郝和群，鄭慧芳，張 艦

(1. 皖西學(xué)院材料與化工學(xué)院，安徽六安 237012；2. 安徽省仿生傳感與檢測技術(shù)省級實驗室，安徽六安 237012；3. 皖西學(xué)院高分子材料改性工程技術(shù)研究中心，安徽六安 237012)

研究論文

疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的制備與表征

郝和群1，2，鄭慧芳1，張 艦3*

(1. 皖西學(xué)院材料與化工學(xué)院，安徽六安 237012；2. 安徽省仿生傳感與檢測技術(shù)省級實驗室，安徽六安 237012；3. 皖西學(xué)院高分子材料改性工程技術(shù)研究中心，安徽六安 237012)

利用O-羧甲基殼聚糖(O-CMC)的表面多種官能團(如-NH2，-OH，-COOH等)與膽酸(CA)進行化學(xué)修飾得到兩親性共聚物，再以反溶劑法將Fe3O4和阿霉素(DOX)包埋在兩親性共聚物疏水的核中，制備兩親性的磁性殼聚糖載藥納米粒子，并對磁性載藥納米粒子的形貌、粒徑大小、磁性、藥物控釋等進行了研究。結(jié)果表明：磁性殼聚糖納米粒子有較高的藥物包埋效率(92.3%)，與自由阿霉素相比，磁性復(fù)合物具有明顯的緩釋作用和pH響應(yīng)性；同時，有較好的超順磁性。這些說明制備的疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子具有雙重響應(yīng)性，有望作為藥物輸送載體對腫瘤進行實時跟蹤、診斷和治療。

O-羧甲基殼聚糖 Fe3O4阿霉素 控釋

癌癥是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一。在抗腫瘤研究領(lǐng)域，雖然許多國家在過去的幾十年里都投入了巨額的研究經(jīng)費，但在降低癌癥死亡率方面并不是很理想。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因有很多，其中一個重要原因是缺乏對腫瘤的早期診斷、檢測以及療效監(jiān)測的方法。而早期診斷在很大程度上依賴于分子影像技術(shù)，如核磁共振成像(MRI)、X射線、CT、PET、超聲和光學(xué)成像等影像技術(shù)，獲取有用的生物學(xué)信息，滿足腫瘤的診斷、監(jiān)測[1-2]。

目前，國內(nèi)外已經(jīng)報道了多條靶向可控治療途徑，如以抗體識別直接靶向治療；通過特殊性能的納米微粒為藥物載體導(dǎo)向治療等。其中，通過聚合物納米載體實現(xiàn)藥物的靶向與可控釋放成為了近年來的一個研究熱點。通過納米載體對藥物進行控制釋放和靶向定位給藥可以在減少藥物用量的情況下有著更好的治療的效果，這些給患者帶來了許多的便利，也為患者減輕了很大的痛苦[3]。

O-羧甲基殼聚糖(O-CMC)是殼聚糖通過6位羥基與羧基反應(yīng)得到的，相比于殼聚糖，其好的水溶性、生物相容性、生物活性、抗腫瘤活性等在早期的文獻中已報道[4-5]。O-CMC表面富含多種官能團，如-OH、-NH2和-COOH，利用這些官能團，對其進行化學(xué)修飾便得到不同功能作用的納米粒子。如疏水修飾可以制備兩親性共聚物，在水中自組裝形成膠束，可以將脂溶性分子包埋在其疏水的核中，而親水的殼在納米粒子的表面?；谏鲜龅睦碚?，本文以膽酸疏水修飾的O-CMC為載體制備兩親性的磁性殼聚糖載藥納米粒子，并對磁性載藥納米粒子的粒徑大小、形貌、磁性、藥物控制等方面進行了表征和測試。

1 試 驗

1.1 實驗原料

O-羧甲基殼聚糖，分子量10萬，生物試劑，山東海得貝海洋生物有限公司；鹽酸阿霉素，純度>98%，浙江海正藥業(yè)有限公司；膽酸(CA)，純度98%，Bio Basic 公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 (EDC)，分析純，SIGMA-ALDRICH公司；牛血清白蛋白(BSA，Grade Ⅳ)，Amersharm Bioscience公司；N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉(NHS)，分析純，SIGMA-ALDRICH公司；二甲基亞砜(DMSO)分析純，國藥集團。其余試劑未經(jīng)說明均為分析純，使用前均未純化，實驗中所有的溶液均用電阻為18.2 MΩ 超純水，經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾后配制的溶液。

1.2 主要儀器設(shè)備

水浴鍋，長城科工貿(mào)，W201B型；冷凍干燥儀，寧波新芝，SCIENTZ-10N；傅立葉變換紅外光譜儀，美國賽默飛，IS5，測試波數(shù)范圍400～4 000 cm-1；X-射線粉末衍射儀，丹東通達，TD-3500型，測試角度為20°～80°；納米粒度儀，美國布魯克海文，90PLUS ZETA型；紫外可見分光光譜，北京普析，TU-1950，測試波長范圍為190～700 nm；核磁共振儀(1H-NMR)，美國賽默飛， NEXUS-470型；動態(tài)光散射儀，德國ALV，ALV/CGS-SF；透射電子顯微鏡，日本電子，JEM-2100plus；磁性分析儀(VSM)，美國Quantum，MPMS。

1.3 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的制備

O-羧甲基殼聚糖的疏水性修飾的制備在文獻[6]的方案上進行了修改，稱取0.200 5 g CA ，0.156 4 g NHS和0.111 8 g EDC，溶于25 mL DMSO，并在避光、30 ℃和氮氣氣氛下活化溶液中的膽酸。活化0.5 h后向上述溶液加入0.200 5 g O-羧甲基殼聚糖，繼續(xù)反應(yīng)24 h。所得溶液(O-CMC-CA)用截留分子量為3 500的透析袋對PBS緩沖液(10 mmol/L,pH7.4磷酸緩沖液含有0.15 mol/L氯化鈉)透析3天，除去沒有反應(yīng)掉的CA，再對去離子水透析3天，最后凍干備用。合成的O-CMC-CA共價復(fù)合物用紅外光譜及核磁共振對其結(jié)構(gòu)進行表征。

用共沉淀法制備Fe3O4納米粒子[7]，實驗步驟如下：將0.04 mol FeCl3·6H2O和0.01 mol FeSO4·7H2O在氮氣保護下攪拌充分溶解于50 mL水中，然后，在常溫下，將25 mL 10 mol/L的NaOH的溶液在30 min內(nèi)緩慢滴加到上述溶液中，繼續(xù)攪拌1 h，再升溫至90 ℃，反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后磁分離洗滌至中性，產(chǎn)物烘干備用。

疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的制備：通過反溶劑的方法，制備不同包埋效率的載藥磁性納米粒子。在殼聚糖的水溶液中加入一定量的有機溶劑乙醇，在室溫下微攪拌24 h，然后緩慢地將DOX和Fe3O4溶液逐滴加入到膽酸的修飾的羧甲基殼聚糖溶液，并調(diào)節(jié)pH至6.6，在室溫下微攪拌，最終聚合物濃度為4 mg/mL，DOX與聚合物的質(zhì)量比為1∶4，DOX與Fe3O4的質(zhì)量比為1∶1，平衡48 h。溶液全部轉(zhuǎn)移至截留分子量為3 500的透析袋里，對去離子水透析，直至完全除去乙醇，便得到包埋DOX和Fe3O4的磁性殼聚糖載藥納米粒子。

載藥納米粒子中抗腫瘤藥物阿霉素的包埋效率和負載量可以利用下面的公式計算得到。

其中Y表示阿霉素的包埋效率，W0表示投入阿霉素總質(zhì)量，W1表示體系中沒有包埋的自由的阿霉素質(zhì)量；L表示為阿霉素的包埋量，W2表示疏水修飾的殼聚糖納米粒子的質(zhì)量。

1.4 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子中DOX體外釋放研究

將0.5 mL納米粒子溶液置于透析袋中(截留分子量為14 000)，然后將透析袋浸入24.5 mL PBS緩沖液或者0.1 mol/L、pH5.0的醋酸緩沖液中。在37C攪拌，每隔一定時間取出3 mL 釋放介質(zhì)，然后加入3 mL新鮮介質(zhì)。在釋放介質(zhì)中的阿霉素濃度通過測量480 nm處的吸光度得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的表征

用紅外光譜對合成的O-羧甲基殼聚糖疏水進行表征。圖1A是O-羧甲基殼聚糖的紅外光譜圖，圖1B是用膽酸接枝改性后的O-羧甲基殼聚糖的紅外光譜圖。圖1A中1 634 cm-1是羧甲基中C=O伸縮振動的強吸收峰，1 419 cm-1及1 546 cm-1處吸收峰為COO-的對稱及不對稱伸縮振動峰。當(dāng)膽酸接枝到O-羧甲基殼聚糖上時，在紅外譜圖中1 634 cm-1強吸收峰消失(圖1B)，出現(xiàn)了酰胺Ⅰ帶1 653 cm-1和酰胺Ⅱ帶1 584 cm-1的振動峰，這是由于C=O 伸縮振動和N-H變形振動的組合[8]造成的，證明膽酸接枝在O-羧甲基殼聚糖的氨基上，形成新的酰胺鍵。

圖1 O-CMC(A)和O-CMC-CA(B)的紅外譜圖

2.2 DOX和Fe3O4的包埋效率及長期穩(wěn)定性

采用納米粒度儀對磁性殼聚糖載藥納米粒子(DOX/Fe3O4/O-CMC-CA)的水合粒徑和長期穩(wěn)定進行了研究，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，載藥納米粒子的水合直徑為182 nm，粒徑分布指數(shù)(PDI)分布在0.24左右，說明粒徑分布比較均勻。當(dāng)載藥納米粒子在放置6個月后(4 ℃)，光散射結(jié)果顯示粒徑變化不大。同時從表1可以看出，阿霉素在新鮮制備的疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子中的包埋效率和包埋量分別達到92.3%和10.1%，放置6個月后包埋效率和包埋量稍有降低，但總體變化不大。這些結(jié)果表明制備的疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的穩(wěn)定性很好。

表1 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的粒徑和穩(wěn)定性

圖2是所制備的樣品和純的Fe3O4X射線衍射樣品圖(XRD)。疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子與純Fe3O4類似，都出現(xiàn)了六個特征峰，對照PDF卡片No.19-0629數(shù)據(jù)，2θ=30.54°、36.03°、43.25°、54.13°、57.12°和62.65°的六個衍射峰可指標(biāo)化為面心立方尖晶石結(jié)構(gòu)Fe3O4的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面。說明聚合物對Fe3O4的晶體結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯改變。利用謝樂(Scherrer)公式[9]計算(311)晶面可得純的Fe3O4的晶胞粒徑約為12 nm。

圖2 DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子的XRD圖

圖3是疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的形貌。由圖可知，粒子相對比較均一，許多單個的Fe3O4成簇聚集在一起被共價復(fù)合物包裹在核中，構(gòu)成了磁性殼聚糖載藥納米粒子，粒子直徑平均在180 nm左右，與動態(tài)光散射(DLS)測得182 nm的結(jié)果大致相同。

圖3 DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子透射電鏡照片

2.3 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子中DOX的體外釋放模擬

通常腫瘤組織的pH值比正常組織的pH值低(10～12)，為了考察疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子中抗腫瘤藥物阿霉素在體液中釋放情況，選用pH值分別為7.4和5.0兩種緩沖液來考察阿霉素的釋放行為(圖4)。從圖4可知，在兩種不同釋放環(huán)境下，疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子釋放DOX的速率都比自由的DOX慢，說明具有聚合物對DOX的釋放行為具有緩釋效果。另外，DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子在pH5.0條件下較pH7.4的釋放速率快，一方面可以降低DOX對正常組織的毒副作用，另一方面有利于疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子在腫瘤部位釋放藥物。同時該釋放行為說明所制備的疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子具有一定的pH響應(yīng)性。

圖4 載藥磁性納米粒子的體外累積釋放情況

2.4 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的VSM表征

磁性納米粒子的磁性行為是決定其能否應(yīng)用于造影劑和磁靶向治療的重要因素。用磁性分析儀VSM測定DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子的磁性行為,如圖5所示，其磁滯曲線在300 K條件下測得。由圖可知，DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子在室溫下表現(xiàn)出零矯頑力和零剩余磁化強度，說明我們制備的DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子具有超順磁性行為。DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子的飽和磁化度(Ms) 是8.1 emu/g，相比純Fe3O4的飽和磁化度78.0 emu/g要小很多。由于Fe3O4在載藥聚合物中的含量減少，同時，高聚物凝膠化使Fe3O4的自旋無序[13]，結(jié)果疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的飽和磁化度較低。但根據(jù)文獻，一般認為Ms的值在7～22 emu/g范圍可用于生物應(yīng)用[14-16]，因此我們制備的疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子可用于腫瘤核磁共振(MRI)成像，以及可以通過外加磁場靶向作用將藥物輸送的病灶部位用于治療。

圖5 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的磁滯曲線

3 結(jié) 論

a) 本文成功合成了疏水修飾的殼聚糖，實現(xiàn)了其與DOX和Fe3O4的復(fù)合包埋，得到了磁性載藥納米粒子，包埋效率可達到 90%以上。

b) 該磁性載藥納米粒子具有雙重響應(yīng)性，即pH響應(yīng)性和磁靶向性，可以有效地輸送阿霉素到腫瘤組織和細胞中，對腫瘤進行實時跟蹤和診斷，可以實現(xiàn)MRI診斷和治療一體化。

參考文獻：

[1] Xing H Y， Bu W B， Zhang S J， et al.Multifunctional Nanoprobes for Upconversion Fluorescence， MR and CT Trimodal Imaging[J]. Biomaterials， 2012， 33(4): 1079-1089.

[2] Zhou J， Yu M X， Sun Y， et al.Fluorine-18-labeled Gd3+/Yb3+/Er3+Co-doped NaYF4Nanophosphors for Multimodality PET/MR/UCL Imaging[J].Biomaterials， 2011， 32(4):1148-1156.

[3] Chen X G， Park H J. Chemical Characteristics of O-carboxymethyl Chitosans Related to the Preparation Conditions[J]. Carbohydrate Polymers， 2003， 53(4): 355-359.

[4] Chen L Y， Du Y M， Tian Z G， et al. Effect of the Degree of Deacetylation and the Substitution of Carboxymethyl Chitosan On its Aggregation Behavior[J]. Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics， 2005， 43(3):296-305.

[5] 何練芹， 朱亮. 前藥葉酸-牛血清白蛋白-氟尿嘧啶偶聯(lián)物納米粒體內(nèi)分布及藥效學(xué)研究 [J]. 中國藥學(xué)雜志， 2010， 45(2): 107-110.

[6] Huang C， Neoh K G， Kang E T， et al. Surface Modified Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles (SPIONs) for High Efficiency Folate-receptor Targeting with Low Uptake by Macrophages[J]. Journal of Materials Chemistry， 2011， 21(40): 16094-16102.

[7] Fan Q L， Neoh K G， Kang E T， et al. Solvent-free Atom TransfersRadical Polymerization for the Preparation of Poly(poly(ethyleneglycol) Monomethacrylate)-grafted Fe3O4Nanoparticles: Synthesis， Characterization and Cellular Uptake [J]. Biomaterials， 2007， 28(36): 5426-5436.

[8] Tartaj P， Serna C J.Synthesis of Monodisperse Superparamagnetic Fe/silica Nanospherical Composites[J]. Journal of the American Chemical Society， 2003， 125(51): 15754-15755.

Preparation and characterization of hydrophobically modified magnetic drug-loaded chitosan nanoparticles

Hao Hequn1，2，Zheng Huifang1，Zhang jian3*

(1.CollegeofMaterialsandChemicalEngineering，Lu’anAnhui237012，China；2.AnhuiProvincialLaboratoryofBiomimeticSensorandDetectingTechnology，WestAnhuiUniversity，Lu’anAnhui237012，China；3.TheEngineeringTechnologyResearchCenterforModificationofPolymerMaterials，WestAnhuiUniversity，Lu’anAnhui237012，China)

Amphiphilic copolymers were prepared by the chemical modification of cholic acid with O-carboxymethyl chitosan(O-CMC)， while O-CMC have functional groups on the surface， such as-OH，-NH2，-COOH and so on. The magnetic drug-loaded chitosan nanoparticles were prepared by embedding Fe3O4and doxorubicin (DOX) in their hydrophobic nuclei using the antisolvent method. The morphology， size， magnetism， drug release of the nanoparticles was studied. The research results showed that the magnetic chitosan nanoparticles had higher drug entrapment efficiency (92.3%). Compared with free adriamycin， the magnetic complexes have obvious sustained-release and pH-responsive properties. Meanwhile， they have better superparamagnetic magnetic properties. These results indicated that hydrophobic modified magnetic chitosan nanoparticles can expected to be used as a drug delivery carrier to track， diagnose and treat tumors in real time.

O-carboxymethyl chitosan; Fe3O4; doxorubicin; controlled release

2017-01-04

安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目gxyqZD2016245和大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃201610376008。

郝和群(1978-)，女，安徽無為人，講師，博士，研究方向為生物醫(yī)用高分子材料。

0636.1

A 章編號：1006-334X(2017)01-0015-04

*通訊作者: 張艦，zhangjianhhq@163.com。