何宇婷 黃彬

耐碳青霉烯銅綠假單胞菌耐藥性的基因?qū)W研究進展

何宇婷 黃彬★

碳青霉烯類抗生素是治療銅綠假單胞菌感染的有效藥物，但隨著此類抗生素的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率呈上升趨勢。本文從藥物的主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、抗菌藥物滲透障礙、產(chǎn)生藥物滅活酶及形成生物被膜這4個方面對耐碳青霉烯銅綠假單胞菌耐藥性的基因?qū)W研究進行綜述，為臨床合理應(yīng)用抗生素和進行感染防控提供理論依據(jù)。

銅綠假單胞菌；碳青霉烯類抗生素；耐藥機制；耐藥基因

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是假單胞菌屬的代表菌種，廣泛分布于自然界、土壤、水和空氣中，在人體皮膚、腸道和呼吸道均存在。銅綠假單胞菌為條件致病菌，是醫(yī)院感染的主要病原菌之一［1-2］。近年來，社區(qū)感染的多重耐藥銅綠假單胞菌不斷增多，也引起了人們的關(guān)注［3］。美國國家醫(yī)院感染監(jiān)測系統(tǒng)的報告指出，銅綠假單胞菌在所有院內(nèi)感染致病菌中檢出率居第5位，在革蘭陰性細(xì)菌中檢出率居第2位［4］。近年來，銅綠假單胞菌對臨床多種常用抗生素呈現(xiàn)明顯的多重耐藥甚至泛耐藥，一旦感染，臨床治療十分棘手。

碳青霉烯類抗生素是抗菌譜廣、抗菌活性強的非典型β-內(nèi)酰胺抗生素，主要包括亞胺培南、美羅培南和比阿培南等。目前，碳青霉烯類抗生素已成為臨床治療嚴(yán)重感染類疾病的一線藥物，特別是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase，ESBL）和頭孢菌素酶的多重耐藥菌引起的感染［5-6］。臨床上，碳青霉烯類抗生素是治療銅綠假單胞菌感染的有效藥物，但隨著此類抗生素的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率有上升趨勢。充分認(rèn)識耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的耐藥機制，有助于臨床研發(fā)更有效的抗感染藥物以及采取防止其耐藥性產(chǎn)生的一系列措施。本文從藥物的主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、抗菌藥物滲透障礙、產(chǎn)生藥物滅活酶及形成生物被膜這4個方面對耐碳青霉烯銅綠假單胞菌耐藥性的基因?qū)W研究進展綜述如下。

1 藥物的主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

主動轉(zhuǎn)運（active drug efflux）又稱外排泵系統(tǒng)（efflux pump system），是造成細(xì)菌耐藥的重要機制之一。根據(jù)細(xì)菌藥物主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的超分子結(jié)構(gòu)、機制和順序的同源性等將其分為四類：第一類為主要易化（major facilitator，MF）家族；第二類為耐藥小節(jié)分裂（resistance-nodulation-division，RND）家族；第三類為鏈霉素耐藥或葡萄球菌多重耐藥家族，是由四種跨膜螺旋組成的小轉(zhuǎn)運器；第四類為ABC（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運器。外排泵的作用底物廣泛，底物多樣，是其對多種抗生素產(chǎn)生固有或獲得性耐藥的重要原因［9］，可引起細(xì)菌同時對多種抗生素耐藥，在多種臨床分離株中，可能會出現(xiàn)多種外排泵同時高表達(dá)的現(xiàn)象［7-8］。

目前在銅綠假單胞菌中已報道MexABOprM、MexGHI-OprD、MexVW-OprM、MexPQOprE和MexMN-OprM等9種外排泵系統(tǒng)［10］。MexAB-OprM主動外排系統(tǒng)中的MexA、MexB和OprM蛋白由MexO編碼，并且MexO基因可受到mexR、nalC和nalD的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者用瓊脂稀釋法測定亞胺培南和美羅培南對75株銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度［11］，聯(lián)合外排泵抑制劑MC207110進行外排泵表型的篩選，用PCR擴增MexAB-OprM相對高表達(dá)的銅綠假單胞菌外排泵調(diào)節(jié)基因mexR、nalC和nalD，對擴增產(chǎn)物進行雙向測序，并對結(jié)果進行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)75株銅綠假單胞菌中外排泵表型陽性菌13株，其中10株菌的MexAB-OprM相對表達(dá)量增高，高表達(dá)MexAB-OprM菌株的調(diào)節(jié)基因mexR、nalC及nalD均陽性。其中9株菌nalC均發(fā)生第71位氨基酸突變（甘氨酸→谷氨酸）、8株菌同時還有第209位氨基酸突變（絲氨酸→精氨酸），僅發(fā)現(xiàn)1株菌nalD第158位氨基酸突變（蘇氨酸→異亮氨酸），8株菌mexR發(fā)生突變，表明mexR、nalC和nalD對MexO的負(fù)向調(diào)節(jié)作用由于其突變而減弱，Mex-AB OprM的高表達(dá)與其調(diào)節(jié)基因mexR、nalC、nalD的突變相關(guān)。Aghazadeh等［12］在研究耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌MexAB-OprM和MexXY-OprA的基因表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，在囊性纖維化患者中，銅綠假單胞菌mexX和mexA過表達(dá)是其耐碳青霉烯類抗生素的主要原因，并且在燒傷患者中，銅綠假單胞菌mexA基因的過表達(dá)也與其耐碳青霉烯類抗生素有關(guān)。Zeng等［13］對29株臨床分離的銅綠假單胞菌進行RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，MexXY-OprM與MexAB-OprM的過表達(dá)與OprD基因的缺失在銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素中發(fā)揮了重要作用。Liu等［14］在研究醫(yī)院感染的銅綠假單胞菌時發(fā)現(xiàn)，mexB或者mexY高表達(dá)聯(lián)合OprD基因L710的改變與美羅培南的耐藥密切相關(guān)。Aghazadeh等［12］發(fā)現(xiàn)，在對美羅培南耐藥的菌株和對亞胺培南耐藥而美羅培南敏感的菌株中均存在mexA和mexX高表達(dá)的現(xiàn)象，導(dǎo)致MexAB-OprM過表達(dá)而產(chǎn)生耐藥性。因此，銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素的原因與mexA或mexX高表達(dá)有關(guān)，從而導(dǎo)致相應(yīng)的外排泵系統(tǒng)如MexAB-OprM高表達(dá)，對藥物的外排作用增強而產(chǎn)生耐藥。同時，外排泵系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因突變可能與銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素有關(guān)。

2 抗菌藥物滲透障礙

細(xì)菌細(xì)胞膜是一種具有高度選擇性的滲透性屏障，控制著細(xì)胞內(nèi)、外的物質(zhì)交流，大多數(shù)膜的滲透性屏障具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，允許親脂性藥物通過。在銅綠假單胞菌的脂雙層中鑲嵌有通道蛋白，是一種非特異性的、跨越細(xì)胞膜的水溶性擴散通道，其中，外膜蛋白OprC、OprD2及OprE均具有孔道活性［15］。OprD是可以在突變前和突變后被調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，其可調(diào)節(jié)性和突變的特性是銅綠假單胞菌耐藥的重要機制［16］。Wolter等［17］采用RT-PCR在啟動子上游和結(jié)構(gòu)基因下游對銅綠假單胞菌臨床分離株的oprD基因進行擴增和測序，并與野生型PAO1菌株的oprD基因比較后發(fā)現(xiàn)，臨床分離株oprD基因下調(diào)與某些片段的插入有關(guān)。

Ruiz-Martinez等［18］在研究臨床分離株P(guān)A110514與PA116136時，發(fā)現(xiàn)一段新的插入序列ISPa133，并且隨著插入序列ISPa133在染色體上位置的變化，其對OprD孔蛋白的表達(dá)有不同的影響。在PA110514株，ISPa133位于翻譯起始密碼上游56個核苷酸處，這對OprD孔蛋白的表達(dá)沒有影響，而在PA116136株，ISPa133位于696個核苷酸前并且有效地替代了它，這導(dǎo)致OprD孔蛋白前232個氨基酸的移除，從而使OprD孔蛋白表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致PA116136對亞胺培南產(chǎn)生耐藥。ISPa133的插入為移動性的，它取決于亞胺培南所帶來的選擇性壓力的程度。

有研究發(fā)現(xiàn)，oprD2基因缺失銅綠假單胞菌對亞胺培南產(chǎn)生低水平耐藥［19］，但如果伴有其他耐藥機制時，可對亞胺培南產(chǎn)生高度耐藥。Vila等［20］認(rèn)為，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥一方面是由于oprD基因的缺失，另一方面是由于金屬酶B類或D類基因的獲得。Arabestani等［21］報道，銅綠假單胞菌在oprD基因高表達(dá)下也會出現(xiàn)對亞胺培南和美羅培南耐藥，表明耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌可能存在其他耐藥機制，如外排泵高表達(dá)和產(chǎn)AmpC。Castanheira等［22］研究歐洲地區(qū)與地中海地區(qū)銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制，對相關(guān)基因進行PCR分析發(fā)現(xiàn)，OprD基因的下調(diào)或缺失是銅綠假單胞菌耐藥的主要內(nèi)在機制（占94.9%），AmpC表達(dá)與Mex-AB-OprM功能亢進也是其部分耐藥機制，分別占耐藥機制的44.4%與20.1%。因此，銅綠假單胞菌oprD基因中一段新序列的插入或某一片段的缺失都是其對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機制，同時可能伴有其他耐藥機制的共同產(chǎn)生，如金屬酶基因的獲得或外排泵調(diào)節(jié)基因的突變等其他機制，多種機制的共同作用導(dǎo)致產(chǎn)生高水平的耐藥性。

3 產(chǎn)生藥物滅活酶

細(xì)菌產(chǎn)生水解酶（主要指β-內(nèi)酰胺酶）引起藥物滅活是一種重要的耐藥機制，水解酶包括超廣譜酶β-內(nèi)酰胺酶、金屬酶和AmpC酶等。銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素的藥物滅活酶主要是碳青霉烯酶，主要分布在β-內(nèi)酰胺酶A、B、D類中。根據(jù)其水解機制中作用位點的不同，可將碳青霉烯酶分為兩大類，一類稱為金屬碳青霉烯酶，另一類以絲氨酸為酶的作用位點。在世界范圍內(nèi)不斷報道產(chǎn)金屬酶（Metallo-β-Lactamases，MBLs）的銅綠假單胞菌，尤以近十年來為甚［23］。目前在銅綠假單胞菌株中主要發(fā)現(xiàn)4種MBLs，分別是IMP、VIM、SPM和GIM，其中VIM-2型占主導(dǎo)地位［24］。

劉雙全等［25］對臨床分離的690株銅綠假單胞菌進行回顧性分析，采用PCR法檢測8種β-內(nèi)酰胺酶基因的分布情況，結(jié)果顯示，IMP陽性25株，VIM陽性17株，IMP和VIM均陽性7株，OXA陽性3株，其它β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因（SPM，TEM，PER，GES，SHV）均陰性，提示銅綠假單胞對碳青霉烯類抗生素耐藥可能主要與β-內(nèi)酰胺酶基因IMP和VIM有關(guān)。Rizek等［26］研究銅綠假單胞菌碳青霉烯酶基因表達(dá)，采用PCR對臨床分離株IMP、SPM、VIM、SIM、NDM、KPC與GES進行檢測并測序發(fā)現(xiàn)，SPM陽性率最高（32%），其次是KPC （7.8%）和VIM（3.9%），它們都屬于SPM-1與VIM-2，并且同一個分離株可同時攜帶SPM-1、VIM-2和KPC-2這三種耐藥基因。Liu等［27］通過研究臨床各類標(biāo)本中耐碳青霉烯銅綠假單胞菌株，發(fā)現(xiàn)其耐藥機制主要是由VIM-2型MBL介導(dǎo)，其次是KPC-2型；同時Liu等［27］應(yīng)用腸桿菌基因重復(fù)序列PCR技術(shù)，將大腸埃希菌分為6種基因型，其中在臨床耐藥株中A型最為流行；在觀察的實驗株中出現(xiàn)了耐碳青霉烯基因與質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因（Plasmid mediated quinolone resistant，PMQR）acc（6′）-Ib-cr和qnr共攜帶的現(xiàn)象，這可能與細(xì)菌的多重耐藥有關(guān)。在某些耐碳青霉烯類抗生素的銅綠假單胞菌臨床分離株中還可以檢測到新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶1（NDM-1），但NDM-1并不是銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素的主要機制［28］。

MBLs編碼基因位于可移動的質(zhì)粒或Ⅰ類整合子上，整合子具有可識別、捕獲外源基因并使之轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄曰虻幕蛑亟M系統(tǒng)的作用，從而使被捕獲的外源基因通過質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子在細(xì)菌間、甚至不同種屬細(xì)菌間水平傳播［29］。Ⅰ類整合子在臨床分離的VIM-2銅綠假單胞菌中約占40%，有利于MBLs基因轉(zhuǎn)移，表明在MBLs耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移中整合子發(fā)揮了一定的作用［30］。因此，在銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素的機制中，主要是攜帶VIM-2型金屬酶基因，并且可能出現(xiàn)多種金屬酶基因共同表達(dá)的情況。在耐藥性的獲得過程中，整合子起了一定的作用。

4 形成生物被膜

形成生物被膜是造成細(xì)菌對抗菌藥物耐藥的重要原因，其通過阻止和抑制白細(xì)胞、抗菌藥物等進入生物膜中殺滅細(xì)菌從而使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。在銅綠假單胞菌中，生物被膜的形成與SagS 和BrlR基因的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。BrlR是MerR家族中多藥物外排泵的激活因子，并且BrlR基因的高表達(dá)可以增強銅綠假單胞菌對某些藥物的耐藥性，BrlR基因的失活會降低生物被膜的保護作用與細(xì)菌的運動能力，同時下調(diào)pslA基因的表達(dá)，上調(diào)ndvB基因的表達(dá)［31］。Gupta等［32］發(fā)現(xiàn)SagS基因通過上調(diào)c-di-GMP的表達(dá)水平，可增強銅綠假單胞菌生物被膜對藥物的抵抗性。Oglesby-Sherrouse等［33］發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌周圍環(huán)境中的離子濃度可以通過不同的機制影響細(xì)菌生物被膜的形成，高離子濃度可促進生物被膜的形成，從而促使細(xì)菌對不同的藥物產(chǎn)生耐藥性，不同的離子可以影響其耐藥的類型。Marguerettaz等［34］在囊性纖維化患者中發(fā)現(xiàn)，高Zn2+離子濃度可通過獨立的CzcRS機制刺激銅綠假單胞菌生物被膜形成，包裹在生物被膜中的銅綠假單胞菌表現(xiàn)出對碳青霉烯類藥物的高度耐藥性。同時，他們證實了Zn離子敏感的調(diào)節(jié)通路，其可調(diào)節(jié)OprD基因的表達(dá)和改變碳青霉烯藥物的耐藥形式。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細(xì)菌細(xì)胞間信息傳遞的普遍機制，細(xì)菌通過合成、分泌信號分子（又稱自誘導(dǎo)分子）來控制整個細(xì)菌群體的行為，當(dāng)信號分子濃度隨著細(xì)菌群體密度達(dá)到一定閾值時，即可啟動某些特定基因的表達(dá)，以調(diào)節(jié)細(xì)菌群體適應(yīng)功能［35］。銅綠假單胞菌具有群體感應(yīng)系統(tǒng)的典型特征，主要有Las群體感應(yīng)系統(tǒng)，Las系統(tǒng)由LasR和LasI基因組成，Las系統(tǒng)與銅綠假單胞菌的感染有關(guān)，并且可以增加其對某些抗生素的耐藥性，如亞胺培南和環(huán)丙沙星等［36］。在銅綠假單胞菌中，3-oxo-C12-HSL是群體感應(yīng)中的重要信號分子，pvdQ基因可通過編碼?；D(zhuǎn)移酶并將其水解來影響銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)。此外，Wang等［37］在研究銅綠假單胞菌的群集效應(yīng)時，通過構(gòu)建PAO1pMEpvdQ發(fā)現(xiàn)，在群集效應(yīng)中起重要作用的pvdQ基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化來降低銅綠假單胞菌生物膜的通透性，使其對多種抗生素的耐藥性增加，包括碳青霉烯類和喹諾酮類等多種抗生素。

5 小結(jié)

耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的耐藥機制極為復(fù)雜，耐藥相關(guān)基因繁多，不同的耐藥基因通過不同的機制從調(diào)節(jié)藥物的主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、抗菌藥物滲透障礙、產(chǎn)生藥物滅活酶及形成生物被膜這4個方面調(diào)控銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥性，并且，耐藥性的產(chǎn)生往往不是由單一因素造成的，常常是幾種機制協(xié)同作用的結(jié)果。

對耐碳青霉烯銅綠假單胞菌耐藥性進行基因?qū)W研究，首先可以在分子生物學(xué)層面上為臨床診斷細(xì)菌耐藥提供新的方法，并且為抗細(xì)菌耐藥提供新的作用靶點；其次，有助于臨床研發(fā)更有效的治療銅綠假單胞菌感染的抗菌藥物以及采取防止其耐藥性產(chǎn)生的一系列措施。隨著對銅綠假單胞菌認(rèn)識的不斷深入，新的耐藥機制及其相關(guān)的耐藥基因可能會被不斷發(fā)現(xiàn)，耐碳青霉烯銅綠假單胞菌耐藥性的基因?qū)W研究有待進一步探索。

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Genetic research progress of carbapenems-resistantPseudomonas aeruginosa

HE Yuting，HUANG Bin★
（Department of Laboratory Medicine，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou，Guangdong，China，510080）

Carbapenems are useful drugs for the treatment of Pseudomonas aeruginosa infection, but,with the wide use of these antibiotics,carbapenem-resistance is increasing in Pseudomonas aeruginosa.This review summarizes the advances in genetic research into the carbapenem-resistance of Pseudomonas aeruginosa with respect to the active transport system,antibacterial drug permeation barrier,producing drugs to inactivate enzymes and biofilm formation.The presented study provides a theoretical basis for the clinical rational use of antibiotics and prevention and control of infection.

Pseudomonas aeruginosa;Carbapenems;Resistance mechanism;Resistance genes

國家自然科學(xué)基金（81572058）；廣東省自然科學(xué)基金（2014A030313143）；第49批留學(xué)回國人員科研啟動基金

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部，廣東，廣州510080

★通訊作者：黃彬，E-mail：hb906@163.com