韓露，崔凱，王振丹，李勝

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250022；2山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)

·綜述·

食管鱗癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法研究進(jìn)展

韓露1,2，崔凱2，王振丹2，李勝1,2

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250022；2山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)

食管鱗癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，60%～80%食管鱗癌患者在接受根治性手術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞播散入血并形成轉(zhuǎn)移灶被認(rèn)為是導(dǎo)致食管鱗癌患者預(yù)后較差的重要原因之一。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指自發(fā)或因診療操作導(dǎo)致腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，CTCs在食管鱗癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。目前,已報(bào)道的CTCs檢測(cè)技術(shù)有50余種，各種方法優(yōu)缺點(diǎn)各不相同，其臨床適用情況也不盡相同。本文主要就食管鱗癌CTCs檢測(cè)方法的研究進(jìn)展作一綜述。

食管鱗癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；檢測(cè)技術(shù)；預(yù)后

食管鱗癌早期癥狀隱匿，惡性程度高，患者就診時(shí)多屬中晚期，故患者預(yù)后較差，5年生存率為15%～25%[1～3]，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后較差的主要原因。臨床上有相當(dāng)一部分患者，就診時(shí)腫瘤分期較低，治療前也無(wú)明顯轉(zhuǎn)移證據(jù)，在行腫瘤根治術(shù)后卻早期死于腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，說(shuō)明存在用常規(guī)臨床檢驗(yàn)和組織病理學(xué)方法不能檢出的癌細(xì)胞播散或隱性轉(zhuǎn)移[4]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指自發(fā)或因診療操作導(dǎo)致腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[5]。近年來(lái)隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，CTCs檢測(cè)日益引起臨床重視。CTCs檢測(cè)主要包括富集和鑒定兩個(gè)步驟。CTCs富集技術(shù)主要有基于細(xì)胞形態(tài)的密度梯度離心法、膜過(guò)濾分離法(ISET法)和免疫磁性富集方法(如Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)、免疫磁珠負(fù)性篩選策略等)[6～8]；鑒定技術(shù)包括免疫學(xué)技術(shù)、RT-PCR技術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)和CTCs芯片技術(shù)等[9～11]；檢測(cè)方法眾多，但各具特征[12]。本文結(jié)合文獻(xiàn)就食管鱗癌CTCs的檢測(cè)方法研究進(jìn)展作一綜述。

1 CTCs 的特點(diǎn)、分類及作用

CTCs是指存在于外周血中各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱。腫瘤組織每天會(huì)釋放大量腫瘤細(xì)胞入血，但這些腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中的存活率極低，一般每1×108個(gè)正常血細(xì)胞中僅含有1個(gè)[13]；Yu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌CTCs的上皮和間葉成分呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)改變，并根據(jù)上皮(E)和間質(zhì)(M)組織標(biāo)志物的比例將CTCs分為E、E>M、E=M、E

2 食管鱗癌CTCs的主要檢測(cè)方法及其臨床評(píng)價(jià)

2.1 檢測(cè)方法 目前，食管鱗癌CTCs的檢測(cè)方法、研究數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他類型惡性腫瘤。其主要檢測(cè)方法有RT-PCR技術(shù)、免疫磁珠負(fù)性篩策略、Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)和ISET法4種。

2.1.1 RT-PCR技術(shù) RT-PCR技術(shù)是將腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)識(shí)別腫瘤特異性mRNA的表達(dá)。這些特異性mRNA通常在正常外周血中不表達(dá)，因原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞分泌的mRNA進(jìn)入血液后被降解，但據(jù)此可推測(cè)檢測(cè)到的mRNA來(lái)自CTCs的表達(dá)。Cao等[18]以Survivin mRNA為檢測(cè)標(biāo)志物，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)外周血中CTCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin mRNA的檢出率為47.2%，Survivin mRNA表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等明顯相關(guān)；隨訪發(fā)現(xiàn)，Survivin mRNA陽(yáng)性者比陰性者復(fù)發(fā)率更高，生存期更短。表明RT-PCR技術(shù)檢測(cè)外周血CTCs的效能較好。RT-PCR技術(shù)能從(1～10)×106個(gè)正常細(xì)胞中檢測(cè)出1個(gè)腫瘤細(xì)胞，敏感性較高，是檢測(cè)腫瘤隱匿性微轉(zhuǎn)移的有效方法。但目前食管鱗癌CTCs檢測(cè)尚缺少統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)志物。此外，該方法需要破壞腫瘤細(xì)胞，無(wú)法對(duì)CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù)、形態(tài)學(xué)觀察及下游分析，限制了其在CTCs檢測(cè)中的應(yīng)用。

2.1.2 免疫磁珠負(fù)性篩選策略 免疫磁珠是由John Ugelstar等于1979年首先制備出，該方法首先用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，將標(biāo)記抗CD45的Miltineyi納米磁珠與白細(xì)胞結(jié)合，通過(guò)強(qiáng)磁場(chǎng)時(shí)去除白細(xì)胞，富集到外周血稀有細(xì)胞；然后用免疫熒光方法檢測(cè)出抗上皮標(biāo)志CK8/18/19陽(yáng)性、抗白細(xì)胞標(biāo)志CD45陰性和細(xì)胞核DAPI染色陽(yáng)性的細(xì)胞，然后結(jié)合細(xì)胞大小、細(xì)胞核大小和形態(tài)等鑒定出CTCs[19]。任傳利等[20]將免疫磁珠負(fù)性篩選策略與原位雜交技術(shù)結(jié)合，檢測(cè)了11例食管鱗癌患者外周血CTCs，并對(duì)CTCs的8/20號(hào)染色體進(jìn)行熒光原位雜交分析；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTCs的檢出率為43.8%，其中80%的CTCs伴有8/20號(hào)染色體非整倍體的改變；該研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血中可見(jiàn)許多胞膜不完整或完全缺失、但直徑>15 μm的裸核，這些裸核都具有8/20號(hào)染色體的非整倍體改變。說(shuō)明該技術(shù)不但能鑒定具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的CTCs，還可鑒定胞質(zhì)、胞膜不完整或裸核樣CTCs的惡性表型。相比于RT-PCR技術(shù)，免疫磁珠負(fù)性篩選策略的優(yōu)點(diǎn)是可保證被分離靶細(xì)胞的形態(tài)和功能完整。其缺點(diǎn)是磁珠的包被效率受抗原包被質(zhì)量濃度的影響，而該濃度的確定目前尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.3 Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng) Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)是美國(guó)強(qiáng)生公司旗下的Veridex公司開(kāi)發(fā)的，用于腫瘤外周血循環(huán)上皮細(xì)胞的檢測(cè)儀，目前已通過(guò)FDA認(rèn)證，可用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌的檢測(cè)[21～23]。其通過(guò)抗原抗體反應(yīng)捕獲表達(dá)EpCAM的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的富集，將富集的細(xì)胞固定后，通過(guò)熒光標(biāo)記細(xì)胞角蛋白CK8、CK18和CK19抗體，抗原提呈細(xì)胞(APC)標(biāo)記CD45抗體，用4，6-二瞇基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行細(xì)胞核染色后，使用自動(dòng)熒光顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。該系統(tǒng)將CK+、CD45-和DAPI+的細(xì)胞定義為CTCs[24]。

目前關(guān)于Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)檢測(cè)食管鱗癌CTCs的研究較少，檢出率偏低，其原因可能是部分CTCs因發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)而被漏檢。因此，該系統(tǒng)是否適用于食管鱗癌CTCs的檢測(cè)尚存在爭(zhēng)議。Matsushita等[25]研究發(fā)現(xiàn)，CTCs在Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)的檢出率為27.8%，對(duì)部分患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，治療后部分反應(yīng)、疾病穩(wěn)定和疾病進(jìn)展患者分別占45.1%、16.9%和38%，治療后CTCs陽(yáng)性者在疾病進(jìn)展中的占比例明顯高于在部分反應(yīng)中的比例。CTCs表達(dá)水平與患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，治療過(guò)程中CTCs表達(dá)由陽(yáng)性變?yōu)殛幮哉?，其預(yù)后和治療前CTCs陰性者的預(yù)后均較好。表明該系統(tǒng)檢測(cè)的CTCs結(jié)果能有效評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后和放化療療效。Hiraiwa等[26]研究發(fā)現(xiàn)，Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)移性食管癌CTCs的檢出率為13%，患者外周血中CTCs陽(yáng)性率與胸、腹膜轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，將CTCs的cut off值提高到3、4、5或10，二者仍具有明顯相關(guān)性。表明晚期食管鱗癌患者CTCs的檢測(cè)能預(yù)測(cè)腫瘤的胸、腹膜轉(zhuǎn)移。但Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)在食管鱗癌CTCs的檢出率僅為1.6%，故建議臨床上不使用Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)檢測(cè)食管鱗癌患者CTCs，其檢出率較低的原因有待進(jìn)一步研究。

Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)集免疫磁珠富集技術(shù)和免疫熒光技術(shù)于一體，被認(rèn)為是CTCs檢測(cè)技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)；但該系統(tǒng)無(wú)法檢出低表達(dá)或不表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子、非上皮表型及發(fā)生EMT的CTCs。

2.1.4 ISET技術(shù) ISET技術(shù)是一種新型腫瘤細(xì)胞富集技術(shù)，由Vona等[28]在2000年開(kāi)創(chuàng)并最先使用于腫瘤研究領(lǐng)域。ISET技術(shù)不依賴腫瘤相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)CTCs，其檢測(cè)原理是根據(jù)腫瘤細(xì)胞直徑一般大于血細(xì)胞的特點(diǎn)，應(yīng)用納米技術(shù)制作的聚碳酸酯濾過(guò)膜，對(duì)患者外周血進(jìn)行濾過(guò)，腫瘤細(xì)胞因直徑大于濾孔而被吸附在濾膜上；然后對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色，并置于光鏡下觀察，最后根據(jù)CTCs的判定標(biāo)準(zhǔn)鑒別出CTCs。Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)，ISET技術(shù)對(duì)食管鱗癌CTCs的檢出率為32.8%，該研究首次在患者外周血中檢測(cè)到循環(huán)腫瘤微栓(CTM)，通過(guò)免疫熒光技術(shù)在CTM中檢測(cè)到EMT標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其CTCs檢測(cè)結(jié)果與腫瘤病理分期和患者治療前血小板計(jì)數(shù)密切相關(guān)。因此認(rèn)為，ISET技術(shù)檢測(cè)的CTCs結(jié)果可作為食管鱗癌臨床分期的有益補(bǔ)充，并提示食管鱗癌血行轉(zhuǎn)移與血小板增多關(guān)系密切。Bobek等[29]研究發(fā)現(xiàn)，ISET技術(shù)對(duì)食管鱗癌CTCs的檢出率為62.8%，該研究成功分離和培養(yǎng)了食管鱗癌患者的CTCs，為進(jìn)一步分析CTCs的形態(tài)學(xué)特征提供條件。ISET技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，分離后CTCs仍保留活力；缺點(diǎn)是缺乏特異性，一部分直徑更小的腫瘤細(xì)胞存在被漏檢的可能。

2.2 臨床評(píng)價(jià) 目前認(rèn)為，食管鱗癌CTCs可能具有以下兩個(gè)特點(diǎn)：①部分CTCs發(fā)生了EMT；②CTCs及裸核發(fā)生了8/20號(hào)染色體的非整倍體改變。在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的CTCs研究中也存在部分CTCs因發(fā)生了EMT而被Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)漏檢的問(wèn)題，因此該系統(tǒng)并不適于食管鱗癌CTCs的檢測(cè)。RT-PCR技術(shù)破壞了細(xì)胞，無(wú)法對(duì)CTCs的染色體進(jìn)行分析，也不適用于食管鱗癌CTCs的檢測(cè)；免疫磁珠負(fù)性篩選策略和ISET技術(shù)能滿足食管鱗癌CTCs的檢測(cè)，后者比前者操作更簡(jiǎn)便，檢測(cè)費(fèi)用更低，并且分離后CTCs仍可保留活力。綜合考慮，ISET技術(shù)最適用于食管鱗癌CTCs的檢測(cè)。

目前普遍認(rèn)為，食管鱗癌CTCs檢測(cè)在食管鱗癌的早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)估等方面具有重要的臨床意義，尤其是能對(duì)治療效果和患者預(yù)后進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，可使患者獲益最大化。相對(duì)于乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤，目前關(guān)于食管鱗癌CTCs的研究較少；受制于樣本量的限制，該領(lǐng)域尚缺少權(quán)威的研究結(jié)論。

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國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(SQ2016ZY04003762)。

李勝(E-mail： drlisheng@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.033

R735.1

A

1002-266X(2017)08-0099-04

2016-08-15)