趙 佳，聶園軍，黃 靜，陳 哲，梁 宏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

轉(zhuǎn)基因作物影響土壤微生物群落多樣性的研究

趙 佳，聶園軍，黃 靜，陳 哲，梁 宏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高作物抗逆性、增加糧食產(chǎn)量方面貢獻(xiàn)卓越的同時(shí)，對(duì)包括土壤微生物群落在內(nèi)的土壤生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估一直存在爭議。大多數(shù)研究表明，轉(zhuǎn)基因作物的種植會(huì)引起土壤微生物群落多樣性的變化，但其對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響程度、持續(xù)作用時(shí)間等都沒有定論。綜述了外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入作物根際的方式與不同類型外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響；并對(duì)轉(zhuǎn)基因作物影響土壤微生物群落的研究手段進(jìn)行了討論，提出了下一步的研究策略。

轉(zhuǎn)基因；土壤微生物群落；高通量測(cè)序

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域快速發(fā)展，目前全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積高達(dá)1.5億hm2，我國的種植面積為400萬hm2[1]。一方面轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高作物抗逆性、增加糧食產(chǎn)量上貢獻(xiàn)卓越；另一方面轉(zhuǎn)基因作物大面積種植對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)可能的影響也一直存在爭議，這就使得轉(zhuǎn)基因作物釋放后的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估尤為重要[2]。2000年，美國EPA將轉(zhuǎn)基因作物對(duì)包括土壤微生物在內(nèi)的土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響列為轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要組成部分。

土壤微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，主導(dǎo)土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量交換等生化進(jìn)程。微生物群落多樣性的變化是評(píng)價(jià)土壤生態(tài)環(huán)境的重要生物學(xué)指標(biāo)[3]。一般情況下，游離的DNA片段進(jìn)入土壤后很快就會(huì)被微生物所分泌的核酸酶所降解，但一部分DNA卻能與土壤中的黏粒和腐植酸等物質(zhì)結(jié)合而變的難以降解，其在土壤環(huán)境中的存留時(shí)間超乎想像[4-5]。HOFFMAN等[6]在幾種轉(zhuǎn)基因作物中發(fā)現(xiàn)，抗抗生素基因（hpt）可通過進(jìn)入土壤的殘枝落葉，轉(zhuǎn)移到與植株存在共生關(guān)系的一種黑曲霉中。另一方面，因外源基因?qū)胍鹱魑锔捣置谖锝M分發(fā)生變化，也可能對(duì)土壤微生物群落多樣性產(chǎn)生影響。目前學(xué)界對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物是否影響土壤微生物群落安全性的爭議較大，因此，研究其對(duì)于土壤微生物群落多樣性的影響有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

筆者綜述了外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入作物根際的方式與不同類型外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響，并提出了可能的研究策略，為轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)安全性評(píng)價(jià)提供思路。

1 外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入作物根際的方式

轉(zhuǎn)基因作物的外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入土壤后，可能會(huì)對(duì)作物根際微生物群落產(chǎn)生影響。目前，轉(zhuǎn)基因作物的外源基因及基因表達(dá)產(chǎn)物主要通過以下幾種方式進(jìn)入土壤中：一是通過作物根系的分泌作用。作物的根系分泌物會(huì)改變土壤的理化性質(zhì)，對(duì)根際生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生巨大影響。外源基因的導(dǎo)入及表達(dá)會(huì)影響作物根系分泌物的組成，進(jìn)而改變根際微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。如王建武等[7]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因作物分泌的毒蛋白在根際還保有活性并能不斷累積，它直接作用于根際微生物，可改變其群落結(jié)構(gòu)，影響整個(gè)土壤生態(tài)系統(tǒng)。二是通過作物的殘茬。隨著作物秸稈還田的大規(guī)模推廣應(yīng)用，通過殘茬進(jìn)入土壤成為外源基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入根際的最主要渠道。姚艷玲等[8]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Cry1Ab基因高粱秸稈還田過程中，其表達(dá)產(chǎn)物在土壤中的降解周期為67 d。三是通過花粉擴(kuò)散。轉(zhuǎn)基因作物花粉的擴(kuò)散是外源基因逃逸的方式之一[9]。

2 外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響

2.1 抗蟲基因?qū)ν寥牢⑸锶郝涠鄻有缘挠绊?/h3>

轉(zhuǎn)基因作物使用的代表性抗蟲基因是Bt殺蟲蛋白基因，它是是目前應(yīng)用最為廣泛、商業(yè)價(jià)值最高的毒蛋白基因，轉(zhuǎn)入該基因的作物能夠合成一種對(duì)昆蟲有毒的Bt毒蛋白而發(fā)揮作用。鄒雨坤等[10]研究了種植轉(zhuǎn)Bt基因玉米對(duì)其根際微生物群落的影響，結(jié)果表明，厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門等是轉(zhuǎn)基因玉米與正常親本根際的共有微生物，其群落結(jié)構(gòu)相似性高；種植1 a轉(zhuǎn)Bt基因玉米對(duì)其根際微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著影響。WU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在含有Cry1Ab基因和非轉(zhuǎn)基因水稻品系的根際土壤中，放線菌和真菌兩大類群在數(shù)量上沒有顯著差異，而細(xì)菌類群中的氨氧化菌、纖維素降解菌和固氮菌于試驗(yàn)中期在數(shù)量上有顯著但短暫的差異。但是，CASTALDINI等[12]研究發(fā)現(xiàn)，含有Bt基因玉米品系（Bt11和Bt176）和正常玉米的土壤根際微生物群落多樣性存在巨大而持久的差異，尤其是叢枝菌根真菌的數(shù)量顯著降低。以上研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)抗蟲基因?qū)ψ魑锔H微生物群落多樣性是否有影響目前還沒有定論。

2.2 抗病基因?qū)ν寥牢⑸锶郝涠鄻有缘挠绊?/h3>

目前，轉(zhuǎn)抗病基因主要分為抗菌蛋白基因與系統(tǒng)獲得抗性（SAR）相關(guān)基因兩大類，通過導(dǎo)入這些相關(guān)抗病基因已經(jīng)得到許多對(duì)作物病原微生物具有穩(wěn)定抗性的轉(zhuǎn)基因品種[13]。溶菌酶可降解微生物的細(xì)胞膜，對(duì)大多數(shù)細(xì)菌有效。AHRENHOLTZ等[14]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)T4溶菌酶基因馬鈴薯品系與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾龋涓祵?duì)枯草芽孢桿菌的殺死活性高1.5～3.5倍，轉(zhuǎn)基因品系抑菌效果顯著。SESSITSCH等[15]研究了轉(zhuǎn)抗菌肽基因的馬鈴薯對(duì)非靶標(biāo)土壤微生物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯相比，在開花期能對(duì)土壤中的芽孢桿菌屬細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著而暫時(shí)影響，但在塊莖形成期二者間的芽孢桿菌屬細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)存在高度相似性。系統(tǒng)獲得抗性的啟動(dòng)需要信號(hào)分子水楊酸（SA）的累積，MEDINA等[16]研究發(fā)現(xiàn)，含有NahG基因煙草與水楊酸含量呈負(fù)相關(guān)，而含有CSA基因煙草與水楊酸含量呈負(fù)相關(guān)，叢枝菌根真菌在含NahG基因煙草生長早期數(shù)量上升，而在含有CSA基因煙草的根際數(shù)量下降；但在煙草生長后期二者與非轉(zhuǎn)基因煙草根際的叢枝菌根真菌差別都不大。

2.3 抗除草劑基因?qū)ν寥牢⑸锶郝涠鄻有缘挠绊?/h3>

含有抗除草劑基因的作物對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響近來受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。SICILIANO等[17-18]結(jié)合微生物群落水平多樣性（CLPP）、脂肪酸甲基酯（FAME）與末端限制性酶切片段長度多態(tài)性（TARDRA）3種技術(shù)研究了不同時(shí)期轉(zhuǎn)抗草甘膦油菜對(duì)根際微生物的影響。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因油菜相比，在生長季土壤微生物群落中的黃桿菌屬與假單胞菌屬數(shù)量上升，而芽孢桿菌屬、微球菌屬和貪噬菌屬數(shù)量下降；但是在冬季，二者間的土壤微生物群落多樣性不存在顯著差異。這說明轉(zhuǎn)抗草甘膦基因與非轉(zhuǎn)基因油菜品系根際微生物群落間的差異是暫時(shí)的且隨季節(jié)變化而消除。

3 轉(zhuǎn)基因作物影響土壤微生物群落的研究手段

土壤中可培養(yǎng)微生物在數(shù)量上僅占總微生物量的0.1%～1%，而傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法僅能分離到可培養(yǎng)微生物，不可培養(yǎng)微生物的研究處于空白[19-20]。近年來，新的分子生物學(xué)研究方法不斷取得突破，避開微生物的分離培養(yǎng)，直接對(duì)土壤中總微生物進(jìn)行研究成為學(xué)者們的主要研究策略。

3.1 Biolog微平板分析方法

Biolog微平板反應(yīng)系統(tǒng)是基于菌種不同的單一碳源利用能力上的差異來研究微生物種群功能多樣性的。陸英等[21]利用Biolog微平板系統(tǒng)研究了轉(zhuǎn)Gus-NPTⅡ基因香蕉對(duì)其根際土壤微生物群落的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照非轉(zhuǎn)基因香蕉植株根際土壤微生物群落相比，其土壤微生物在AWCD變化曲線和微生物群落5種主要指數(shù)上均不存在顯著差異。王麗娟等[22]從大田中取樣，利用Biolog技術(shù)比較了2種轉(zhuǎn)基因大豆（PAT，ALS）與其非轉(zhuǎn)基因親本（PAT1，ALS1）及當(dāng)?shù)刂髟云贩N（中黃 13）對(duì)根際土壤微生物群落多樣性的影響，結(jié)果表明，多糖類、氨基酸與羧酸聚合物為微生物利用的主要碳源物質(zhì)，從根際微生物活性來看，轉(zhuǎn)基因大豆（PAT，ALS）活性最高，中黃13次之，非轉(zhuǎn)基因大豆親本（PAT1，ALS1）最低。Biolog微平板分析方法相較于其他方法具有檢測(cè)周期短、操作簡便和成本低廉等優(yōu)勢(shì)，但其只能反映微生物群落整體的豐富度，而無法獲得群落中具體微生物類群的相對(duì)含量，有一定的局限性。

3.2 磷脂脂肪酸分析方法

微生物細(xì)胞壁或膜上存在一些特異性的化合物可以作為該物種的標(biāo)記物，磷脂脂肪酸（PLFAs）分析法就是利用這些特異性標(biāo)記物研究微生物群落多樣性，這種方法直接提取微生物群落的脂肪酸而不需要進(jìn)行菌的培養(yǎng)，將分析結(jié)果與相關(guān)數(shù)據(jù)庫結(jié)合比對(duì)，可直觀地反映根際微生物群落的結(jié)構(gòu)、組成和生物量等信息[23]。劉微等[24]利用PLFAs對(duì)比分析轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)基因親本對(duì)根際微生物群落多樣性的影響區(qū)別。他們利用PLFAs分析了各種脂肪酸含量發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻根際均以飽和脂肪酸、支鏈脂肪酸為主；在苗期、拔節(jié)期和抽穗期，與非轉(zhuǎn)基因親本相比，轉(zhuǎn)基因水稻根際微生物群落中革蘭氏陽性菌的磷脂脂肪酸含量低于革蘭氏陰性菌，說明其根際微生物群落結(jié)構(gòu)相較于非轉(zhuǎn)基因親本發(fā)生了改變；成熟期2種水稻根際微生物群落差別不大。綜合分析水稻各生育期，轉(zhuǎn)Bt基因水稻未對(duì)根際微生物群落的磷脂脂肪酸含量造成顯著影響。PLFAs分析法可直觀反映微生物群落中不可培養(yǎng)微生物的結(jié)構(gòu)情況，擴(kuò)展了微生物群落的研究范圍，成為現(xiàn)階段的主流分析方法。

3.3 高通量測(cè)序分析法

從根際土壤中直接提取微生物的總基因組DNA并進(jìn)行高通量測(cè)序分析是近年來土壤微生物群落多樣性研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)逐漸取代變形梯度凝膠電泳（DGGE）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（RAPD）和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）等分子生物學(xué)技術(shù)[25]。這種技術(shù)是以微生物群落基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新型微生物群落研究方法[26]。SHEN等[27]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了連續(xù)2 a施用生物有機(jī)肥（BIO）、糞肥（PM）和化肥（CF）3種不同處理的香蕉根際微生物群落差異和枯萎病的發(fā)生情況，結(jié)果表明，相比于PM和CF，施用2 a BIO后香蕉根際細(xì)菌群落多樣性上升，真菌群落多樣性下降；群落中酸桿菌門、厚壁菌門等菌群相對(duì)豐度提高，而子囊菌門相對(duì)豐度降低；3種處理的根際微生物群落多樣性差異顯著。高通量測(cè)序法可在門、綱、目、科、屬等不同分類地位下明晰各類群的相對(duì)含量，使長期檢測(cè)某些微生物類群的動(dòng)態(tài)演替變化成為可能，是轉(zhuǎn)基因作物影響土壤微生物群落研究領(lǐng)域新的突破點(diǎn)。

4 存在的問題與展望

土壤根際微生物群落在土壤生態(tài)系統(tǒng)中居于核心地位，是反映土壤根際微生態(tài)變化的重要指標(biāo)。有關(guān)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物群落多樣性影響的研究報(bào)道很多，但是這些研究結(jié)果差異較大。有研究認(rèn)為，與非轉(zhuǎn)基因作物相比，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤根際微生物群落多樣性影響不顯著，即使有也遠(yuǎn)小于壤質(zhì)類型、地域分布、作物種類、栽培管理方式和季節(jié)交替變化等因素產(chǎn)生的影響；但另一些學(xué)者認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物尤其是根際促生菌、病原菌、菌根真菌等群落有顯著影響。造成這種爭議的原因是人們的研究還不夠深入，土壤微生物學(xué)的研究方法還是以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定為主，存在很大的局限性[28-29]。這說明對(duì)土壤微生物群落組成與功能間的互作關(guān)系、土壤微生物群落多樣性對(duì)于因季節(jié)、耕作等原因造成的正常波動(dòng)和轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物群落多樣性影響的程度與風(fēng)險(xiǎn)間的界限等問題還有待進(jìn)一步深入的研究[30]。土壤微生物群落高通量測(cè)序的基因組DNA序列信息可由MOTHER和QIIME等軟件進(jìn)行多組樣本間的差異分析，由種屬熱圖和柱狀比例圖等可視化數(shù)據(jù)直接得到組間不同微生物類群（精確到屬水平）的相對(duì)豐度差異，直觀顯示差異位點(diǎn)。今后利用土壤微生物群落高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行多季節(jié)、長時(shí)間的跟蹤檢測(cè)，可更準(zhǔn)確地為轉(zhuǎn)基因作物土壤微生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

轉(zhuǎn)基因作物在釋放和商業(yè)化種植前，必須進(jìn)行土壤微生態(tài)環(huán)境的監(jiān)測(cè)，即使未來大規(guī)模種植后，仍應(yīng)進(jìn)行長期的安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。尤其是對(duì)不同類型的基因和不同作物品種，應(yīng)該采取個(gè)例分析原則來長期定點(diǎn)、定位檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因作物生態(tài)安全性研究任重而道遠(yuǎn)，眼前的爭論是我們研究的動(dòng)力。隨著技術(shù)手段的不斷更新，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物種植的利弊會(huì)有愈來愈清晰的認(rèn)識(shí)，并做出正確的判斷。

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Study on Effects of Transgenic Crops on Soil Microbial Community Diversity

ZHAO Jia，NIE Yuanjun，HUANG Jing，CHENZhe，LIANG Hong
（Research Center of Biotechnology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Transgenic technology plays an important role on improving crops resistance and increasing food production,but the risk assessment about transgenic crops on soil ecosystem in which microorganisms are involved has been controversial.Most studies showed that transgenic crops could affect the soil microbial community diversity.However,the degree and time of the affected were not settled yet.This paper summarized the ways which the exogenous gene and their expression products entered crop rhizosphere and the effects of different transgenic crops on soil microbial community diversity.And it discussed the research technologies about the effects and proposed strategy of the future.

transgene;soil microbial community;high-throughput sequencing

S154.3

A

1002-2481（2017）10-1702-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.10.31

2017-04-17

山西省科技自主創(chuàng)新能力提升項(xiàng)目（2015zzcx-22）；國家轉(zhuǎn)基因作物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2013ZX08003-001）

趙 佳（1983-），男，山西太原人，助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)田土壤微生物資源與利用研究工作。梁 宏為通信作者。