黃 莉，樊建剛，韓 亮，馮 勇△

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a.耳鼻咽喉頭頸外科，b.科技部，四川 成都 610072)

嗅覺通路神經(jīng)干細胞研究進展

黃 莉a，樊建剛a，韓 亮b，馮 勇a△

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a.耳鼻咽喉頭頸外科，b.科技部，四川 成都 610072)

干細胞是能自我更新增殖和分化的細胞，能夠產(chǎn)生表現(xiàn)型與基因型和自身相同的子細胞，同時還能分化為祖細胞。神經(jīng)干細胞指來自神經(jīng)系統(tǒng)并可以經(jīng)過自我更新或者不對稱分裂，產(chǎn)生除自身以外的其它細胞，可向特定類型的神經(jīng)元或星形膠質細胞和少突膠質細胞分化[1]。研究發(fā)現(xiàn)，從發(fā)育中甚至成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中，可以分離出具有多潛能干細胞，并能在體外培養(yǎng)成永生的神經(jīng)祖細胞系，這有望成為合適的體外轉基因載體之一，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天性、創(chuàng)傷性和退行性疾病的治療提供新策略。

神經(jīng)干細胞；嗅上皮；嗅球；嗅感覺神經(jīng)細胞

哺乳動物嗅通路中的嗅上皮和嗅球中也存在神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)，嗅上皮和嗅球NSCs的生物學特性已是神經(jīng)科學研究的重點方向。本文對嗅上皮和嗅球NSCs的解剖生理來源及特性進行簡要闡述，為研究嗅上皮和嗅球NSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天性、創(chuàng)傷性和退行性疾病奠定理論基礎。

1 嗅上皮NSCs的來源

脊椎動物的嗅感覺神經(jīng)細胞(olfactory receptor neuron，ORN)可終生再生，新生的ORN由NSCs分化而來。嗅上皮最頂端為支持細胞，其下方為ORN，NSCs分布在嗅上皮基底層。從形態(tài)學劃分，成年小鼠嗅上皮NSCs分為球狀基底細胞(global basal cells，GBCs)和水平狀基底細胞(horizontal basal cells，HBCs)，其中HBCs緊貼在基底膜上，而GBCs位于HBCs上方。研究發(fā)現(xiàn)，通常ORN的再生由GBCs完成，外源性轉化生長因子-B(TGF-B)及血小板衍化生長因子(PDGF)等可通過程序性調控誘導GBCs向神經(jīng)元轉化；只有在嗅上皮嚴重受損情況下，HBCs才活化增殖，并最終分化為嗅上皮的各種細胞成分[2]。

在基底細胞分裂慢速階段，基底細胞分裂產(chǎn)生另一個位于基底膜附近的干細胞和一個神經(jīng)前體細胞，這個神經(jīng)前體細胞最后生成大量未成熟神經(jīng)元，并在分化過程中從基底膜向嗅上皮表面移行[3]，伴隨這一過程同時進行的是成熟嗅上皮中的神經(jīng)細胞凋亡[4]。由此可見，哺乳動物嗅上皮處于基底細胞生成、神經(jīng)細胞分化、基底細胞和神經(jīng)細胞凋亡的動態(tài)平衡中，這種平衡可能是由自分泌和旁分泌信號參與調控，從而最終刺激或抑制增殖[5]。其中，神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)參與調節(jié)成熟ORN凋亡及增加前體細胞增殖；而生長和分化因子II (GDFII)抑制神經(jīng)前體細胞轉化為神經(jīng)細胞[6]。

2 嗅上皮NSCs的培養(yǎng)

嗅上皮NSCs可通過自體取材獲得，并能通過體外培養(yǎng)進行擴增。研究證實，采用無血清、非神經(jīng)細胞培養(yǎng)方法可從嗅上皮分離培養(yǎng)出三種細胞，包括球形基底細胞、水平基底細胞及少量的支持細胞，并且體外培養(yǎng)的嗅上皮神經(jīng)干細胞具有多向分化潛能。

在NSCs分離培養(yǎng)的研究中，酶消化法(如膠原酶、透明質酸酶、胰蛋白酶等)和機械分離法都可以用來分離NSCs。高亮等[7]通過不同消化酶(如中性蛋白酶和I型膠原酶)分階段酶解消化嗅上皮，可以原代富集到純度較高的嗅上皮NSCs(呈集落狀生長)，進行細胞擴增后，用含生長因子(bFGF)的無血清培養(yǎng)液促使傳代細胞增殖形成神經(jīng)球，通過血清誘導神經(jīng)球分化，可維持嗅上皮NSCs的增殖活力和多潛能性，表現(xiàn)為從神經(jīng)球遷移出的分化細胞具有很高異質性，高亮通過免疫細胞化學染色發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球細胞具有向神經(jīng)元、星形膠質細胞和寡突膠前體細胞分化的潛能。目前，對于誘導嗅上皮NSCs向特定種類的細胞分化(如向多巴胺能神經(jīng)元分化)所需的條件，仍有待于進一步研究。另外，有些理論認為，由于酶消化法可以部分破壞細胞存活所需的細胞表面粘附分子和細胞基質等成分，并且胰蛋白酶殘留可能會影響細胞的生長，所以推崇采用機械分離法來制備單細胞懸液，這樣能夠提高分離的活細胞率，并且形成較多的細胞球。

Mumm等[8]采用無血清培養(yǎng)方法從胚胎小鼠嗅上皮培養(yǎng)出神經(jīng)克隆形成細胞，并最終分化為神經(jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中，必須有來自嗅上皮底層基質的細胞共培養(yǎng)，才能形成可分化為神經(jīng)元的神經(jīng)克隆，而與分化成熟的嗅上皮神經(jīng)元共培養(yǎng)時，神經(jīng)克隆形成數(shù)量明顯減少，這表明嗅上皮底層基質中的細胞可能分泌促進神經(jīng)克隆形成的某些因子，而分化成熟的神經(jīng)元對神經(jīng)克隆的形成有反饋抑制作用，這與前文研究發(fā)現(xiàn)一致[4]。Roisen等[9]用DMEM /F12 (1：1)和10%胎牛血清的培養(yǎng)液，從成人嗅上皮分離培養(yǎng)出可以形成神經(jīng)球并具有自我更新能力，向神經(jīng)元、膠質細胞多向分化潛能的NSCs。Othman等[10]采用神經(jīng)球培養(yǎng)方法從硫酸鋅刺激后的綠色熒光蛋白(GFP)轉基因小鼠嗅上皮中分離培養(yǎng)出nestin免疫反應陽性NSCs，可直接用于創(chuàng)傷性和退行性中樞神經(jīng)疾病的NSCs移植治療研究。

嗅覺系統(tǒng)中存在許多與內耳發(fā)生發(fā)展有關聯(lián)的基因，如neurog1、neurod1及foxg1[11]。朱秋蓓等[12]通過體外原代及傳代培養(yǎng)大鼠嗅上皮NSCs，獲得具有多分化潛能的神經(jīng)干細胞球，將嗅上皮NSCs與體外培養(yǎng)的毛細胞或耳蝸培養(yǎng)液共培養(yǎng)，誘導嗅上皮NSCs分化為耳蝸毛細胞。Doyle等[13]報道了嗅上皮神經(jīng)前體細胞同耳蝸細胞共培養(yǎng)，或用耳蝸細胞的條件培養(yǎng)液誘導的方法，在體外誘導嗅上皮神經(jīng)前體細胞分化形成耳蝸毛細胞，分化的細胞在形態(tài)上與毛細胞相似并表達多種毛細胞的標志分子，包括 myosinVIIa、FM1-43、calretinin、phal-loidin和espin，以上均為探索嗅上皮NSCs治療毛細胞損傷所致的感音神經(jīng)性耳聾提供了理論依據(jù)。Murrell等[14]則在不同培養(yǎng)條件中將成體嗅上皮NSCs定向誘導分化為肝細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞。

3 嗅球NSCs的來源

嗅球最外層為嗅神經(jīng)層，由ORNs的軸突及鞘細胞組成。ORNs的軸突在嗅球內側的小球層與二級神經(jīng)元僧帽和簇狀細胞的樹突形成突觸。小球層周圍為由中間神經(jīng)元組成的小球周圍細胞。小球層的內側是外叢層，由簇狀細胞體及樹突、僧帽細胞和顆粒細胞的樹突組成，其內側為僧帽細胞層。內叢層主要由僧帽細胞和簇狀細胞的軸突、顆粒細胞的樹突組成，其由側為顆粒細胞層，包含顆粒細胞體及嗅球的第二型中間神經(jīng)元。嗅球的中央是由吻側遷移流(RMS)向前延伸的室管膜下層，內含由側腦室的室下區(qū)(SVZ)產(chǎn)生的NSCs。室管膜下層中的生成嗅球中的中間神經(jīng)元、顆粒細胞和小球周圍細胞[15]。

嚙齒動物出生后，顆粒細胞層中及小球層周圍的中間神經(jīng)元由來自SVZ，經(jīng)RMS遷移到嗅球的NSCs生成。腦室周圍區(qū)域產(chǎn)生的NSCs在未知因素作用下經(jīng)RMS遷移至嗅球的室管膜下層，疏散進入嗅球的顆粒細胞層和小球周圍區(qū)域并分化成為中間神經(jīng)元[16]，即嗅球的顆粒細胞層和小球周圍NSCs負責出生后嗅球的神經(jīng)發(fā)生[17]。研究表明，嗅球自身也存在NSCs，且大部分分化為膠質細胞；而來自RMS的NSCs多數(shù)分化為神經(jīng)元[18]。

4 嗅球NSCs的培養(yǎng)

嗅球內富含NSCs，取材簡便，細胞獲得率高，并且在體外培養(yǎng)時顯示出向神經(jīng)細胞及非神經(jīng)細胞的多向分化潛能，是NSCs自體移植最理想的取材部位。Pagano等[19]首先采用無血清神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)方法從人嗅球成功分離培養(yǎng)出具有自我更新并能分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞及少突膠質細胞的NSCs。在無血清培養(yǎng)基中去除生長因子后，由于營養(yǎng)供給及細胞因子受體活性發(fā)生改變，使得嗅球NSCs由分裂增殖狀態(tài)過渡到分化狀態(tài)。另外發(fā)現(xiàn)，無血清誘導下，嗅球NSCS更多地分化為神經(jīng)元，而有血清培養(yǎng)如胎牛血清，有助于嗅球NSCS更多的向星形膠質細胞和少突膠質細胞分化，并且血清濃度與膠質細胞的分化程度成正比關系。研究還發(fā)現(xiàn)，嗅球NSCs增殖分化特性在不同發(fā)育階段存在一定的差異：隨著發(fā)育階段的增長，形成神經(jīng)球的細胞數(shù)量減少，神經(jīng)元分化趨勢逐漸減少。在個體發(fā)育不同階段中，嗅球NSCs的生物學特性出現(xiàn)差異，導致嗅球NSCs增殖分化特性發(fā)育差異的機制和意義，應當是進一步研究的重點。

鑒于NSCs的培養(yǎng)與其它神經(jīng)細胞不同，研究者為了維持其干細胞特點，需要特殊的培養(yǎng)條件來保證NSCs的分裂增殖并抑制細胞分化，所以NSCs的培養(yǎng)需要添加生長因子(如bFGF/EGF等)。郭向東等[20]采用神經(jīng)細胞球形成法，以無血清培養(yǎng)液，使用生長因子(bFGF/EGF)進行大鼠嗅球NSCs體外擴增培養(yǎng)，以機械分離法連續(xù)傳代，運用相差顯微鏡及電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)，通過免疫細胞化學法檢測Nestin表達，運用四甲基偶氮哇鹽(MTI)，比色法和流式細胞儀檢測嗅球NSCs的增殖能力。研究證實[20]，NSCs在體內的發(fā)育依賴于多種生長因子(如IGF-I和BDNF)的作用。其中，IGF-I是一種促生長肽類激素(growth promoting peptide hormone)，有神經(jīng)營養(yǎng)特性；BDNF是第2種被鑒定的神經(jīng)營養(yǎng)素，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達[21]，是腦內分布最廣的神經(jīng)營養(yǎng)因子。IGF-I可以通過靶細胞表面的特異性受體來促進嗅球源性NSCs增殖和分化；而BDNF對嗅球源性NSCS的增殖分化不起主導作用，但BDNF可增強IGF-I的作用[22]。更多地認識細胞因子在嗅球NSCs增殖分化過程中的作用，將有助于我們深入了解嗅球NSCs增殖分化的分子生物學機制，提高我們控制嗅球NSCs向特定功能神經(jīng)細胞定向分化的精確度，對將來NSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病意義重大。

5 NSCs應用

5.1細胞替代治療指在將體外培養(yǎng)和擴增的NSCs移植到腦內，治療因細胞死亡或凋亡引起的疾病，如帕金森氏病、Huntington病、神經(jīng)性耳聾等[23]。目前，細胞替代實驗的開展主要分為以下三個思路：①內源性NSCs的自身激活。然而，研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷導致內源性NSCs的增殖產(chǎn)生的幾乎全是膠質細胞[24]，所以，內源性NSCs的自身激活有效率不高，而NSCs移植仍然是最可行的神經(jīng)組織替代治療策略；②異體NSCs移植。體外培養(yǎng)的NSCs移植到腦內后能夠遷移分化為特定部位的神經(jīng)細胞，這些分化后的神經(jīng)細胞能很好地整合于宿主組織，與其它神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系，分泌神經(jīng)遞質并發(fā)揮功能。陳福權等[25]采用細胞培養(yǎng)、基因轉染及細胞移植的方法，分別從從胚胎、新生及成年大鼠嗅球分離培養(yǎng)NSCs，將攜帶報告基因增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的新生大鼠嗅球NSCs移植至正常成年大鼠耳蝸，結果表明植入耳蝸的NSCs可存活數(shù)周，主要分化為星形膠質細胞，遷移至螺旋神經(jīng)節(jié)及其周圍突區(qū)域，可主動產(chǎn)生分泌GDNF及NGF。研究表明，NSCs可能替代缺失或損傷的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞，并對內耳毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞有營養(yǎng)支持作用。龐飛等[26]制備大鼠下胸段脊髓打擊損傷模型，將嗅粘膜來源神經(jīng)干細胞(BMSCs)和骨髓間充質干細胞(OM-NSCs)聯(lián)合移植，免疫熒光顯示移植的BMSCs和OM-NSCs均能遷移至脊髓損傷區(qū)，并在損傷區(qū)存活。但是，關于異體NSCs移植治療策略，有兩點需要注意：①移植NSCs細胞的分化方向和功能是由其所處的微環(huán)境而不是NSCs自身內在特性決定；②分化效率偏低，如Vescovi等[27]在研究NSCs細胞移植治療帕金森氏病時發(fā)現(xiàn)，在體外實驗中沒有必須的因素干預下，自然分化為多巴胺能神經(jīng)元的比例只占細胞總數(shù)的0.5%～5%。因此，如何精確調控干細胞分化效率成為研究重點；③自體NSCs移植。Pagano等[28]首次將嗅球切除術患者的嗅球組織進行體外分離培養(yǎng)NSCs并獲得成功，并建立了“嗅球干細胞系”，為NSCs自體移植的細胞來源提供了初步探索。

5.2基因/藥物治療載體鑒于很多有治療作用的大分子物質如神經(jīng)生長因子、腦源性生長因子等都不能通過血腦屏障，NSCs作為基因/藥物治療載體，具有遷徙能力，可以整合于宿主組織，能分化為成熟細胞修復病損組織并且可以避免免疫排斥反應的特點，為治療一些CNS疾病開辟了新途徑。動物實驗表明[29]，通過轉基因技術，將編碼神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因片段導入NSCs中，移植到腦內后，NSCs能遷移并整合于病變部位，長時間表達如神經(jīng)生長因子、白介素-4、活性酶和神經(jīng)遞質等外源基因產(chǎn)物，并不同程度改善動物疾病模型的癥狀或抑制腫瘤生長，延長動物生存時間。已有報道，用逆轉錄病毒介導的B-葡萄糖醛酸酶基因轉染NSCs，再將其注入MPSVII新生鼠腦內，結果發(fā)現(xiàn)治療組小鼠行為及神經(jīng)功能均恢復正常，并且病理分析發(fā)現(xiàn)移植的細胞己經(jīng)彌散到全腦[30]。

6 展望

嗅球和嗅上皮終生維持活躍的神經(jīng)細胞更新，并且取材簡便，是目前獲取NSCs的重要模型，也是自體NSCs移植的可靠來源。目前，我們對于嗅覺通路NSCs生長特性、分化機制的了解仍不全面，需進一步探討。

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Research progress on the olfactoryneural stem cells

HUANG Li，F(xiàn)AN Jian-gang，HAN Liang，F(xiàn)ENG Yong

四川省科技廳科技支撐計劃項目(編號：2014SZ0051)

R329

B

1672-6170(2017)05-0249-04

2017-04-13；

2017-05-26)

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