李鐵軍張孝衛(wèi)

循環(huán)游離DNA的定量檢測及面臨的問題

李鐵軍★張孝衛(wèi)

循環(huán)游離DNA（circulating cell free DNA，cfDNA）與人類疾病之間存在著密切聯(lián)系。近年來，cfDNA做為一種無創(chuàng)檢測生物標(biāo)志物，展現(xiàn)出臨床應(yīng)用前景。人們針對(duì)其含量較低的特點(diǎn)，進(jìn)行了大量研究，開發(fā)出了各種較為可靠的定量檢測方法。但目前cfDNA的定量檢測仍然面臨問題及爭議，缺乏規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化的流程。本文對(duì)cfDNA的來源組成、定量檢測及存在的問題進(jìn)行了歸納整理及分析，希望能對(duì)提高cfDNA的定量檢測的可靠性提供有益的參考。

循環(huán)游離DNA；標(biāo)準(zhǔn)化；PCR

循環(huán)游離DNA（circulating cell free DNA，cfDNA）是指循環(huán)血中游離于細(xì)胞之外的DNA。由于近年來DNA提取、檢測、測序等分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，使得cfDNA的研究取得了長足進(jìn)步，與疾病之間的關(guān)系逐漸被揭示出來。cfDNA做為生物標(biāo)志物，在疾病篩查、診斷、治療監(jiān)控、預(yù)后、疾病復(fù)發(fā)等方面表現(xiàn)出令人振奮的應(yīng)用潛力。特別是對(duì)突變及甲基化循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的研究，在腫瘤的防控中開始顯現(xiàn)重要作用［1］。

cfDNA檢測的可靠性是其后續(xù)應(yīng)用的基本保障，關(guān)系到其做為生物標(biāo)志物的應(yīng)用前景，然而目前cfDNA的檢測仍然存在諸多問題，從采用血清還是血漿標(biāo)本的爭議，到標(biāo)本采集流程、檢測方法、結(jié)果判讀、正常值等均缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果沒有可比性。對(duì)cfDNA檢測的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化，是cfDNA走向?qū)嶋H應(yīng)用的必然選擇。cfDNA，其英文名稱也并不統(tǒng)一，有cell-free DNA （cfDNA）、Circulating DNA、Circulating Cell Free DNA（CCFDNA）、Free circulating DNA（fcDNA）、cell-free circulating DNA等。目前cfDNA檢測的常用方法有實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法、熒光染料法、bDNA技術(shù)等。下面本文對(duì)cfDNA的來源組成、定量檢測（標(biāo)本選擇、DNA提取和多種檢測方法）及存在的問題進(jìn)行了歸納探討，希望能對(duì)提高cfDNA的定量檢測的可靠性提供有益幫助。

1 cfDNA的來源、組成大小及代謝

一般認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是血清或血漿cfDNA的主要來源。其他來源有壞死腫瘤細(xì)胞的溶解、白細(xì)胞的分解、新合成核酸的自主釋放、細(xì)菌病毒等病原體的分解等［1］。cfDNA在血液與蛋白質(zhì)或膜結(jié)合顆粒形成天然復(fù)合物，能抵抗核酸酶的降解。

cfDNA凝膠電泳分析顯示，主要條帶在180 bp左右，其次分布在360 bp附近。與纏繞在單核小體和雙核小體的DNA長度相符。提示我們cfDNA源于細(xì)胞凋亡［2-4］，細(xì)胞壞死釋放出的DNA由于被不完全和非特異性消化，其片段大小約10 000 bp［5］。小鼠肝細(xì)胞凋亡時(shí)，血漿cfDNA增加的現(xiàn)象也支持了凋亡為cfDNA的來源這一說法［6］。

近年來，不同實(shí)驗(yàn)室利用DNA測序技術(shù)，對(duì)血漿cfDNA大小進(jìn)行了更精確的分析，分辨率達(dá)1個(gè)堿基。測序研究顯示［7-8］：cfDNA大小主要分布在166 bp。測序分析與電泳結(jié)果基本保持了一致。cfDNA的大小是我們利用PCR技術(shù)檢測時(shí)需要考慮的因素。

研究表明，癌癥患者與健康個(gè)體相比有較高的cfDNA水平。這些升高的cfDNA主要來自癌細(xì)胞［9-11］。正常健康人群的cfDNA水平較低，但在某些病理情況下會(huì)顯著升高。比如惡性腫瘤、手術(shù)和創(chuàng)傷、中風(fēng)、心衰、自身免疫性疾病、胰腺炎、重癥監(jiān)護(hù)相關(guān)狀況、運(yùn)動(dòng)員大量訓(xùn)練后等［12］。

cfDNA不僅來自于人類細(xì)胞，還含有人類微生物組的DNA。有研究證實(shí)細(xì)菌16S rRNA基因存在于患者與健康對(duì)照的人群的血液循環(huán)中［13-14］。雖然細(xì)菌或病毒DNA屬于外源性DNA，但在研究cfDNA的總濃度、組成、與疾病的關(guān)系等方面，必須考慮到這一因素。

值得注意的是，cfDNA的濃度及組成始終是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程。cfDNA是蛋白質(zhì)結(jié)合DNA，其半衰期較短，文獻(xiàn)報(bào)道的半衰期從幾分鐘到2 h不等［1，15，19］。在大鼠模型中，cfDNA的清除主要在肝臟和腎臟，肝臟是主要的攝取部位［16］。肝臟攝取單鏈DNA比雙鏈DNA快。腎臟清除并不是cfDNA的主要清除機(jī)制［17］，慢性腎病、透析患者的cfDNA水平并沒變化。但循環(huán)突變KRAS DNA可通過腎臟排出，并在尿液中檢測出［18］。

2 cfDNA的定量檢測

cfDNA的檢測大致可分為cfDNA總濃度的檢測和其中一部分DNA的檢測，比如ctDNA的檢測。特別是對(duì)突變或甲基化ctDNA的檢測，將極大地提高游離DNA作為疾病生物標(biāo)志物的特異性和敏感性，增加游離DNA檢測的應(yīng)用前景。

2.1 標(biāo)本選擇

血漿或血清均可做為cfDNA提取及檢測的樣本，但兩者的cfDNA濃度存在差異，選擇哪一個(gè)并沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。一般認(rèn)為，由于凝血過程中白細(xì)胞溶解，釋放DNA入血，因此血清cfDNA總濃度高于血漿。從避免白細(xì)胞基因組DNA混入待測標(biāo)本的角度考慮，采用血漿標(biāo)本似乎是更加合理的選擇。選擇血漿為標(biāo)本的研究也相對(duì)較多。

血液存放時(shí)間會(huì)對(duì)cfDNA濃度產(chǎn)生影響。有研究顯示，血漿cfDNA在8 h內(nèi)沒有變化，但血清cfDNA濃度在4 h時(shí)增加，并隨時(shí)間延長持續(xù)增加［4］。因此血漿分離前血液在4°C的最大存放時(shí)間是8 h，而血清應(yīng)立刻分離以避免基因組DNA的污染。還有研究認(rèn)為［20］，腫瘤患者血漿cfDNA的濃度經(jīng)歷了一個(gè)由高到低，再由低到高的過程。2 h時(shí)血漿中cfDNA的濃度較高，放置6 h時(shí)游離DNA的濃度明顯下降，30 h時(shí)又有所增加。

EDTA抗凝全血在加入細(xì)胞膜穩(wěn)定劑的情況下，室溫放置0、3、6 d后離心取血漿，cfDNA濃度未見明顯變化。在未加細(xì)胞穩(wěn)定劑時(shí)，3、6 d的cfDNA水平顯著增高。但加入的外源標(biāo)準(zhǔn)DNA對(duì)照（standard external DNA control，EDC）在加與不加細(xì)胞膜穩(wěn)定劑時(shí)未見明顯變化，說明cfDNA濃度變化與提取方法無關(guān)，而與細(xì)胞穩(wěn)定劑相關(guān)。細(xì)胞膜穩(wěn)定劑的加入可以有效抑制血細(xì)胞溶解，釋放DNA入血［21］。

可以看出，血液存放的時(shí)間長短確實(shí)對(duì)cfDNA水平產(chǎn)生影響。因此，在條件允許的情況下，采血后最好立刻分離血漿或血清，避免外源DNA的混入及濃度波動(dòng)，最大程度地反映cfDNA的原貌。

另外，采血部位對(duì)cfDNA濃度也可能造成影響。采用直接qPCR法測定血漿cfDNA的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，肘前靜脈的血漿cfDNA的濃度（17.6 ng/mL）顯著高于指尖毛細(xì)血管cfDNA濃度（8.7 ng/mL）［22］。可見，采血部位也是cfDNA檢測標(biāo)準(zhǔn)化需要考慮的因素之一。

2.2 cfDNA提取

目前，血漿或血清cfDNA的提取基本全部采用商業(yè)化試劑盒。由于cfDNA濃度極低，提取困難，不同方法提取效率差異明顯。比較常用的試劑盒為微柱吸附式的QIAamp?DNA blood mini kit （DBM），其次是磁珠式DNA純化試劑盒。但這些試劑盒主要用于從血細(xì)胞提取高度完整性的基因組DNA，而不是用于高度碎片化的cfDNA，因此可能導(dǎo)致提取效率較低。Devonshire AS等［23］將3種cfDNA專用提取試劑盒與DBM試劑盒進(jìn)行了詳細(xì)研究比較，認(rèn)為QIAamp?circulating nucleic acid （CNA）kit試劑盒在提取率和提取小片段方面均優(yōu)于DBM試劑盒。Repiská G等［24］的研究也得出了相似結(jié)論，認(rèn)為CNA或DSP Virus Kit（DSP）可以取代普遍使用的DBM試劑盒。還有研究表明，磁珠法提取效率高于DBM法，對(duì)質(zhì)粒DNA的提取效率也僅為69.2%，其余幾種方法提取率均未超過50%［25］。隨著cfDNA研究的不斷深入，cfDNA的提取技術(shù)也在不斷提高，提取率、DNA片段大小的覆蓋范圍、提取試劑對(duì)后續(xù)濃度測定的影響都是需要改進(jìn)提高的方面。

2.3 cfDNA定量方法

2.3.1 qPCR

qPCR是目前cfDNA定量的主流方法。通過檢測DNA中看家基因或穩(wěn)定出現(xiàn)的某些非編碼重復(fù)序列，達(dá)到cfDNA定量的目的。常用的靶序列有：β-actin、β-globin、GAPDH、TERT、RPPH1、ERV3、MSTN、ALU、L1PA2等。

目前，采用qPCR定量仍然存在不少問題：首先，定量時(shí)，測量的數(shù)據(jù)是cfDNA總濃度還是靶基因的濃度，很多文獻(xiàn)在這一點(diǎn)上表述不清，極易造成誤導(dǎo)。我們知道，qPCR實(shí)際測量的是靶基因的Ct值，然后再用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算cfDNA的量。一般以ng/mL或拷貝數(shù)表示。那么，參考基因的量能不能代表cfDNA的總量呢？這要看制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)采用的標(biāo)準(zhǔn)品是什么，通常有兩種不同做法：①采用提純的靶基因或重組質(zhì)粒，這樣計(jì)算出來的實(shí)際上就是靶基因的量，而不是cfDNA總量。只是以靶基因的量來“代表”cfDNA的量。②采用人基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)品。這樣看似計(jì)算出的是cfDNA總量，但這是以“看家基因在基因組中的含量穩(wěn)定且分布均勻”這一論斷為前提的。而cfDNA中是否含有相同比例的看家基因，答案并不明確。雖然兩種方法在表述上都是測的cfDNA的量，顯然，采用不同標(biāo)準(zhǔn)品測出的數(shù)據(jù)是沒有可比性的。理論上，以人類基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)品測得的數(shù)值應(yīng)遠(yuǎn)高于純靶基因質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值。也就是說，測量看家基因只能“大致反映”cfDNA的水平?；谏鲜鲈颍捎脝我话谢驒z測cfDNA，雖說可以進(jìn)行同一研究的橫向比較，但在cfDNA絕對(duì)定量的準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)化上仍需探討。

不同參考基因測定同一標(biāo)本的cfDNA濃度，是否可以得出一致結(jié)果呢？Devonshire AS等［23］比較了7個(gè)不同參考基因的qPCR定量并用數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）進(jìn)行驗(yàn)證，一些參考基因（比如TERT）測得的cfDNA的量平均高于其他內(nèi)參基因（比如ERV3）2倍以上。研究認(rèn)為使用多內(nèi)參基因的分析及取平均值可對(duì)cfDNA總量給出更加可靠的估計(jì)。此外，在cfDNA定量時(shí)，在待測血漿中加入所謂外源性標(biāo)準(zhǔn)DNA對(duì)照（EDC），可評(píng)估提取效率、提取產(chǎn)物的線性度、共純化抑制物的存在以及cfDNA片段大小對(duì)定量的影響［21］。

qPCR定量cfDNA時(shí)的另一個(gè)問題是，定量前是否需要血漿或血清DNA的提取。多數(shù)qPCR的定量研究均為先提取cfDNA，后qPCR定量。毫無疑問，這樣會(huì)造成cfDNA的損失。損失的DNA量可能比提取量還要大。Umetani等［26］嘗試不需DNA純化直接定量cfDNA：進(jìn)行qPCR之前，血漿或血清用備好的緩沖液和蛋白酶K處理，以去掉蛋白質(zhì)，通過擴(kuò)增兩種長度的ALU序列對(duì)cfDNA定量。Sarah Breitbach等［22，27］在反應(yīng)混合物中加入一種用于困難模板擴(kuò)增的特殊聚合酶（velocity polymerase），該酶每10 s可延伸1 kb堿基，血漿1∶40稀釋后，不需其他處理，直接加入反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR測定血漿cfDNA濃度。結(jié)果顯示，未經(jīng)提純的血漿中cfDNA的濃度是DBM試劑盒洗脫液（eluate）中cfDNA的2.79倍，在棄掉的流出液（flow-throug）中，發(fā)現(xiàn)了cfDNA總量的36.7%?？梢?，直接qPCR法操作更加簡便，避免了cfDNA的損失，但其可靠性仍需更多的相似研究和對(duì)比研究加以驗(yàn)證。

2.3.2 熒光染料法

采用PicoGreen［14，28］、SYBR Green I等熒光染料法檢測血漿cfDNA，取得了不錯(cuò)的效果。該法靈敏度高（可達(dá)pg水平），線性范圍寬。常用的PicoGreen是一種新型熒光染料，廣泛用于基因組DNA、病毒DNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等微量雙鏈DNA（dsDNA）的檢測。可將血漿稀釋后直接與Pico-Green染料1∶1混合，在熒光酶標(biāo)儀、熒光計(jì)等設(shè)備檢測熒光即可。2010年版中國藥典三部提出，熒光染料法檢測的線性范圍為1.25～80 ng/mL［29］。有商業(yè)化試劑盒稱可檢測低至25 pg/mL的dsDNA。由于熒光染料法靈敏度高、操作簡便，有學(xué)者認(rèn)為［30］，此法為檢測cfDNA的最佳方法。

2.3.3 bDNA技術(shù)

近年來，bDNA信號(hào)放大的定量檢測技術(shù)被用于cfDNA的定量檢測。bDNA技術(shù)是一種建立在DNA雜交基礎(chǔ)上的檢測技術(shù)，類似于Southern blot 或ELISA法，針對(duì)選定的靶序列，比如ALU序列，設(shè)計(jì)專門的捕獲輔助探針（capture extender，CE），CE兩端分別與靶序列和捕獲探針結(jié)合，靶序列再與一系列標(biāo)記輔助探針（1abeled extender，LE）、信號(hào)放大探針、酶標(biāo)記探針等相連，最后檢測酶與底物的反應(yīng)強(qiáng)弱［31］。該法的最低檢出限可達(dá)0.86 ng/mL［32］。bDNA技術(shù)不需DNA提取步驟，具有靈敏度、特異性較高、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，但該法目前在國內(nèi)應(yīng)用不多。

bDNA技術(shù)與qPCR技術(shù)在檢測cfDNA上有相似點(diǎn)，都是對(duì)某一靶序列的量進(jìn)行檢測，來定量cfDNA總量?？赡芤矔?huì)存在qPCR上出現(xiàn)的類似問題，比如單靶基因、不同靶基因帶來的定量差異，標(biāo)準(zhǔn)品的選擇等。而且不同靶序列，需要設(shè)計(jì)專門的捕獲輔助探針。bDNA技術(shù)與qPCR法的比較研究顯示［33］，兩法的血清游離DNA水平呈正相關(guān)，但bDNA技術(shù)測得的cfDNA濃度中位數(shù)（252.2 ng/mL）是qPCR法（65.5 ng/mL）的近4倍。qPCR法中cfDNA的提取損失應(yīng)該是其濃度低于bDNA法的主要原因之一。

2.4 甲基化cfDNA的定量方法

cfDNA中的甲基化DNA的檢測主要是指甲基化ctDNA的檢測。由于ctDNA具有含量極低這一不利于檢測的特性，因此，甲基化ctDNA的檢測基本上是基于PCR技術(shù)和測序技術(shù)上的檢測。PCR主要用于cfDNA中某特定基因或序列的甲基化檢測，而測序可對(duì)整個(gè)cfDNA的甲基化狀況進(jìn)行檢測。

甲基化ctDNA的定性檢測可通過甲基化特異性 PCR（methylightion specific PCR，MSP）來實(shí)現(xiàn)。之后，Eads等［34］將MSP與qPCR技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了甲基化DNA的定量檢測，即經(jīng)典的Methylight法，或稱qMSP法。這種定量是一種相對(duì)定量，通過計(jì)算PMR（percentage of methylated reference）值對(duì)目的基因甲基化水平進(jìn)行量化。但問題來了，PMR的計(jì)算方式并不統(tǒng)一。其一：PMR=該公式實(shí)際是2-ΔΔCT的一種百分化形式，是以全甲基化陽性對(duì)照為100%計(jì)算出的甲基化百分?jǐn)?shù)，PMR值應(yīng)在0～100%之間，代表甲基化基因占全部靶基因的百分比。陽性對(duì)照甲基化不完全，樣品與對(duì)照拷貝數(shù)的差異可能會(huì)導(dǎo)致PMR值＞100%。其二：PMR=2-（Ct樣本靶基因-Ct樣本內(nèi)參）×100%。這種是以內(nèi)參基因的量為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出的甲基化靶基因的相對(duì)量。PMR值上限不固定，取決于基因組中靶基因與參考基因之間的相對(duì)量。第一種PMR計(jì)算方法更易于理解和相互比較。不管哪種計(jì)算方式，必須考慮靶基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率是否一致的問題。

Methylight法與最近發(fā)展起來的數(shù)字PCR （dPCR）相結(jié)合，產(chǎn)生了數(shù)字Methyligh或稱為Methyligh dPCR。Methyligh dPCR比qPCR具有更高的敏感性［35］。dPCR可直接對(duì)拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量而不需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。dPCR由于單鏈模板進(jìn)入分區(qū)并被擴(kuò)增，可能產(chǎn)生拷貝數(shù)被高估的情況。

另一類定量方法是基于甲基化依賴限制性內(nèi)切酶（MDRE）或甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶（methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE）的PCR分析。MSRE或MDRE消化含數(shù)個(gè)CpG位點(diǎn)的靶序列，通過qPCR擴(kuò)增，計(jì)算甲基化的相對(duì)量。MSRE或MDRE法的局限性在于靶序列中必須含有相應(yīng)的含CpG的酶切位點(diǎn)，且酶切消化能否達(dá)到100%，也是影響結(jié)果的重要因素。

重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA，還可通過測序評(píng)估全cfDNA的甲基化狀態(tài)［5］。測序技術(shù)的發(fā)展，提供了更大的基因組覆蓋和測序深度。測序可通過單分子定量，大范圍高通量的識(shí)別所有甲基化胞嘧啶。

Redshaw等［36］使用系列梯度的甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)樣本，對(duì)Methylight、Methyligh dPCR、MSRE/ MDRE-qPCR和-dPCR以及測序法進(jìn)行了對(duì)比評(píng)估。Methylight qPCR表現(xiàn)出最好線性。測序分析精密度較高，但準(zhǔn)確性不如qPCR和dPCR，高估了甲基化含量。當(dāng)甲基化＜25%時(shí)，qPCR和dPCR法的精密度降低。

測序并未如我們期待的那樣，成為精密度和準(zhǔn)確性最高的方法。測序要想成為甲基化定量的金標(biāo)準(zhǔn)，技術(shù)上仍有改進(jìn)的空間。而且測序設(shè)備昂貴，臨床普及應(yīng)用尚有難度。

3 展望

cfDNA做為新興的生物標(biāo)志物，由于各種內(nèi)、外因素的影響，其組成及濃度變化較大，且含量較低，不易檢測。根據(jù)檢測目的和靶標(biāo)的不同，每種檢測方法各有其優(yōu)勢和局限性。當(dāng)今主流的檢測方法，基本是基于PCR技術(shù)的各種擴(kuò)展延伸，熒光染料法等方法由于自身的優(yōu)勢，也逐漸得到認(rèn)可。盡管存在缺乏檢測流程的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化等諸多問題，但這只是前進(jìn)道路中必然遇到的問題，相信通過更多的、更大樣本量的研究以及檢測技術(shù)的改良進(jìn)步，這些問題都將逐步得到解決。

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Quantification of circulating cell free DNA and the existing problems

LI Tiejun★,ZHANG Xiaowei
（Jinan health science exchange and service center,Jinan,Shandong,China,250013）

Circulating cell free DNA(cfDNA)are closely related to human disease.In recent years, as a noninvasive biomarkers,cfDNA showed great prospect for clinical application.Because of its extremely low content,a large number of studies have been done to develop various methods for quantitative detection.At the moment cfDNA quantitative detection still faces problems such as the lack of specification and standardization in detection processes.In this paper,we reviewed the source of cfDNA,quantitative methods and existing problems of detection,and hope to give a beneficial reference for improving the reliability of the quantitative detection.

Circulating cell free DNA;Standardization;PCR

濟(jì)南市衛(wèi)生科技交流服務(wù)中心,山東,濟(jì)南250013

★通訊作者：李鐵軍，E-mail：ltj6902@sina.com