǐng)域具有重要意義，本文對相關(guān)的研究成果進行整理、歸納和總結(jié)，以饗同道。

1 糖尿病腎病“腎痿”學(xué)說的提出

1.1 基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對糖尿病腎病的認識

糖尿病腎病的主要臨床表現(xiàn)為水腫和蛋白尿，發(fā)展到晚期為慢性腎衰竭，即腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。研究表明，糖、脂代謝紊亂、高血壓、血管活性物質(zhì)、生長因子與化學(xué)趨化因子、反應(yīng)氧中間產(chǎn)物的長期存在，會改變腎臟正常的結(jié)構(gòu)，影響腎臟的生理功能，這是DKD病情發(fā)生發(fā)展的基本因素。

Mogensen將Ⅰ型DM分為5期；而Ⅱ型DM由于病程復(fù)雜，其病理演變尚未完全闡明，臨床參考Ⅰ型DM的分期方法，將Ⅱ型DKD分為5期。

Ⅰ期：腎小球超濾過期（功能代償期），此期的特點是腎體積增大，腎小球高灌注、高濾過和腎小球高壓。診斷依據(jù)是腎小球濾過率（Glomerular Filtration Rate，GFR）≥150 mL·min-1。

Ⅱ期：正常白蛋白尿期（靜息期或間斷微量白蛋白尿期，腎小球損害期），尿白蛋白＜30 mg/天，尿白蛋白排除率與運動正相關(guān)，病情可逆。

Ⅲ期：微量白蛋白尿期（隱形DKD期，早期DKD期），尿蛋白30-300 mg/天，出現(xiàn)腎小球結(jié)節(jié)型和彌漫型病變和小動脈管壁的玻璃樣變，開始出現(xiàn)腎小球閉鎖為本期的特點。

Ⅳ期：大量白蛋白尿期，具有不可逆性，尿蛋白持續(xù)存在，尿白蛋白排泄率（Urinary Albumin ExcretionRates，UAER）≥200-300 μg·min-1（300-500 mg/天），尿蛋白＞0.5 g/天；常伴發(fā)腎病綜合征和眼底損害。

Ⅴ期：終末期腎衰竭期（ESRD），GFR嚴重下降＜10 mL·min-1，腎臟基膜增厚明顯，嚴重腎小球硬化，腎小球毛細血管腔進行性縮窄。血清Scr、BUN含量升高，可出現(xiàn)尿毒癥，高死亡率，需透析或腎移植手術(shù)來治療[4]。

總的來說，DKD時期腎小球的基本病理改變?yōu)槟I小球基膜增厚和系膜基質(zhì)增生，可出現(xiàn)結(jié)節(jié)性和彌漫性腎小球硬化等，使腎小球正常的濾過功能受到損害；腎小管上皮細胞可見空泡樣變性，晚期腎小管萎縮，基膜增厚等，導(dǎo)致腎小管的重吸收等功能障礙，病人臨床上出現(xiàn)水腫、蛋白尿等癥狀。

1.2 理論淵源

中醫(yī)并無糖尿病腎病病名的明確記載，按照糖尿病腎病患者水腫、蛋白尿等常見臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)“水腫”、“尿濁”、“關(guān)格”、“腰痛”、“腎消”和“消渴腎病”等。關(guān)于DKD的論述，最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》。《內(nèi)經(jīng)》中記載脾癉發(fā)展為消渴,再發(fā)展為消癉,相當于消渴病并發(fā)癥期，《靈樞·本臟》有言：“心脆，則善病消癉、熱中”、“肺脆，則苦病消癉、易傷”、“肝脆，則善病消癉、易傷”、“脾脆，則善病消癉、易傷”、“腎脆，則苦病消癉、易傷”、“五臟皆脆者，不離于病”。“肺、脾、肝、腎“脆”則“病消癉、易傷”?！端貑枴ねㄔu虛實論》云“凡治消癉,仆擊偏枯,痿厥氣滯發(fā)逆,肥貴人,膏梁之疾也?！敝赋隽恕跋D”的發(fā)生與五臟的虛弱密切相關(guān)。

趙宗江教授根據(jù)數(shù)十年來糖尿病腎病的治療經(jīng)驗，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究的特點，首次提出糖尿病腎病“腎痿”學(xué)說?！端貑枴ゐ粽撈酚性啤澳I氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿。”這講的是“五體痿”之“骨痿”的內(nèi)容。張仲景的“肺痿”學(xué)說引出了“五臟痿”的概念，他總結(jié)的“肺痿”臨床特征是“干嘔，咳吐涎沫”。趙宗江教授以中醫(yī)先賢痿證論為基礎(chǔ)，結(jié)合中醫(yī)腎的特點，在古人“臟痿”理論的基礎(chǔ)上，推演出“五臟痿”中“腎痿”的新內(nèi)容。糖尿病腎病日久，則熱、郁、痰濕、瘀血、毒邪相互膠結(jié)于腎臟，阻滯氣血運行，使腎臟的結(jié)構(gòu)破壞，“腎體”受損，腎臟的結(jié)構(gòu)破壞必然最終導(dǎo)致腎臟正常功能受損甚至喪失，即“腎用”失常，“腎體”和“腎用”均受到損害，長此以往，腎臟痿廢不用，即發(fā)生“腎痿”；因此“腎痿”一詞具有高度的概括性和非常豐富的內(nèi)容，它不僅僅是對糖尿病腎病病機的高度概括，也形象地描述了該疾病發(fā)展到后期的最終狀態(tài)即病理轉(zhuǎn)歸。中醫(yī)將人視為一個有機的整體來看待，五臟六腑相互溝通和牽制，“腎痿”的形成與多個臟腑功能失調(diào)有關(guān)，但是其和肝、脾、腎三臟的關(guān)系最為密切，這三臟中又尤以脾、腎最為關(guān)鍵。糖尿病腎病本為陰虛燥熱之證，如果不慎失治誤治，則病情進展，損傷陰津和正氣，最終導(dǎo)致氣陰兩虛；腎陰精缺乏，精微外泄，可以導(dǎo)致陰損及陽，出現(xiàn)脾腎陽虛的表現(xiàn)，五臟之氣皆虛，氣血陰陽俱衰。實證方面，因腎氣不足，不能氣化和通調(diào)水道，導(dǎo)致氣不行水，水液內(nèi)停，水濕內(nèi)生，郁久化熱，甚至毒與瘀搏結(jié)于腎臟，引起疾病的發(fā)生，一言以蔽之，本病是本虛標實之證，但臨床常見虛實錯雜的表現(xiàn)。本虛指正氣虧虛，標實則為痰飲、濕熱、瘀毒膠結(jié)，該病機特點貫穿于“腎痿”整個病程之中[5]，其中瘀血是引起并導(dǎo)致DKD“腎痿”不斷發(fā)展的最關(guān)鍵致病因素，許慎《說文解字》中說，“瘀，積血也”。血瘀證理論最早記載于《楚辭》，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中未出現(xiàn)“血瘀”或“瘀血”的字眼，但卻有“惡血”、“留血”、“衃血”的記載，消渴腎病遷延日久，陰虛燥熱耗傷氣陰，導(dǎo)致氣陰兩虛，結(jié)合“久病入絡(luò)”理論，氣虛則行血無權(quán)，陰虛則火旺傷津，血行瘀滯，初為氣陰兩虛，后由虛致實，瘀血內(nèi)生，阻滯腎絡(luò)，反映在腎臟病理表現(xiàn)上則可見腎小球硬化，腎小管上皮細胞重吸收障礙，空泡樣變，間質(zhì)纖維化等。

對中醫(yī)理論而言，“腎痿”學(xué)說填補了傳統(tǒng)中醫(yī)對糖尿病腎病認識的理論空白，是對中醫(yī)理論的發(fā)展，從此，糖尿病腎病的中醫(yī)治療有了專門的理論參考；對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)而言，“腎痿”學(xué)說為臨床糖尿病腎病的西醫(yī)治療提供了新的思路和方案，即結(jié)合中醫(yī)對疾病的認識，采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段祛除導(dǎo)致和加重糖尿病腎病的病理因素，增強治療效果，同時該學(xué)說也在中醫(yī)和西醫(yī)理論之間搭建起了一架溝通互參的橋梁，對促進中西醫(yī)的結(jié)合有重要意義和借鑒價值。

2 基于“腎痿”學(xué)說立法組方的糖腎平與糖腎寧

在“腎痿”指導(dǎo)下組方的糖腎平，藥物組成為生黃芪、熟地黃、山萸肉、白花蛇舌草、翻白草、水蛭。方中黃芪益氣固表、利水消腫，為方之君藥；山萸肉、熟地黃共同補益肝腎、益氣生津為臣藥；白花蛇舌草、翻白草清熱解毒、消痛散結(jié)、利尿除濕為佐藥；水蛭為使，活血通經(jīng)，以引諸藥直達腎絡(luò)。全方以滋補肝腎、益氣固精為主，兼以活血化瘀通腎絡(luò)，其特點為補而不滯，祛瘀而不傷正，瘀去濁降除宿根，助脾氣、腎精的化生，使氣陰充養(yǎng)，治療DKD之氣陰兩傷、瘀血阻絡(luò)、精微下泄者尤為適宜。此外，趙宗江教授在此基礎(chǔ)上根據(jù)“腎痿”學(xué)說創(chuàng)制糖腎寧，其方藥組成為：熟地黃、山萸肉、懷山藥、杜仲、炒白芍、淫羊藿、水蛭、酒軍等，具有益氣溫陽、健脾補腎、解毒利水的作用，適用于糖尿病腎病之陰陽兩虛、瘀毒內(nèi)阻證。方中熟地黃、山萸肉、懷山藥滋腎陰補肝血；淫羊藿、杜仲溫腎助陽；炒白芍健脾柔肝；水蛭、酒軍活血化瘀解毒。全方共奏補虛瀉實之功，適用于陰陽兩虛、瘀毒內(nèi)阻證。

糖腎平和糖腎寧在臨床治療糖尿病腎病實踐中收效顯著。為了進一步研究臨床驗方糖腎平和糖腎寧在臨床治療糖尿病腎病取得良好療效的內(nèi)在機制，本課題組在國家自然科學(xué)基金的資助下設(shè)計并完成了一系列基于動物實驗和細胞實驗的分子機制研究，從組織、細胞、分子水平和蛋白質(zhì)、基因?qū)用孢M行多層次、多角度的驗證了“腎痿”學(xué)說的科學(xué)內(nèi)涵。

3 “腎痿”學(xué)說的闡釋

本課題組圍繞“腎痿”學(xué)說，在體內(nèi)整體動物實驗方面，選取SD大鼠、Wistar大鼠和KKAy小鼠3個品種的實驗動物，采用鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)和基因易感配合高脂飼料誘導(dǎo)2種造模手段，對糖腎平和糖腎寧對DKD的作用機制進行研究；在體外細胞實驗方面，選用大鼠腎小球足細胞和小鼠腎小管上皮細胞，釆用高糖+LPS刺激足細胞和高糖刺激腎小管上皮細胞2種刺激手段，再次對糖腎平和糖腎寧對DKD的作用機制進行研究。在研究內(nèi)容方面，本課題組重點從下調(diào)糖尿病腎病腎組織中單核細胞趨化因子-1（MCP-1），減少細胞外基質(zhì)（ECM）在腎小球系膜區(qū)以及腎小管間質(zhì)的沉積、抑制足細胞損傷、抑制足細胞凋亡、抑制和逆轉(zhuǎn)足細胞轉(zhuǎn)分化和抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化等5大方向，從整體動物實驗和體外細胞培養(yǎng)兩個方面對“腎痿”學(xué)說的科學(xué)內(nèi)涵進行解讀，現(xiàn)將主要研究成果介紹如下：

3.1糖腎平與糖腎寧治療糖尿病腎病藥效學(xué)研究

豆小妮等[6,7]采用雄性SD大鼠，腹腔一次性注射STZ進行造模，72 h后血糖≥16.7 mmol·L-1、尿糖≥4+者為造模成功。將所有實驗大鼠每周稱體重，第4、8、12周分籠收集24 h尿液，檢測24 h尿蛋白定量。用藥12周，處死大鼠，取血檢測血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）、血肌酐（Serum creatinine，Scr）和甘油三酯（Triglyceride，TG）含量，Mallory染色觀察腎病理形態(tài)改變。實驗結(jié)果表明，除正常組外，其余各組大鼠攝食減少，活動遲緩，體重減輕，毛發(fā)光澤度下降，模型組小便多等。厄貝沙坦組和糖腎平膠囊組以上情況均有不同程度的改善，糖腎平膠囊組改善更明顯；與模型組比，糖腎平膠囊組體重增加，腎重/體重比減少，4周時，模型組尿蛋白定量顯著增加，且增加幅度隨時間逐漸加大，與之相比，糖腎平膠囊組尿蛋白定量增長幅度明顯減小；模型組大鼠BUN、Scr、TG明顯增高。與模型組大鼠比，糖腎平膠囊組BUN、TG減低；模型組腎內(nèi)可見小管間質(zhì)重度纖維化，腎小管、鮑曼氏囊和腎小球毛細血管腔擴張，腎小球球囊壁纖維化。糖腎平膠囊組小管間質(zhì)正常，腎小球輕度纖維化。

杜磊[8-11]等采用STZ造模，檢測模型組72 h后血糖和尿糖，成模標準為血糖≥16.7 mmol·L-1、尿糖4個“+”。14周末取材，實驗結(jié)果表明經(jīng)糖腎平治療后，大鼠體質(zhì)量增加，體質(zhì)量/腎質(zhì)量比減少，BUN、Scr、TG降低，模型組腎小球肥大，鮑曼氏囊節(jié)段性擴張粘連、囊壁增厚，腎小球系膜區(qū)增寬，大量膠原纖維沉積；透射電鏡觀察，模型組腎小球基底膜節(jié)段性增厚，足突融合。糖腎平治療后，上述病理狀態(tài)得到明顯改善，充分表明了糖腎平對大鼠腎臟的保護作用。

馮麗園[4]等采用單側(cè)腎切除加腹腔注射STZ進行造模，成模標準同杜磊的實驗，這種復(fù)合造模方法實驗操作簡便，STZ用量少,對其他器官的損害相對較小。實驗結(jié)果表明，糖腎寧治療后，大鼠體質(zhì)量增加，體質(zhì)量/腎質(zhì)量比減少，同時血清BUN、Scr、TG含量減少。光鏡下觀察，明顯可見模型組大鼠腎組織存在嚴重的系膜增生，腎小球球囊壁粘連和纖維化，鮑曼氏囊擴張，毛細血管腔和腎小管擴張，腎小管上皮細胞空泡樣變，并有壞死、脫落，間質(zhì)可見重度纖維化。經(jīng)糖腎寧治療后，大鼠上述病理狀態(tài)明顯改善。

吳阿敏[12]等實驗利用雌性10周齡KKAy小鼠聯(lián)合KK鼠配合飼料誘導(dǎo)造模，成模標準為血糖≥16.7 mmol·L-1，24 h尿蛋白≥0.4 mg。用藥干預(yù)16周，實驗結(jié)果表明，糖腎平治療后，小鼠一般狀態(tài)改善，體質(zhì)量均有不同程度減輕，腎質(zhì)量/體質(zhì)量比值明顯降低，24 h尿蛋白定量、BUN、TG和Scr含量降低，腎病理改變明顯減輕。

以上研究從藥效學(xué)角度驗證了基于“腎痿”學(xué)說立法、組方的臨床驗方糖腎平和糖腎寧防治鼠糖尿病腎病的有效性。3.2糖腎平與糖腎寧對糖尿病氧化應(yīng)激水平的影響

DKD狀態(tài)下，機體內(nèi)代謝功能紊亂會加速氧化應(yīng)激過程，產(chǎn)生更多的活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS），引起細胞損傷，最終破壞腎臟等內(nèi)臟器官的正常結(jié)構(gòu)[13,14]，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是評價氧化應(yīng)激水平的常用指標[15]。杜磊[8-11]等實驗研究表明，DKD模型組大鼠MDA升高，NO、SOD降低，各治療組與之相比，MDA均降低，NO、SOD均明顯升高，糖腎平大劑量組上述變化最顯著。馮麗園[4]等研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，糖腎寧膠囊組DKD大鼠NO增加；與模型組相比，MDA含量下降，SOD含量上升。由此說明糖腎寧膠囊可能通過影響DKD大鼠腎組織氧化應(yīng)激的反應(yīng)，減輕腎臟的病理損害進而減緩DKD的病程進展，對腎臟起到保護作用。吳阿敏[12]等實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖腎平可明顯降低DKD KKAy小鼠MDA含量，提高NO、SOD含量，增強機體抗氧化能力，保護小鼠腎臟。

3.3 糖腎平對足細胞形態(tài)學(xué)的影響

在血液高糖環(huán)境的影響下，糖基化終末產(chǎn)物，血管緊張素II等引起足突肌動蛋白結(jié)構(gòu)骨架改變，足細胞損傷，導(dǎo)致濾過屏障受損，出現(xiàn)蛋白尿，進而加重DKD病情。杜磊、王穎超、趙敬[9-11]等人在實驗研究中用高糖+LPS刺激足細胞36 h后，細胞失去突起，胞體變大，呈鵝卵石狀。經(jīng)糖腎平干預(yù)后，足細胞形態(tài)改善，大劑量組最為明顯。由此可以證明糖腎平能夠改善足細胞的形態(tài)，足細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的正常和穩(wěn)定是其執(zhí)行正常生理功能的前提和基礎(chǔ)，通過維持足細胞的正常形態(tài)可能是其發(fā)揮腎臟保護作用的機制之一。

3.4 糖腎平與糖腎寧對糖尿病腎病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

3.4.1 糖腎平對DKD PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

DKD發(fā)展過程中糖脂毒性等可破壞足細胞正常結(jié)構(gòu)，引起足細胞數(shù)量減少。足細胞裂孔膜蛋白Nephrin、CD2相關(guān)蛋白（CD2-associated Protein，CD2AP）和頂膜區(qū)蛋白Podocalyxin是保證足細胞發(fā)揮正常功能的重要分子，足細胞nephrin-CD2AP復(fù)合體能激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮抗足細胞凋亡作用[16]。王穎超[10]等人的免疫組化實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)DKD大鼠腎組織可見nephrin和CD2AP表達減少。糖腎平治療后，二者表達明顯上調(diào)，通過RT-PCR和免疫組化驗證了DKD大鼠腎組織中nephrin、CD2AP表達明顯異常，表明了糖腎平可通過維持足細胞裂孔隔膜蛋白的穩(wěn)定來改善DKD的臨床癥狀。通過體外細胞實驗觀察到，與正常組足細胞相比，高糖組和高糖+LPS組CD2AP與nephrin表達降低，同時PI3K表達減少，p-AKT/AKT比率下降，Bad表達升高，經(jīng)過糖腎平干預(yù)后，與高糖+ LPS組相比，CD2AP與nephrin表達明顯升高，p-AKT/ AKT比率上升，Bad表達下降，證明了基于“腎痿”理論立法、組方的臨床驗方糖腎平可能通過激活足細胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide 3 Kinase/ Protein KinaseB，PI3K/AKT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制了高糖環(huán)境下LPS誘導(dǎo)的足細胞凋亡。

3.4.2 糖腎平對DKD TGF-β1-Smad2/3-ILK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

TGF-β1是一種重要的致纖維化因子，能引起腎間質(zhì)細胞外機制的大量積聚，Smads蛋白是TGF-β通路的主要效應(yīng)蛋白[17]，ILK表達增多能加速ECM沉積，同時損傷GBM結(jié)構(gòu)、促進EMT的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1-信號傳導(dǎo)分子Smad2/3-整合素連接激酶（Transforming growth factor-β1-drosophila mothers against decapentaplegic2/3-Integrin-linked kinase，TGF-β1-Smad2/3-ILK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的足細胞轉(zhuǎn)分化在DKD的發(fā)生發(fā)展中起十分重要的作用。趙敬[11]等采用免疫組化、原位雜交和RT-PCR觀察糖腎平對DKD大鼠足細胞轉(zhuǎn)分化的影響，實驗發(fā)現(xiàn)糖腎平能降低TGF-β1、Smad2/3、ILK、α-SMA的表達，增加CD2AP的表達；利用高糖和高糖+LPS刺激足細胞36 h后，CD2AP表達減少而α-SMA表達增加，糖腎平干預(yù)后，足細胞TGF-β1、Smad2/3、ILK和α-SMA表達顯著降低，CD2AP表達升高，而且大劑量組變化最明顯。以上實驗證明了糖腎平可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1-Smad2/3-ILK信號通路抑制足細胞EMT，從而發(fā)揮其腎臟保護作用。

3.4.3 糖腎平對DKD TGF-β1-p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

TGF-β1、Caspase-3是腎臟氧化應(yīng)激引起足細胞凋亡損傷的重要細胞因子，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38Mitogen-Activated Protein Kinase，p38MAPK）作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點，可被多種細胞外刺激活化，調(diào)控細胞生長、增殖和分化，同時介導(dǎo)TGF-β1誘生的系膜區(qū)基質(zhì)沉積[18]，被氧化應(yīng)激誘導(dǎo)激活的p38MAPK可以進一步活化細胞凋亡因子Caspase-3引起足細胞凋亡。烏格敦其其格[8]等的實驗結(jié)果顯示模型組實驗動物的腎組織TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA及蛋白表達明顯增加；而經(jīng)過糖腎平治療能夠明顯下調(diào)腎組織TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA及蛋白表達，減輕腎組織的病理損害，改善腎功能。由此證明了基于“腎痿”理論立法、組方的臨床驗方糖腎平可能是通過調(diào)控TGF-β1/p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕足細胞凋亡而起到明顯的糖尿病腎病腎臟保護及延緩病程進展的作用。

3.4.4 糖腎平對DKDTGF-β1/Smad7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

TGF-β1也是目前已知的在DKD病理變化過程中致纖維化作用最強的細胞因子[19-21]。NF-κB是一種多靶向的細胞因子，參與足細胞內(nèi)的信號傳遞，調(diào)控多種基因的表達，其激活可導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)的釋放，引發(fā)腎臟炎癥反應(yīng)，同時又是一個促凋亡因子。TGF-β/ Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以激活NF-κB的活性，誘導(dǎo)腎臟發(fā)生炎癥和自身免疫反應(yīng)，并促進腎臟的足細胞凋亡[22]。Smad7是抑制性Smads，能減少足細胞凋亡[23]。杜磊[9]等采用Western-blotting方法檢測后發(fā)現(xiàn)，正常組足細胞內(nèi)TGF-β1、NF-κB蛋白的表達水平明顯較低，而Smad7蛋白的表達明顯較高；高糖組和高糖+ LPS組足細胞內(nèi)TGF-β1、NF-κB蛋白的表達明顯升高，Smad7蛋白的表達明顯低于正常組。糖腎平含藥血清培養(yǎng)的高糖+LPS刺激的足細胞內(nèi)Smad蛋白表達水平明顯升高，TGF-β1、NF-κB蛋白的表達水平較低，并且大劑量組最為顯著。因此我們認為基于“腎痿”理論立法、組方的臨床驗方糖腎平能夠降低足細胞TGF-β1、NF-κB蛋白的表達水平，增加Smad7蛋白表達水平，通過干預(yù)TGF-β1-smad7-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減少糖尿病腎病足細胞凋亡，可能是其防治糖尿病腎病的作用機制之一。

3.4.5 糖腎平對DKD TGF-β1/Smad6/BMP7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

在DKD腎臟纖維化過程中，有部分腎小管上皮細胞為對抗損傷、避免潛在的凋亡，失去上皮細胞標志物，如E-cadherin等，改變形態(tài)，成為肌成纖維細胞，并得到間充質(zhì)細胞標志物α-SMA[12]。TGF-β1是公認的促纖維化因子，可以通過多條信號通路參與EMT，Smads蛋白家族是TGF-β1受體激酶的底物，其中的Smad6屬于抑制型Smad，可以形成Smad6-CtBP復(fù)合物，并由此抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）信號通路[24,25]。在BMP亞家族中，BMP7與腎臟關(guān)系最密切，具有抗腎小管上皮細胞凋亡的作用，它能通過抑制EMT過程，抑制腎小管上皮細胞I型膠原和α-SMA的表達，逆轉(zhuǎn)EMT，誘導(dǎo)和激活TGF-β1/Smad6/ BMP7信號通路對啟動腎小管上皮細胞EMT至關(guān)重要[26]。吳阿敏[12]等的研究發(fā)現(xiàn)，DKD KKAy小鼠腎組織中TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA表達明顯升高，Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白及mRNA表達明顯降低。糖腎平治療后，可以降低DKD KKAy小鼠腎組織TGF-β1蛋白及mRNA的表達，升高Smad6和BMP7 mRNA和蛋白的表達，減少間充質(zhì)細胞標志物α-SMA mRNA和蛋白的表達，升高腎小管上皮細胞標志物ECadherin蛋白及mRNA的表達，推測糖腎平可能通過TGF-β1/Smad6/BMP7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細胞EMT，從而減輕“腎痿”時的腎纖維化，延緩DKD的病程進展，這可能是其防治DKD的作用機制之一。

3.4.6 糖腎寧對DKD TGF-β1/Smad7、NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

Smad7屬于抑制性Smad，在凋亡的足細胞中大量表達，對TGF-β/Smad信號通路具有自身負調(diào)控作用。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear Transcription Factor，NF-κB）廣泛存在于各類細胞中，它參與細胞內(nèi)的信號傳遞，其激活可導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)的釋放，如細胞因子、生長因子、粘附分子、受體、急性期蛋白等，與多種腎臟疾病，如腎小球腎炎、腎細胞癌、DKD、間質(zhì)性腎炎及腎纖維化等有關(guān)，smad7可通過阻止核因子NF-κB/p65從細胞質(zhì)到細胞核的轉(zhuǎn)錄而減輕細胞凋亡，對細胞起到保護作用[27]。馮麗園[4]等采用了免疫組織化學(xué)的研究方法探索DKD大鼠細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子TGF-β1、Smad7、NF-κB蛋白的表達以及糖腎寧膠囊對其表達的影響，采用了原位雜交和RT-PCR兩種方法檢測了腎臟組織TGF-β1mRNA的表達，加強對其表達證明的結(jié)果。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與模型組相比，應(yīng)用糖腎寧膠囊后，TGF-β1、NF-κB蛋白達明顯下調(diào)，這可能是腎組織病變減輕的機制之一。實驗中也發(fā)現(xiàn)隨著模型組大鼠腎組織TGF-β1、NF-κB蛋白表達增多，Smad7蛋白的表達在水平均明顯減少，而治療組的Smad7表達明顯高于模型組；原位雜交結(jié)果顯示，正常對照組TGF-β1表達較少，模型組染色從強度到面積都明顯增加，表達增多，糖腎寧膠囊治療組表達介于正常對照組及模型組之間；RT-PCR結(jié)果顯示，糖腎寧膠囊治療組TGF-β1mRNA的表達較模型組降低。在STZ誘導(dǎo)的DKD模型中，TGF-β1的上調(diào)促進了ECM積聚、腎臟纖維化和NF-κB上調(diào)引起的炎癥反應(yīng)，Smad7表達下調(diào)，從而對TGF-β1、NF-κB的抑制作用減弱。體外細胞實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，應(yīng)用糖腎寧膠囊含藥血清后，TGF-β1mRNA、NF-κB mRNA表達明顯下調(diào)，這可能是減弱足細胞病變機制之一。實驗中同時也發(fā)現(xiàn)，隨著模型組足細胞TGF-β1mRNA、NF-κB mRNA表達的增多，Smad7 mRNA的表達在水平明顯減少，而糖腎寧膠囊含藥血清治療組的Smad7表達明顯高于模型組。這表明在置于高糖環(huán)境下的腎小球足細胞，TGF-β1的上調(diào)促進了纖維化因子的聚集、NF-κB引起的炎癥反應(yīng)以及足細胞的凋亡，Smad7表達下調(diào)，對TGF-β1、NF-κB的抑制作用減弱。糖腎寧膠囊能通過下調(diào)TGF-β1和NF-κB的表達水平同時上調(diào)Smad7的表達發(fā)揮其保護作用而改善足細胞的功能，進而證明了糖腎寧膠囊可以通過影響TGF-β1-Smad7、NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)TGF-β1和NF-κB，上調(diào)Smad7的表達來影響DKD足細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，從而有效的防治了DKD“腎痿”的病理過程。

小結(jié)：歸納起來講，本課題組在整體動物實驗和體外細胞實驗兩個方面，從藥效學(xué)、氧化應(yīng)激水平和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等角度進行了深入的研究；涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有：PI3K/AKT、TGF-β1-Smad2/3-ILK、TGF-β1-p38MAPK、TGF-β1/Smad6/BMP7和TGF-β1/Smad7。以上研究圍繞減少細胞外基質(zhì)在腎小球系膜區(qū)以及腎小管間質(zhì)的沉積、抑制足細胞損傷、抑制足細胞凋亡、抑制和逆轉(zhuǎn)足細胞轉(zhuǎn)分化和抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化等五大主要研究方向來進行，較全面而系統(tǒng)地闡釋了糖尿病腎病“腎痿”學(xué)說的科學(xué)內(nèi)涵。

4 總結(jié)與展望

趙宗江教授率領(lǐng)的科研團隊長期致力于糖尿病腎病的科學(xué)研究，在糖尿病腎病的臨床與基礎(chǔ)研究領(lǐng)域做了大量的工作，積累了豐富的經(jīng)驗和豐碩的成果，在實驗研究方面，以大量科學(xué)研究為依據(jù)，運用中西醫(yī)結(jié)合辯證思維，逐步對“腎痿”學(xué)說進行了由淺入深的實驗闡釋，主要涉及整體動物實驗和體外細胞實驗兩個方面，從藥效學(xué)、細胞形態(tài)學(xué)、氧化應(yīng)激水平和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等角度進行全面而系統(tǒng)的研究，在不同的研究層面均成功闡釋了“腎痿”學(xué)說的科學(xué)內(nèi)涵；理論研究方面，在繼承了中醫(yī)先賢提出的痿證思想的基礎(chǔ)上，以中醫(yī)整體觀和辨證論治體系為立足點，根據(jù)中醫(yī)腎的生理病理特點，提出“腎痿”學(xué)說，是對中醫(yī)理論的繼承和發(fā)展，并且能夠有效指導(dǎo)DKD的臨床治療。

“腎痿”學(xué)說的提出不僅補充了糖尿病腎病中醫(yī)理論的不足，也是對“臟痿”理論的補充和發(fā)展?！芭K痿”屬臟腑勞損性病變，具有慢性和虛損性的特點。而“腎痿”指慢性腎臟疾病日久導(dǎo)致的腎臟痿廢不用，不能發(fā)揮其正常功能，屬于“臟痿”理論的分支；“腎痿”學(xué)說的理論內(nèi)涵完全涵蓋了臨床上以病情遷延不愈導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)破壞、腎功能損害，痿廢不用為特點的一切慢性虛損性腎臟疾病，因此其在科研領(lǐng)域和臨床治療領(lǐng)域的應(yīng)用價值不僅僅局限于糖尿病腎病，而是可以推而廣之，為臨床上慢性腎臟疾病的治療開辟新的思路和方向。

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9杜磊,趙敬,趙宗江,等.糖腎平對高糖+LPS刺激足細胞TGF-β1/ Smad7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響的研究.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2013, 14(2):107-110.

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11趙敬.糖腎平對DKD大鼠腎臟保護作用及TGF-β1-Smad2/3-ILK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響的研究.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2014:38-83.

12吳阿敏,趙宗江,張新雪,等.糖腎平對糖尿病腎病KK-Ay小鼠腎臟保護作用及對TGF-β1/Samd6/BMP7信號通路影響的研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2016,18(8):1342-1352.

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Establishment and Explanation of“Consumptive Kidney Disease”Theory

Miao Yonghui,Zhao Zongjiang,Zhang Xinxue,Wu Amin
(College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Diabetic kidney disease(DKD)is a serious long-term complication and major death cause of patients who have suffered from diabetes mellitus(DM),which is a serious threat to the health of human being.Professor Zhao Zongjiang first came up with the of DKD“consumptive kidney disease”scientific theory,and led the scientific research team for DKD research.Our team had achieved some results,which were mainly focused on the animal experiments and cell culture experiment.And the research fields covered pharmacodynamics,oxidative stress levels and signal transduction pathways.Focusing on the reduction of extracellular matrix in the glomerular mesangial area and tubulointerstitial deposition,inhibition of podocyte injury,inhibition of podocyte apoptosis,inhibition and reversal of podocyte transdifferentiation,inhibition of renal tubular epithelial cell transdifferentiation and other scientific issues,this paper systematically explored the biological mechanism of DKD“consumptive kidney disease”scientific theory.This paper explained how“consumptive kidney disease”scientific theory was proposed and summarized related research results of our research team and developed traditional Chinese medicine(TCM)theory by supplying the TCM“consumptive organ disease”theory.

Diabetic kidney disease,chronic kidney disease,consumptive kidney disease,traditional Chinese medicine theory

10.11842/wst.2017.06.024

R285.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：王晶）

2017-04-28

修回日期：2017-06-20

＊國家自然科學(xué)基金委面上項目（81373831）：基于“腎痿”組方的糖腎平干預(yù)糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的分子機制研究，負責(zé)人：趙宗江。

＊＊通訊作者：趙宗江，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病腎病的機制研究。