邱玲琳，閆洪超(徐州醫(yī)科大學研究生院,江蘇徐州 000；徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)

ELF5基因對人卵巢癌細胞侵襲轉移和大鼠移植瘤生長的抑制作用及其機制

邱玲琳1，閆洪超2
(1徐州醫(yī)科大學研究生院,江蘇徐州 221000；2徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)

目的 探討ELF5基因對人卵巢癌細胞侵襲轉移和大鼠移植瘤生長的抑制作用以及可能的機制。方法 體外實驗：人卵巢癌細胞隨機分為重組質粒組、空質粒組、未經轉染組，重組質粒組、空質粒組分別轉染構建好的pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核表達載體、空載質粒pcDNA3.1-EGFP，未經轉染組未經任何轉染。Q-PCR法檢測各組ELF5 mRNA的相對表達量，Western blotting法檢測基質金屬蛋白酶MMP-2及MMP- 9蛋白的相對表達量；Traswell試驗評價ELF5對卵巢癌細胞侵襲轉移的影響。體內試驗：建立人卵巢癌NOD/SCID鼠左前肢腋下移植瘤模型，應用隨機數字表法將大鼠分為3組，即重組質粒大鼠組(轉染pcDNA3.1- ELF5+EGFP的人卵巢癌細胞)、空質粒大鼠組(轉染空載質粒的人卵巢癌細胞)、未經轉染大鼠組(未經轉染的人卵巢癌細胞)，將處于對數生長期的3組細胞2×104/mL接種于NOD/SCID小鼠左前肢腋下。對比3組小鼠的移植瘤質量和體積，計算各組小鼠腫瘤抑制率(首先對轉移瘤行HE染色進行病理組織學檢查以確定其致瘤性)。Western blotting法檢測3組NOD/SCID小鼠移植瘤組織中MMP-2及MMP-9蛋白的相對表達量。結果 人卵巢癌細胞轉染pcDNA3.1- ELF5+EGFP真核表達載體后，可穩(wěn)定表達，且于72 h后轉染率較高；與空質粒組和未經轉染組比較，重組質粒組MMP-2及MMP-9蛋白相對表達量降低(P均<0．05)。Transell試驗中，重組質粒組穿膜細胞數少于空質粒組及未經轉染組(P均<0.05)。重組質粒大鼠組抑瘤率達64.4%。重組質粒大鼠組與其余兩組比較，其瘤組織中MMP-2及MMP-9蛋白相對表達量降低(P<0．05)，而空質粒大鼠組和未經轉染大鼠組比較，P均>0.05。結論 ELF5基因可能通過抑制MMP-2及MMP-9的表達而降低卵巢癌細胞的侵襲轉移能力。

卵巢癌；ELF5基因；Ets轉錄因子家族;細胞轉染；細胞侵襲；細胞轉移；移植瘤；大鼠

卵巢癌是一種高致死率疾病，且缺乏有效的早期篩查檢測方法。因此大多數患者被確診時已為晚期，5年生存率<40%[1]。卵巢癌早期診斷困難，復發(fā)、轉移率高，治療期間易對化療藥物產生抗性，使其成為一種高病死率的疾病。深入研究并探討卵巢癌的生物學行為及其分子機制，為卵巢癌患者尋求更好的治療方案已成為全球關注的焦點。轉錄因子是轉換內部和外部刺激，通過多信號傳導途徑進而影響基因表達變化的一類細胞因子[2]。EIF5是Ets轉錄因子家族中具有上皮特異性的一個成員，也被稱為ESE2,它位于人11號染色體短臂13～15區(qū)，這個區(qū)域在癌癥中易發(fā)生雜合性丟失[3]。該家族對細胞一系列正常生理過程，如分裂、分化、凋亡均有調節(jié)作用，同時細胞腫瘤的發(fā)生皆與之相關。2015年2月～2016年8月，本課題組探討了ELF5基因轉染后對卵巢癌細胞的體外生物學行為，包括細胞侵襲轉移能力的影響，同時探討了其對大鼠卵巢移植癌生長的抑制作用，以探索ELF5基因作為卵巢癌基因治療靶向分子的潛能，并為卵巢癌的基因治療提供新的候選基因與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細胞株由本課題組篩選并保存。24只雌性NOD/SCID大鼠由中國科學院上海實驗動物中心提供，鼠齡4～6周，體質量18～25 g。實驗室條件需要無特殊病原體，喂食大鼠水、飼料，以及鋪墊須經過嚴格的微生物控制。RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，鼠抗MMP-2單克隆抗體、兔抗MMP-9單克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司，DMSO購自Biosharp公司，細胞培養(yǎng)板、Matrigel和Transwell小室購自Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人卵巢癌細胞采用含有表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、Noggi及白血病抑制因子的無血清培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱內傳代培養(yǎng)。期間視細胞狀態(tài)以決定是否換液，3～4 d后，待細胞達到約90%融合時，傳代以保持細胞良好狀態(tài)。

1.3 穩(wěn)定轉染ELF5基因的人卵巢癌細胞的構建以及篩選 含有ELF5基因的pcDNA3.1- ELF5+EGFP真核細胞表達載體參照文獻[4]建立。轉染前1 d將對數生長的細胞接種于6孔板內，每孔接種5×105個細胞，設未經轉染組作為對照。待細胞貼壁80%左右時用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細胞表達載體體外轉染至卵巢癌細胞(重組質粒組)，同法將pcDNA3.1-EGFP轉染至卵巢癌細胞(空質粒組)，轉染6 h后加入等體積含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，G418篩選穩(wěn)定轉染的卵巢癌細胞用含G418(350 ng/μL)的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，1周后細胞大部分死亡，消化存活的細胞并稀釋為1個/10 μL，轉移至96孔板中繼續(xù)加G418進行培養(yǎng)，單個存活細胞增殖并形成克隆，經RT-PCR進行驗證后擴大培養(yǎng)。用于Transwell小室侵襲、遷移試驗及Western blotting法檢測。

1.4 細胞ELF5 mRNA 表達的檢測 采用Q-PCR法。上述各組細胞轉染后培養(yǎng)48 h，分別提取各組細胞總RNA，加入短片段引物進行Q-PCR，通過內標基因GAPDH校正，所獲PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，對各組細胞樣品ELF5基因的表達量進行分析。ELF5的PCR引物：F Primer：5′CCCATGCCATTGATGCTGA3′，R Primer：5′GGTGAGCTGCCACAGTTATTTGA3′。PCR反應條件：95 ℃ 30 s,然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。采用SYBR Green 1熒光染料嵌合法，通過電泳檢測擴增得到的cDNA片段, 熔解曲線分析，運用2-ΔΔCT方法處理數據。

1.5 細胞內MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量的檢測 采用Western blotting法。細胞轉染后72 h加人裂解液提取標本蛋白,-20 ℃保存，測定蛋白濃度，制備分離膠與濃縮膠，上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜至PVDF膜，將PVDF膜浸泡于50 g/L 脫脂牛奶,置搖床1.5 h后洗脫。一抗室溫孵育2 h，棄掉一抗，加入二抗，于室溫平緩搖動2 h。TBST液洗脫PVDF膜，掃描PVDF膜,放入暗盒進行X線顯影，用Image J圖像軟件分析結果，與對應β-actin的吸光度值之比作為目的蛋白的相對表達量。

1.6 各組細胞侵襲轉移能力的檢測 采用Transwell侵襲遷移及劃痕試驗。Transwell細胞侵襲試驗：每個Transwell小室加入 Matrigel基質膠50 μL(于實驗前由-20 ℃冰箱轉置4 ℃冰箱過夜融化，經RPMI1640培養(yǎng)液按1∶5稀釋)，使其均勻包被Transwell小室基底膜，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置1～2 h，待基質膠完全凝固。將各組細胞用無血清培養(yǎng)基重懸為單細胞懸液，以1×105/孔接種于鋪好基質膠的Transwell小室中。上層為200 μL細胞懸液，下層為500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。顯微鏡下計算穿膜細胞數。重復3次，計算平均值。Transwell細胞遷移試驗:具體操作步驟同“Transwell侵襲”試驗。Transwell遷移試驗中，小室不需包被Matrigel基質膠。將小室取出，PBS沖洗，用無菌棉棒輕輕拭去上室基底膜底面的細胞，95%甲醇固定，結晶紫染色，24 h后顯微鏡下計算穿膜細胞數。劃痕試驗：3組細胞分別以同等濃度種植進入6孔板，用經滅菌100 μL槍頭垂直在培養(yǎng)板上垂直劃痕，用培養(yǎng)基緩緩洗兩遍，以洗去被劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。之后每隔12 h在相差顯微鏡下隨機選擇5個視野拍攝相差圖片，動態(tài)監(jiān)測48 h，計算遷移到劃痕空隙的細胞總數，以此反映細胞轉移情況，每組重復3次。

1.7 人卵巢癌NOD/SCID鼠移植瘤模型的建立及分組 將符合條件的24只裸鼠應用隨機數字表法隨機分為3組，即重組質粒大鼠組(轉染pcDNA3.1- ELF5+EGFP的人卵巢癌細胞)、空質粒大鼠組(轉染空載質粒的人卵巢癌細胞)、未經轉染大鼠組(未經轉染的人卵巢細胞)各8只，將處于對數生長期的3組細胞(2×104/mL),以0.5 mL/只接種于NOD/SCID小鼠左前肢腋下。大約于接種1周后，通過觀察每只小鼠左前肢腋窩有瘤樣腫物突起物，判斷瘤荷鼠模型建立是否成功,實驗過程中未死亡NOD/SCID鼠納入結果分析。對比3組NOD/SCID小鼠移植瘤的生長情況，包括移植瘤的質量和體積，腫瘤體積計算公式:V=ab2×π/6，a為長徑，b為短徑，計算腫瘤抑制率[(1- 實驗組瘤質量/對照組瘤質量)×100%]。

1.8 NOD/SCID鼠移植瘤體組織中MMP-2及MMP-9蛋白相對表達量的檢測 在大鼠接種第5周，待部分移植瘤體積接近1 000 mm3時，處死小鼠，取出每組NOD/SCID鼠的瘤體，首先經病理組織學檢驗以明確其致瘤性，后采用Western blotting法檢測MMP-2及MMP-9蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 pcDNA3.1- ELF5+EGFP重組質粒在卵巢癌細胞中的表達 各組細胞轉染48 h后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，重組質粒組和空質粒組均可見到綠色熒光蛋白表達，而未經轉染組未見到綠色熒光，證明pcDNA3.1- ELF5+EGFP重組質粒和pcDNA3.1-EGFP空質粒均成功轉染至卵巢癌細胞中且有表達。

2.2 各細胞組ELF5 mRNA表達比較 重組質粒組、空質粒組、未經轉染組ELF5 mRNA相對表達量分別為2.97±0.69、1.00、1.00，重組質粒組高于其他兩組(P均<0.05)；其他兩組間比較，P>0.05。

2.3 各細胞組卵巢癌細胞侵襲轉移能力比較 將各組轉染細胞分別接種于上室培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察顯示各組均有細胞通過Matrigel基質膠的濾膜，重組質粒組、空質粒組、未經轉染組穿膜細胞數分別為(82.1±3.6)、(135.6±3.7)、(142.3±4.1)個/200倍視野。重組質粒組與其他各組比較，穿膜細胞數減少(P均<0．01)，而其他兩組間比較，P>0．05。將各組轉染細胞接種于上室培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察各組均有細胞穿過濾膜，重組質粒組、空質粒組、未經轉染組穿膜細胞數分別為(93.2±2.5)、(150.6±4.3)、(149.4±5.1)個/200倍視野。重組質粒組、未經轉染組遷移出細胞數分別為(155.5±3.1)、(251.7±3.4)、(267.4±4.1)個/200倍視野，空質粒組和未經轉染細胞組遷移細胞數均高于重組質粒組(P均<0．01)，其兩組間比較，P>0．05。

2.4 各大鼠組裸鼠移植瘤及主要器官的病理形態(tài)學特征 首先各組大鼠移植瘤皆證實為卵巢癌，同時重組質粒大鼠組在鏡下表現為腫瘤細胞大片壞死，部分細胞瓦解、碎裂，而空質粒大鼠組和未經轉染大鼠組腫瘤細胞壞死不明顯，多數表現為腫瘤細胞大小不一，形態(tài)各異，排列紊亂。

2.5 各大鼠組移植瘤質量及體積比較 重組質粒組移植瘤小且種植部位計數明顯低于空質粒組和未經轉染組；重組質粒大鼠組抑瘤率達64.4%。重組質粒大鼠組、空質粒大鼠組、未經轉染大鼠組移植瘤質量分別為(0．28±0．16)、(0．86±0．17)、(0．91±0．19)g，重組質粒大鼠組低于空質粒大鼠組及未經轉染大鼠組(P均<0．01)；空質粒大鼠組及未經轉染大鼠組比較，P>0．05。重組質粒大鼠組接種2、3、4、5周移植瘤體積分別為(165.63±16.13)、(235.93±20.59)、(281.12±19.36)、(323.41±26.12)mm3，空質粒大鼠組分別為(171.42±16.72)、(398.25±27.76)、(568.54±47.12)、(892.57±73.35)mm3，未經轉染大鼠組分別為(189.72±17.32)、(423.34±31.12)、(618.85±49.03)、(921.67±85.34)mm3，重組質粒大鼠組與其他兩組不同時間比較，P均<0．05；空質粒大鼠組及未經轉染大鼠組不同時間比較，P均>0．05。

2.6 各細胞組細胞中及各大鼠組移植瘤組織中的MMP-2及MMP-9蛋白相對表達量比較 重組質粒組、空質粒組及未經轉染組中MMP-2蛋白相對表達量分別為0.45±0.02、1.47±0.07、1.23±0.03,MMP-9蛋白相對表達量分別為0.32±0.01、1.67±0.02、1.59±0.09,重組質粒組MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量低于空質粒組及未經轉染組(P均<0.05)，而空質粒組及未經轉染組比較，P>0．05。重組質粒大鼠組、空質粒大鼠組及未經轉染大鼠組移植瘤組織中MMP-2蛋白相對表達量分別為0.42±0.03、0.98±0.03、1.00±0.09,MMP-9蛋白相對表達量分別為0.27±0.02、0.95±0.02、1.00±0.08,重組質粒大鼠組移植瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量低于空質粒大鼠組及未經轉染大鼠組(P均<0.05)，而空質粒大鼠組及未經轉染大鼠組比較，P均>0．05。

3 討論

最近，有專家提出腫瘤干細胞是癌癥復發(fā)的原因[5]。傳統(tǒng)的化療甚至能殺死大多數腫瘤細胞，但對腫瘤干細胞卻無法起到靶向治療作用，原因就在于腫瘤干細胞區(qū)別于成熟、已分化的細胞，其一是能對化療藥物產生抗性。因為腫瘤干細胞和其他正常干細胞一樣，且有著更能抵抗DNA損傷誘導的細胞死亡的生存優(yōu)勢，以維護基因組完整性[6]。這表明，初步治療增加了腫瘤干細胞耐藥的比例，因其能產生獲得性化療耐藥，因而不可避免地出現復發(fā)。因此，定義卵巢癌干細胞和識別其調控分子，聯合治療靶向清除腫瘤干細胞是有效治療卵巢癌的關鍵。本課題組在前期研究中以人卵巢癌細胞株HO8910細胞為研究對象，篩選出具有“癌干細胞”特性的CD133+CD117+細胞，并對其相關的干細胞“特性”進行了系統(tǒng)的鑒定，結果表明，本課題組所提取出的“癌干細胞”體內成瘤能力顯著，自我更新和分化能力明顯，并具有多藥耐藥等腫瘤干細胞的特征[7]。而就目前分離鑒定卵巢癌干細胞所依據的標志物以及方法仍存在較多的爭議,因此我們對分離出的“癌干細胞”尚均稱為卵巢癌細胞。

近十年來，腫瘤干細胞或者腫瘤起始細胞的起源尚不明確，但一些具有腫瘤異質性的細胞群落已經在許多惡性腫瘤中被證實存在，并猜測其可能為腫瘤組織細胞克隆的核心，具無限增殖、自我更新和多向分化、高致瘤性和抵抗放化療的能力，而這些都是腫瘤干細胞的一些特性[8]。脫離原發(fā)灶侵襲鄰近組織和遠處廣泛轉移是造成卵巢癌患者高病死率的首要原因，因此，如何限制卵巢癌的侵略性行為是當前有效提高卵巢癌治療效果的重要攻克目標。

Ets家族成員對于細胞的增殖、分化、發(fā)育及凋亡等正常的生理活動都具有非常重要的調節(jié)作用，而ELF5 屬于Ets家族成員[2]。目前對ELF5的研究主要集中在乳腺細胞、乳腺癌及移行細胞癌等方面。ELF5不僅對腺泡細胞的增殖、發(fā)育起影響，與其胚胎發(fā)育進程亦有一定聯系[8]。在乳腺癌的研究中證實，ELF5是一個潛在的腫瘤抑制因子,可對癌細胞起抑制作用，并能抑制乳腺癌的轉移[9]。本試驗中，人卵巢癌細胞在轉染ELF5基因后，其表現出的生物學特性，侵襲、轉移以及體內成瘤能力，相對于其他兩組都明顯下降，因此推論，在卵巢癌中ELF5基因在其侵襲、轉移中同樣能起到抑制作用，同時體外侵襲、轉移能力是體現腫瘤轉移潛能的重要指標。

腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落、突破組織屏障是導致腫瘤細胞發(fā)生轉移的關鍵步驟。原發(fā)腫瘤形成后，脫落、黏附、降解、移動和轉移形成貫穿于惡性腫瘤侵襲、轉移的全過程[10]。細胞外基質(ECM )和基膜是腫瘤浸潤、擴散過程中的一道天然屏障?；|金屬蛋白酶(MMPs)是一組降解ECM的鋅離子依賴內肽酶,在腫瘤的生長、侵襲和轉移中發(fā)揮至關重要作用。目前, 已確定的MMPs 有26 種,MMP-9是MMPs中明膠酶的一種,能夠降解ECM 中的Ⅳ型膠原[11],從而參與腫瘤的侵襲和轉移，Ⅳ型膠原是ECM和基膜的重要組成成分。腫瘤細胞分泌的MMPs中,MMP-2、MMP-9 可降解Ⅳ型膠原,在腫瘤的血管化、腫瘤細胞侵襲與轉移灶形成過程中起重要作用，從而參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移[12～15]。研究表明，較正常組織和良性病變，MMP-2和MMP-9在最常見的婦科惡性腫瘤的表達顯著增加(如：宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌)。本研究中，我們在對卵巢癌細胞進行靶向ELF5 基因轉染后使其表達，結果顯示，ELF5基因上調后，卵巢癌細胞侵襲轉移能力降低，MMP-2 和MMP-9蛋白表達明顯下降，在動物試驗中也表現出同樣趨勢的結果;另外，重組質粒大鼠組相對于空質粒大鼠組及未經轉染大鼠組移植瘤的生長受到明顯抑制，且從病理切片表現看，重組質粒大鼠組移植瘤體中腫瘤細胞出現壞死數量多，細胞核溶解、固縮明顯。推測ELF5基因有抑制卵巢癌細胞生長、侵襲及轉移的作用，此作用可能是通過抑制MMP-2 和MMP-9的表達而實現的。雖然具體調控機制及三者如何相互作用來影響侵襲轉移的分子機制還有待進一步探討，但可以期待ELF5有潛力作為卵巢癌基因治療的靶向分子，并為卵巢癌的基因治療提供新的候選基因與實驗依據。

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閆洪超(E-mail:1015058194@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.013

R737.31

A

1002-266X(2017)13-0045-04

2016-10-29)