梁 健, 高 山, 李永仁, 殷 瀟, 劉金橋, 郭永軍, 閆喜武

(1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院, 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室, 天津 300384; 2. 大連海洋大學(xué), 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116023)

海洋吸收空氣中的二氧化碳形成碳酸, 增加海水的酸度, 這種現(xiàn)象稱為海洋酸化[1]。這是由Caldeira等[2]于2003年首次提出, 得到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注, 成為當(dāng)今國際海洋科學(xué)研究前沿領(lǐng)域的重要方向。同工業(yè)革命前的水平相比, 目前海洋的 pH降低0.1個單位, 據(jù)預(yù)測到 21世紀(jì)末期將持續(xù)降低0.3至0.5個單位, 到2300年大氣中增加的CO2濃度將會引起 pH 降低0.7個單位[1]。海洋酸化對海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡產(chǎn)生重大的影響, 可能導(dǎo)致物種組成(珊瑚、貝類、棘皮動物、甲殼動物和魚類等)發(fā)生變化。貝類作為主要的鈣化生物, 是近年來研究海洋酸化對生態(tài)系統(tǒng)的影響的主要對象。

貝類相對低等, 不能完成特異性免疫, 只能依靠血細(xì)胞完成非特異性免疫。貝類的非特異性免疫較為完善, 包括細(xì)胞免疫和體液免疫。細(xì)胞免疫的主要承擔(dān)者是血淋巴細(xì)胞, 參與了機(jī)體損傷的修復(fù)、貝殼的重建、吞噬異物顆粒和消除有毒物質(zhì)等過程[3]。體液免疫的手段主要包括由血淋巴細(xì)胞分泌的各種水解酶類、非特異的抗菌膚類、高等動物細(xì)胞因子類似物、調(diào)理素和凝集素等[4]。

青蛤(Cyclina sinensis), 別稱赤嘴仔, 屬軟體動物門、雙殼綱、簾蛤目, 是我國沿海灘涂重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一。其味道鮮美, 營養(yǎng)價值高、生長快速、濾水效果好、抗逆性強(qiáng)、耐鹽范圍廣(8~37, 最適 15~25)、耐堿能力強(qiáng)(0~40 mmol/L)等特點, 深得沿海貝類養(yǎng)殖者的青睞, 形成較大規(guī)模的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。本實驗以通過設(shè)定兩組低pH條件(pH 7.7和pH 7.4)的酸化海水組, 并以正常海水pH做為對照, 探究酸化對青蛤免疫指標(biāo)的影響, 從免疫學(xué)角度評估酸化對青蛤所造成的影響程度, 對預(yù)測青蛤養(yǎng)殖業(yè)和物種本身的未來發(fā)展趨勢提供一定的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

青蛤取自天津獨流減河河口, 個體健康、大小相似, 平均殼長34.13 mm±0.61 mm (n=400)。在室內(nèi)暫養(yǎng) 7 d后進(jìn)行實驗, 養(yǎng)殖用水為砂濾海水, 鹽度 25,溫度25~28, ℃暫養(yǎng)期間連續(xù)充氧, 每天全量換水1次, 投喂小球藻。暫養(yǎng)后選擇閉殼能力強(qiáng)、反應(yīng)迅速的個體作為試驗用貝。

1.2　酸化條件的建立

通過像水體中通入 CO2的方法來模擬海洋酸化的過程。使用氣體質(zhì)量流量控制器和積算儀(七星華創(chuàng)電子股份有限公司)精確控制 CO2通入量, 維持養(yǎng)殖水槽(400 L)中海水pH值在所設(shè)定的范圍內(nèi)。實驗所用水槽均配有獨立的循環(huán)過濾系統(tǒng)以達(dá)到去除糞便、降低氨氮和凈化水質(zhì), 并加有充氣設(shè)備。CO2通過水族缸使用的氣體細(xì)化器充入海水中, 溶解充分提高酸化效率。

1.3　實驗方法

建立酸化實驗組以模擬 2100年和 2300年海洋所達(dá)到的海水pH (分別為7.7、7.4)[1], 并以正常海水作為實驗對照組(pH 8.1)。各實驗組放置青蛤120枚,每天3次測量各實驗組的 pH值、溶解氧 DO、鹽度、溫度, 并根據(jù)實際測得數(shù)值調(diào)整 CO2通入量,保證酸化實驗組的pH正負(fù)偏差不超過0.1。試驗期間投喂小球藻、等鞭金藻、新月菱形藻, 投喂后再次調(diào)整 pH。每兩天換水四分之一, 及時挑出死亡個體并記錄。

1.4　血淋巴液的制備

在酸化的第0、7、14、21、28 天, 從各實驗組隨機(jī)選取15枚青蛤, 用1 mL針管從閉殼肌處抽取血淋巴液, 將 5個青蛤的血淋巴液混合作為一個測定樣品放入 2.5 mL離心管中, 置于冰上保存, 待后面指標(biāo)的測定。

1.5　指標(biāo)測定方法

血細(xì)胞總數(shù)的測定采用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行測定。稀釋液為貝類生理鹽水, 配方: 0.02 mol/L HEPES,0.4 mol/L NaCl, 0.1 mol/L MgSO4, 0.01 mol/L KCl,0.01 mol/L CaCl2, 調(diào)節(jié)pH為7.4。

酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化氫酶(CAT)、戊二醛(MDA)、溶菌酶活性均采用南京建成生產(chǎn)的檢測試劑盒, 參照隨之附送的各使用說明書進(jìn)行操作。

1.6　數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用單因子方差分析法(one-way ANOVA)進(jìn)行方差分析, 運用 Duncan test對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗, 顯著性水平為P < 0.05。

2　結(jié)果

2.1　海水溫度、鹽度、溶解氧和pH

為盡量減少其他環(huán)境因子對結(jié)果的影響, 本試驗維持海水溫度和鹽度在較小的變化范圍內(nèi)。圖 1表明, 在酸化期間海水溫度整體范圍保持在 26~31℃, 鹽度保持在25。

圖1　海水溫度和鹽度變化Fig. 1 Changes in seawater temperature and salinity

圖 2所示整個試驗期間溶解氧含量均保持在較高水平, 三實驗組的溶解氧含量范圍均在(7.4±0.3) mg/L~(8.5±0.5)mg/L, 能夠保證青蛤正常生理活動的耗氧需求。

圖2 實驗期間各組海水溶氧Fig. 2 Variation of dissolved oxygen in each group

圖3所示對照組在第0 ~14 d時pH波動較大, 隨后逐漸趨于穩(wěn)定。兩實驗組維持在實驗設(shè)定的固定數(shù)值, pH變化范圍控制在±0.5。

實驗期間, 只有在第 7 天對照組(pH8.1)和 21 d酸化組(pH7.4)組各死亡一枚, 其余時間內(nèi)并未死亡。

2.2　酸化對血細(xì)胞總數(shù)影響

圖4所示, pH 8.1組和pH 7.7組的血細(xì)胞總數(shù)整體趨勢較穩(wěn)定。pH 7.4組的變化較大, 總體呈降低的趨勢, 0~14 d差異不顯著(P>0.05), 但與21 d和28 d差異均顯著(P<0.05)。在14 d和28 d時三實驗組彼此差異顯著(P<0.05)。

圖3　海水pH變化Fig. 3 Changes in seawater pH

圖4　酸化對血細(xì)胞總數(shù)的影響Fig. 4 Effects of acidification on the total number of blood cells

2.3　酸化對溶菌酶活性影響

圖 5所示溶菌酶活性, pH8.1組整體趨于穩(wěn)定;而pH7.7呈逐漸降低趨勢; pH7.4組呈先升高后降低,在第14 天時到最大值。各實驗組在各時間點差異均不顯著(P>0.05), 相同時間點三實驗組之間的差異性也不顯著(P>0.05)。

2.4　酸化對ACP活性影響

圖6所示ACP活性, pH8.1組整體保持基本不變;pH7.7組和pH7.4組呈先降低后增長再降低的趨勢。但各實驗組在各時間點差異均不顯著(P>0.05), 相同時間點三實驗組之間的差異性也不顯著(P>0.05)。

圖5　酸化對溶菌酶活性的影響Fig. 5 Effects of acidification on the lysozyme activity

圖6 酸化對青蛤ACP活性的影響Fig. 6 Effects of acidification on the ACP activity

2.5　酸化對ALP活性影響

圖7所示, 三實驗組的ALP活性隨時間增長均呈遞增的趨勢, 相同時間點上三實驗組之間 ALP活性的差異性不顯著(P>0.05), 且 pH 7.7實驗組 ALP活性最低。

圖7 酸化對青蛤ALP活性的影響Fig. 7 Effects of acidification on the ALP activity

2.6　酸化對SOD活性影響

圖8所示, 三實驗組 SOD活性在第 21 天均有顯著增加的趨勢(P<0.05), 其余時間內(nèi)相對平穩(wěn)。在14 d酸化組SOD要高于對照組。到21~28 d時, 酸化組降低, 對照組高于酸化組。在第 14 天和第 21天三實驗組彼此差異顯著(P<0.05), 其他時間差異均不顯著(P>0.05)。

圖8 酸化對青蛤SOD活性的影響Fig. 8 Effects of acidification on the SOD activity

2.7　酸化對CAT活性影響

圖9所示, pH7.7組CAT活性在第28 天有較為突出的升高(P<0.05), 其余時間基本穩(wěn)定不變。pH7.4組則表現(xiàn)為不斷增長的趨勢。21 d達(dá)到最大值, 28 d時略下降。酸化脅迫下各時間點上三實驗組彼此差異顯著(P<0.05)。

圖9 酸化對青蛤CAT活性的影響Fig. 9 Effects of acidification on the CAT activity

2.8　酸化對MDA含量影響

圖10所示, pH8.1和pH7.7組MDA含量均呈先增加后降低再增加的趨勢。pH7.4組為先降低再升高最后降低, 第 21 天時達(dá)到最大值?？傮w上看, 試驗期間兩個酸化實驗組的MDA含量要低于對照組。

3　討論

圖10　酸化對青蛤MDA含量的影響Fig. 10 Effects of acidification on the MAD count

作為細(xì)胞免疫承擔(dān)者的血細(xì)胞, 其數(shù)量作為重要的生理指標(biāo), 受種類、年齡、生態(tài)狀態(tài)和環(huán)境脅迫的影響較大[5]。本次試驗前期血細(xì)胞總數(shù)出現(xiàn)短暫的升高, 原因可能由于青蛤自身免疫的應(yīng)激性。一些學(xué)者認(rèn)為短時間污染物的刺激可以導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)量增加[6], 造成的原因可能是刺激物讓血細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)或者是細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低的補(bǔ)償?shù)慕Y(jié)果[7]。但當(dāng)機(jī)體長時間受酸化脅迫后, 超出自身耐受范圍, 血細(xì)胞總數(shù)將受到影響開始下降。丁鑒鋒等[8]指出高濃度 Cu2+等重金屬長期脅迫下, 菲律賓蛤仔血細(xì)胞總數(shù)明顯降低, 與本次試驗結(jié)果一致。Cheng等[9]發(fā)現(xiàn)pH變化(7.6~4.8和9.3)7 d時羅氏沼蝦血細(xì)胞數(shù)量明顯降低。Matozzo等[10]也研究了海洋酸化和暖化對貝類免疫力的影響, 結(jié)果表明血細(xì)胞并非一直呈線性變動, 但也受到酸化顯著影響。所得結(jié)論不僅和本試驗結(jié)果一致, 還提出了另外一條結(jié)論: 即在酸化條件相同情況下, 不同的種類, 酸化效果各異。本試驗結(jié)果說明青蛤血細(xì)胞對外界 pH存在一定耐受范圍,當(dāng)受到的pH脅迫超出機(jī)體的適應(yīng)范圍時, 其數(shù)量會減少, 并顯示出血細(xì)胞總數(shù)隨酸化程度及其相關(guān)(P<0.05)。

溶菌酶、ALP和 ACP均來自血細(xì)胞溶酶體中,是研究血細(xì)胞體液免疫的重要指標(biāo)。低濃度氨氮脅迫對凡納賓對蝦(Litopenaeus vannamei)時, 溶菌酶活性升高, 隨著濃度的升高, 溶菌酶反而下降[11]。本試驗也有相似結(jié)論, 0~14 d時, 隨著酸化時間段的增長, 溶菌酶逐漸呈現(xiàn)上升趨勢, 14 d時酸化組均大于對照組, 這可能是刺激源改變了溶酶體膜的通透性,溶菌酶外滲, 參與對刺激源的殺傷和清除[8]。此后14~28 d時, 溶菌酶又呈下降趨勢, 28 d達(dá)到最小值。這可能是機(jī)體由于應(yīng)激反應(yīng)使其活性升高, 超過自身閥值, 活性受到抑制。對于同樣是pH的改變作為外源刺激, 李曉梅等[12]在研究海洋酸化背景下鉛脅迫近江牡蠣(Crassostrea rivularis Gould)對溶菌酶活性的試驗中, 所得結(jié)論也與本試驗相同。

酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)是重要的體液免疫水解酶, ACP和ALP具有相同的作用效果:輔助吞噬作用消除異物。不同作用效果在于 ACP有催化效果, 而ALP更多在于起到調(diào)理、調(diào)節(jié)的作用[4]。梁健等[13]指出 Cu2+半致死濃度脅迫下青蛤血淋巴液中 ACP 活性呈現(xiàn)出先升高后抑制的趨勢。饒玉才[14]發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌(Anodonta woodiana)的ACP活性隨pH下降先上升后下降, 在pH高于對照條件下, ACP活性在pH7.5略下降, 然后隨pH增高分別急劇上升和下降。本研究中機(jī)體自身受到酸化脅迫后 ACP活性逐漸升高最后在28 d時酸化組(pH7.7和pH7.4)出現(xiàn)明顯的下降。活性升高可能是由于“應(yīng)激”導(dǎo)致; 脅迫后期ACP活性的降低可能通過以下兩條途徑所導(dǎo)致: 一是由于環(huán)境刺激造成的貝類血細(xì)胞溶解, 導(dǎo)致含有ACP的溶酶體失活; 二是可能改變了血細(xì)胞內(nèi)溶酶體的膜通透性, 導(dǎo)致ACP滲漏。ALP活性表現(xiàn)與 ACP存在差異, 于第28天時, ALP處于上升趨勢, 且酸化組(pH7.4)略大于對照組(pH8.1), 推測是因為酸化組pH為7.4只能引起自身產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激效果, 并未達(dá)到抑制ALP的最小pH。任加云等[15]在指出在0.3和0.5 mg/L石油烴的脅迫下, 櫛孔扇貝的ALP活性呈上升趨勢, 而1 mg/L時ALP活性明顯下降, 這一現(xiàn)象充分證明了本文的推測。彭懷明等[16]也有相同結(jié)論, 但其認(rèn)為原因可能是血細(xì)胞的破壞造成溶酶體的釋放。

SOD、CAT和 MDA是免疫能力檢測的重要指標(biāo)。當(dāng)刺激源侵害機(jī)體時, 機(jī)體便會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng), 從而產(chǎn)生一系列的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物, 如丙二醛(MDA), 它可以影響細(xì)胞膜流動性和通透性, 導(dǎo)致功能的改變[17]。于慶云等[18]測定菲律賓蛤仔消化腺和鰓SOD活性在酸化條件下隨著時間的增長, 呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。有學(xué)者指出草魚SOD活性隨著 pH不斷地下降和酸化時間的增長呈先上升后下降的趨勢[19]。陳琳琳等[20]提出重金屬能夠在短期內(nèi)增加紫貽貝抗氧化酶的活性, 但隨著脅迫時間的延長, 便會抑制相關(guān)抗氧化酶的活性。本試驗酸化試驗初期, 7~14 d時, SOD活性出現(xiàn)短暫的升高, pH的降低使體內(nèi)迅速產(chǎn)生活性氧, 抗氧化能力被激活, SOD活性上升, 以降低其細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化程度; 隨著酸化脅迫時間的增長, 18~21 d, 低pH誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧超出調(diào)控閾值, 便抑制了SOD活性, 使SOD活性低于對照組。

CAT能夠分解清除由 SOD歧化作用產(chǎn)生的H2O2從而保護(hù)細(xì)胞不受損傷, CAT和SOD在抗氧化,清除刺激脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基時, 往往是共同協(xié)作。本試驗中試驗組隨酸化時間的增長呈上升的趨勢, 究其原因可能是: 1)酸化組所設(shè) pH梯度不能抑制CAT活性, 使CAT活性仍然處在“誘導(dǎo)”階段。2)酸化的時間較短, 不能夠?qū)е聦AT活性的抑制。另外結(jié)果中對照組CAT活性在酸化脅迫中并不穩(wěn)定,出現(xiàn)有規(guī)律性的波動, 這可能是來自于溫度的影響,本次試驗是在夏天進(jìn)行, 水溫較高, 有學(xué)者認(rèn)為, 在夏天貝類CAT會普遍較高, 呈季節(jié)性變化[21]。

本試驗中實驗組 MDA含量隨酸化時間的延長呈先升高后降低的趨勢, 但試驗組MDA含量始終小于對照組且差異明顯, 說明生物體內(nèi)活性氧的累積程度和細(xì)胞的損傷程度均處于較低水平, 非酶促反應(yīng)起主要作用。機(jī)體自身的抗氧化防御系統(tǒng)有兩類,一類是酶促防御系統(tǒng), 包括 SOD、CAT等; 另一類是非酶促反應(yīng), 包括還原型谷胱甘肽(GSH)、維生素E等[22]。當(dāng)酶促防御系統(tǒng)SOD等受到酸化的脅迫, 導(dǎo)致活性降低, 機(jī)體可能提高非酶促反應(yīng), 來彌補(bǔ)酶促反應(yīng)的不足, 導(dǎo)致MDA含量較低。

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