聶鴻濤, 盧長煒, 柴成林, 楊 鳳, 閆喜武

(大連海洋大學(xué), 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116023)

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)隸屬軟體動物門、簾蛤目、簾蛤科、蛤仔屬, 是重要海產(chǎn)經(jīng)濟貝類, 廣泛分布于我國南北海區(qū)。然而, 近年來蛤仔養(yǎng)殖存在因品種單一、苗種自給率低、良種率低、缺少高產(chǎn)抗逆優(yōu)良品種等問題, 因此進(jìn)行良種選育十分必要[1]。“斑馬蛤”是通過群體累代人工定向選育培育而成的我國第一個新品種, 具有殼色美觀[2]、耐低溫[3]、耐低鹽[4]和存活率高[5]等優(yōu)點。

大多數(shù)棲息在潮間帶的無脊椎動物, 經(jīng)常面臨低氧環(huán)境, 抑制代謝率是低氧耐受最重要的適應(yīng)之一[6-10]。生活在潮間帶的海洋貝類容易受到缺氧環(huán)境的影響。目前關(guān)于貝類對低氧的生理反應(yīng)已有許多研究報道, 主要包括組織行為、生理生化等不同水平的缺氧影響[11-13], 表現(xiàn)出可逆的蛋白磷酸化, 以限制缺氧期間許多酶和功能蛋白的活性[14]。在貝類養(yǎng)殖過程中, 夏季經(jīng)常會出現(xiàn)低氧環(huán)境, 尤其池塘中嚴(yán)重低氧, 明顯制約貝類的生長和存活[15-18]。本實驗通過測定不同低氧水平下菲律賓蛤仔抗氧化酶的變化, 研究其耐受能力, 旨在為蛤仔養(yǎng)殖提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

實驗所用的菲律賓蛤仔為大連莊河養(yǎng)殖群體,共 300個個體。實驗所用海水為黑石礁海區(qū), 經(jīng)沉淀、砂濾后儲存?zhèn)溆盟?。實驗開始前, 先將蛤仔暫養(yǎng)3 d, 暫養(yǎng)期間不投喂, 水溫12℃±0.3℃, 每天換水1次。實驗統(tǒng)一都用水質(zhì)分析儀來測定海水的鹽度和pH, 實驗所用海水pH8.0, 鹽度32。挑選100個大小相近的蛤仔, 分別放在4個30 L暫養(yǎng)缸里, 溶解氧DO分別為2.0 mg/L和7.0 mg/L, 0.5 mg/L和7.0 mg/L。低氧控制方法為固定充氮設(shè)備, 充氮的同時將水質(zhì)分析儀探頭伸入暫養(yǎng)缸測溶解氧 DO的變化。當(dāng)溶解氧DO快到達(dá)所需濃度時, 停止充氮。等待5 min再測 DO, 低于所需濃度時充點氧氣; 高于所需濃度時再充點氮氣。其他3個缸為重復(fù)。每隔3 h測1次DO, 保證 DO水平偏離目標(biāo)低氧水平太多, 要及時充氮或充氧。

1.2　實驗方法

取蛤仔的鰓和消化腺裝進(jìn)凍存管放入液氮保存。解剖完畢后做好標(biāo)記裝進(jìn)密封袋再統(tǒng)一放進(jìn)–80℃冷凍冰箱保存, 用酶標(biāo)儀測定乳酸脫氫酶 LDH、琥珀酸脫氫酶SDH、堿性磷酸酶AKP。

1.3　數(shù)據(jù)處理

計算公式:酶活性(U/g)=測定OD值–對照OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值–

空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(2mmol/L)/

勻漿蛋白濃度(g/mL)

結(jié)果分析比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)分析, 用 SPSS20.0處理數(shù)據(jù), 差異顯著性設(shè)置為P<0.05。

2　結(jié)果

在低氧(0.5 mg/L)和對照組中, 隨著時間的延長,消化腺和鰓中琥珀酸脫氫酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(圖1),消化腺琥珀酸脫氫酶活力高于鰓, 低氧脅迫組的消化腺中琥珀酸脫氫酶活力高于對照組, 在對照組消化腺中琥珀酸脫氫酶活力也高于鰓(圖1)。

圖1　琥珀酸脫氫酶在低氧(0.5 mg/L)和對照組比較Fig. 1 SDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5 mg/L)

琥珀酸脫氫酶在低氧(2.0 mg/L)時和對照組比較見圖 2, 琥珀酸脫氫酶含量上下波動不大, 僅有對照組消化腺在第5 天和第8 天波動較大(圖2)。

圖2　琥珀酸脫氫酶在低氧(2.0 mg/L)和對照組比較Fig. 2 SDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (2.0 mg/L)

隨低氧(0.5 mg/L)脅迫時間延長, AKP酶活力在低氧水平呈不規(guī)律變化(圖3)。消化腺中堿性磷酸酶含量比鰓含量多, 處理組、對照組中堿性磷酸酶在消化腺和鰓含量相差不大。低氧水平對琥珀酸脫氫酶活力影響都不顯著(P>0.05)。

圖3　堿性磷酸酶在低氧(0.5 mg/L)和對照組比較Fig. 3 AKP activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5mg/L)

隨低氧(2.0 mg/L)脅迫時間延長, 消化腺中AKP呈先升高后降低趨勢, 對堿性磷酸酶活力影響較大,在低氧脅迫第5 天消化腺中AKP酶含量高于鰓。處理組和對照組中堿性磷酸酶的含量相差不大, 低氧脅迫組消化腺和鰓中的酶活力高于對照組(圖4)。

圖4　堿性磷酸酶在低氧(2.0 mg/L)和對照組比較Fig. 4 AKP activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (2.0mg/L)

從整體可以看出隨著時間的延續(xù), 同一部位乳酸脫氫酶活力在逐漸降低。對照組消化腺中乳酸脫氫酶活力略高于低氧脅迫組, 低氧脅迫下鰓中乳酸脫氫酶活力高于對照組, 消化腺中乳酸脫氫酶活力高于鰓(圖5)。

如圖 6所示, 消化腺中的乳酸脫氫酶活力呈一個上升趨勢, 對照組中的酶活力較處理組相比更強,而鰓中酶活力呈現(xiàn)不規(guī)律變化(圖6)。

圖5　乳酸脫氫酶在低氧(0.5 mg/L)和對照組比較Fig. 5 LDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5mg/L)

圖6　乳酸脫氫酶在低氧(2.0 mg/L)和對照組比較Fig. 6 LDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (2.0mg/L)

圖7　琥珀酸脫氫酶在低氧(0.5 mg/L和2.0 mg/L)與對照組比較Fig. 7 SDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5 mg/L and 2.0mg/L)

琥珀酸脫氫酶活力在兩個低氧水平(0.5 mg/L和2.0 mg/L)脅迫下總體上是呈現(xiàn)下降趨勢(圖7)。處理組和對照組比較, 處于低氧脅迫下的菲律賓蛤仔琥珀酸脫氫酶活力略高, 說明蛤仔需要這種酶來協(xié)助極限低氧環(huán)境下, 自己的正常呼吸; 可以得出低氧脅迫抑制了琥珀酸脫氫酶活力。低氧組DO(0.5 mg/L)在第 8 天對琥珀酸脫氫酶活力影響顯著(P<0.05),在 0、第 2 天、第 5 天均不顯著(P>0.05), 低氧組DO(2.0 mg/L)時在第2 天、第8 天對琥珀酸脫氫酶活力影響顯著(P<0.05)。

對比兩個不同低氧水平DO (0.5 mg/L和2.0 mg/L),堿性磷酸酶總體呈現(xiàn)上升趨勢(圖 8), 說明在低氧脅迫下, AKP活力升高, 低氧(0.5 mg/L)下的酶活力略高于低氧(2.0 mg/L), 處理組的酶活力基本都高于對照組酶活力。溶氧DO(0.5 mg/L)時在0、第2天、第5天、第8天對堿性磷酸酶活力影響都顯著; 溶氧DO(2.0 mg/L)時在第2天、第5天、第8天對琥珀酸脫氫酶活力影響顯著(P<0.05)。

圖 8 堿性磷酸酶在低氧(0.5mg/L)和低氧(2.0mg/L)與對照組的比較Fig. 8 AKP activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5 mg/L and 2.0mg/L)

對比兩個低氧水平DO (0.5 mg/L和2.0 mg/L),低氧脅迫抑制了乳酸脫氫酶活力(圖9)。在較低溶氧下, 乳酸脫氫酶活力高, 說明乳酸脫氫酶參與了適應(yīng)低氧環(huán)境; 通過比較處理組和對照組可以看出,對照組 LDH酶活力高, 說明在低氧脅迫下, 蛤仔LDH酶活力受到抑制, 活力較弱。溶氧DO(0.5 mg/L)時在第 2天對乳酸脫氫酶活力影響都顯著(P<0.05);溶氧DO(2.0 mg/L)時在第2 天、第5 天、第8 天對乳酸脫氫酶活力影響顯著(P<0.05)。

圖9　乳酸脫氫酶在低氧(0.5 mg/L和2.0 mg/L)與對照組比較Fig. 9 LDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5 mg/L and 2.0mg/L)

3　討論

琥珀酸脫氫酶在溶氧水平 DO(0.5 mg/L)時在低氧環(huán)境下, 菲律賓蛤仔為了維持自身生存, 產(chǎn)生琥珀酸脫氫酶SDH的組織活動不活躍, 導(dǎo)致合成琥珀酸脫氫酶受到抑制作用。對照組消化腺和鰓中琥珀酸脫氫酶活力較低, 是因為在氧氣充足的環(huán)境下,蛤仔新陳代謝較旺盛, 需要的量也就越多, 琥珀酸脫氫酶活力高。在低氧水平(2.0 mg/L)時, 琥珀酸脫氫酶活力較穩(wěn)定。在低氧環(huán)境下能夠促進(jìn)堿性磷酸酶產(chǎn)生, 菲律賓蛤仔的消化腺主要用來分泌消化酶分解食物, 在低氧脅迫下乳酸脫氫酶活力升高; 而對照組的消化腺酶活力高于處理組消化腺酶活力是因為長期低氧抑制了酶的活性, 使酶活力反而下降;低氧脅迫組鰓的酶活力高于對照組鰓酶活力道理類似, 在低氧脅迫下, 低氧處理組需要更多地能量用于呼吸作用, 因此酶活力也就越大[19]。Chen等[20]的研究表明, 櫛孔扇貝的血細(xì)胞總數(shù)隨溶氧濃度的降低而逐漸減少, 并且在溶氧降至 2.5 mg/L時下降46%, 顯著低于對照組。David等[11]在牡蠣低氧脅迫研究中發(fā)現(xiàn), 低氧脅迫會影響牡蠣的先天性免疫系統(tǒng), 從而導(dǎo)致死亡率升高。

低氧環(huán)境下, 溶氧水平較低能夠促進(jìn)堿性磷酸酶產(chǎn)生, 處于低氧脅迫下的菲律賓蛤仔琥珀酸脫氫酶活力先升高后降低, 說明蛤仔需要這種酶來協(xié)助極限低氧環(huán)境下自身的正常呼吸, 但長期低氧脅迫或極端低氧條件下抑制了琥珀酸脫氫酶活力。兩個低氧水平(0.5 mg/L和2.0 mg/L)處理組比較, 酶活力相差較大, 說明不同低氧程度對蛤仔酶活力的影響有所差異[21]。蛤仔在低氧脅迫下第5 天和第8 天酶活力差異不明顯, 說明逐步適應(yīng)了低氧環(huán)境[22]。從處理組和對照組可以看出, 消化腺中的乳酸脫氫酶活力呈上升趨勢, 對照組中的酶活力較處理組相比更高, 而鰓中酶活力忽高忽低。原因可能是低氧脅迫抑制了乳酸脫氫酶活力, 所以對照組消化腺活力高于處理組。處理組和對照組消化腺中酶活力都高于鰓中乳酸脫氫酶活力, 原因可能是消化腺新陳代謝更旺盛, 酶活力相對更高。溶氧水平為2.0 mg/L的低氧脅迫抑制了菲律賓蛤仔乳酸脫氫酶活力[23]。而兩種低氧水平(0.5 mg/L和2.0 mg/L)比較發(fā)現(xiàn), 在極端低氧條件下, 菲律賓蛤仔乳酸脫氫酶活力反而升高, 說明乳酸脫氫酶參與了蛤仔機體抵御極端低氧引起的不適, 并通過生理生化指標(biāo)改變以適應(yīng)低氧環(huán)境[24,25]。通過低氧脅迫處理組和對照組比較可以看出, 對照組酶活力高, 說明在低氧脅迫下, 蛤仔酶活力受到抑制, 活力降低[26]。

綜上, 本實驗研究了兩種低氧脅迫(0.5 mg/L和2 mg/L)對菲律賓蛤仔抗氧化酶的影響。在低氧脅迫時間越長的條件下, 乳酸脫氫和琥珀酸脫氫酶活力逐漸降低, 而堿性磷酸酶活力逐漸升高, 兩種低氧水平蛤仔的抗氧化酶表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。研究結(jié)果為菲律賓蛤仔在低氧生理生態(tài)學(xué)奠定了基礎(chǔ),為蛤仔人工養(yǎng)殖提供了參考。

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