安勇博 梁文英 李軼雯 劉璐 王冬青 戴笑顏 馬馳 錢驛 馬瑞 丁瞳 張嶸

童年期遭遇負(fù)面生活經(jīng)歷會(huì)增加日后患精神疾病（如抑郁癥、焦慮癥）的可能［12］。孤獨(dú)癥譜系綜合征是一類永久性精神發(fā)育障礙，癥狀體現(xiàn)在不同程度的交流困難及重復(fù)刻板行為。2009年統(tǒng)計(jì)美國(guó)的孤獨(dú)癥譜系綜合征患病率為1／110［3］，而2015年已增至1／45［4］。ASD的病因及發(fā)病機(jī)制仍在探索中。目前認(rèn)為，該疾病是由于一系列遺傳因素加環(huán)境危險(xiǎn)因素導(dǎo)致。關(guān)于社會(huì)環(huán)境因素，兒童成長(zhǎng)過(guò)程中的家庭因素是極其重要的。孤兒較正常兒童明顯更容易有認(rèn)知功能障礙以及心理發(fā)育缺陷［5］。家庭因素的負(fù)面影響對(duì)中國(guó)農(nóng)村地區(qū)的兒童也尤為明顯。中國(guó)經(jīng)濟(jì)等方面的高速發(fā)展吸引了許多外地農(nóng)村人口大量涌入大城市，鑒于這類人群無(wú)條件令自己的孩子在大城市和自己生活，他們只能將孩子留在家鄉(xiāng)讓其他親戚撫養(yǎng)。這些兒童被稱為留守兒童。2000—2013年，中國(guó)留守兒童的數(shù)量從2千萬(wàn)增至6千萬(wàn)以上［6］。而與雙親隔離使得留守兒童成為精神發(fā)育障礙相關(guān)疾病的易患人群［7］，因此，社會(huì)環(huán)境因素對(duì)社會(huì)行為以及精神健康的影響受到越來(lái)越多的關(guān)注［6］。

為了探究不同家庭生活背景對(duì)孤獨(dú)癥發(fā)病的影響，本研究以大鼠新生兒期隔離（neonatal isolation，NI）作為動(dòng)物模型來(lái)模擬兒童早期被忽視的逆境，以新生兒撫觸刺激（neonatal tactile stimulation，NTS）來(lái)模擬兒童早期溫和的社會(huì)環(huán)境，之后對(duì)大鼠成年后的社會(huì)行為進(jìn)行觀察，以揭示早期處理的影響。常用的NI模型是每日母鼠與子鼠隔離3 h，先前研究結(jié)果表明，此操作會(huì)增加大鼠幼年時(shí)期焦慮水平［89］，損害認(rèn)知功能［10］，以及增加大鼠幼年期、成年期的侵略性。異常行為改變常常伴隨神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的異常，比如下丘腦垂體腎上腺軸（HPA軸）調(diào)節(jié)功能異常。然而，母子隔離對(duì)子鼠的長(zhǎng)期影響因子鼠性別及隔離處理細(xì)節(jié)的不同呈現(xiàn)不一樣的結(jié)果［11］。NTS是另一種對(duì)大鼠的新生兒期社會(huì)環(huán)境模擬處理，這類處理將幫助子鼠更加適應(yīng)壓力環(huán)境，并能降低子鼠成年后HPA軸的興奮水平［12］。Todeschin等［13］研究顯示，NTS降低雄性子鼠成年后的社交能力。本實(shí)驗(yàn)室調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，孤獨(dú)癥兒童比正常兒童幼年遭遇與父母的隔離的比率更高（181%和65%），且孤獨(dú)癥兒童與父母的親密親子互動(dòng)顯著低于正常兒童（218%和478%），提示親密的親子關(guān)系也許具有潛在的預(yù)防與治療效果，其背后蘊(yùn)藏的機(jī)理仍不明確（待發(fā)表）。

催產(chǎn)素（oxytocin，OXT）和精氨酸后葉加壓素（arginine vasopressin，AVP）是下丘腦室旁核（paraventricular nucleus，PVN）與視上核（supraoptic nucleus，SON）產(chǎn)生的2種神經(jīng)肽。2種肽類物質(zhì)對(duì)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物社交行為有重要作用。PVN與SON中的大細(xì)胞神經(jīng)元的軸突會(huì)延續(xù)至垂體后葉，在那里將OXT與AVP釋放入外周血液循環(huán)。PVN中的小細(xì)胞性神經(jīng)元?jiǎng)t會(huì)將兩種神經(jīng)肽釋放至杏仁核、海馬、伏隔核等腦區(qū)。對(duì)動(dòng)物而言，這兩種神經(jīng)肽對(duì)于社會(huì)識(shí)別、記憶、配對(duì)有重要作用。對(duì)人類而言，2種神經(jīng)肽對(duì)調(diào)控焦慮、信任、社會(huì)識(shí)別具有重要作用［14］。研究還發(fā)現(xiàn)，童年期有被忽視經(jīng)歷的兒童較正常家庭撫養(yǎng)的兒童AVP水平低，正常家庭撫養(yǎng)的兒童在與母親親密接觸后OXT水平會(huì)增高［15］。NI與NTS會(huì)影響子鼠成年后的焦慮水平，但是對(duì)于子鼠成年后社交能力的影響暫不明確。OXT與AVP是調(diào)節(jié)社會(huì)行為、社會(huì)識(shí)別的重要因子，且會(huì)被社會(huì)環(huán)境所影響［1316］。本研究分析子鼠早期接受NI與NTS對(duì)其成年后（90天）社會(huì)交往與焦慮水平的影響，并初步探索其機(jī)制。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

6只SD孕鼠均來(lái)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。初始重量220～250 g。6只孕鼠各自分籠喂養(yǎng)，食水充足，晝夜12 h循環(huán)（早7點(diǎn)至晚7點(diǎn)日光燈照明），室內(nèi)溫度（24±1）℃，濕度50%。孕鼠均自然生產(chǎn)，共產(chǎn)78只子鼠，以出生日記作出生后第0天（postnatal day 0，PND0）。78只子鼠被隨機(jī)分配入3組。NI組28只，雄性13只，雌性15只；NI＋NTS組27只，雄性13只，雌性14只；正常對(duì)照（standard facility rearing，SFR）組23只，雄性8只，雌性15只。并將子鼠連續(xù)編號(hào)（178），號(hào)碼標(biāo)記在大鼠的身體及尾巴上。斷奶（PND 28）后，子鼠按性別每4只／籠喂養(yǎng)。該研究方案經(jīng)大學(xué)研究倫理委員會(huì)（LA 201380）批準(zhǔn)，并符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究NIH指南要求。

二、方法

1新生兒期隔離（NI）與新生兒期撫觸刺激（NTS）：NI組子鼠在PND 1—PND 28每日與母鼠隔離3 h（17：30—20：30）。隔離的流程如下，將母鼠從籠中移出，隨即將子鼠從籠中移出并分別單獨(dú)置入另準(zhǔn)備的小紙杯中（紙杯充滿墊料），環(huán)境溫度維持在36℃。3 h隔離結(jié)束后，所有子鼠移回籠中，最后將母鼠也移回籠中。NTS組子鼠除經(jīng)歷與NI組相同的隔離處理之外，每日在3 h隔離期間有15 min的撫觸刺激。撫觸刺激具體措施如下，實(shí)驗(yàn)者戴上毛絨手套溫柔觸摸子鼠。為了持續(xù)撫觸刺激對(duì)子鼠的影響，將每日撫觸15 min的這項(xiàng)處理一直延續(xù)至子鼠成年（PND 90），而非停止在斷奶后（PND 28）。

SFR組母鼠與子鼠在PND 1—PND 28一直生活在一起。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖 SFR：正常對(duì)照；NI：新生兒期隔離；NTS：新生兒期撫觸刺激

2社會(huì)交往測(cè)試（三室實(shí)驗(yàn)）：大鼠成年后（PND 90）進(jìn)行社會(huì)交往行為測(cè)試。社會(huì)交往測(cè)試方法參考先前研究［10］。測(cè)試裝置由3個(gè)有機(jī)玻璃小室（40 cm×34 cm×24 cm）串聯(lián)構(gòu)成。兩邊的小室通過(guò)中間走廊（10 cm×10 cm×15 cm）與中間的小室相通。子鼠在正式測(cè)試前一天放入裝置15 min熟悉環(huán)境。交往對(duì)象鼠被放入3個(gè)小室中邊側(cè)1個(gè)小室的小籠中，另一邊側(cè)小室放入一個(gè)同樣大小的空的小籠。接受測(cè)試鼠可以自由在三室裝置中活動(dòng)15 min，每個(gè)過(guò)道設(shè)有紅外線探測(cè)儀可探測(cè)到過(guò)往物體，以此可測(cè)定計(jì)算出實(shí)驗(yàn)鼠在每個(gè)小室中度過(guò)的時(shí)間。測(cè)試鼠在有社交對(duì)象鼠的邊側(cè)小室中度過(guò)的時(shí)間被定義為社交時(shí)間。實(shí)驗(yàn)選取的交往對(duì)象鼠與所有測(cè)試鼠同齡且實(shí)驗(yàn)前保持互相陌生。所有行為學(xué)測(cè)試時(shí)間為夜間（19：30熄燈后）。每次測(cè)試后實(shí)驗(yàn)鼠都放回籠中，并將裝置徹底清潔除味。

3環(huán)境所導(dǎo)致焦慮水平測(cè)試（黑白箱探索實(shí)驗(yàn)）：實(shí)驗(yàn)裝置由三室實(shí)驗(yàn)裝置改裝而成。將三室中的一個(gè)邊側(cè)小室與另兩小室隔擋，將余下的兩個(gè)小室其中一個(gè)裝上黑色不透光的天花板，作黑箱；另一個(gè)小室裝上透明天花板作白箱。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將實(shí)驗(yàn)鼠放入黑箱，實(shí)驗(yàn)鼠可以自由穿梭于黑白箱中，記錄其在每個(gè)箱中的時(shí)間。焦慮水平測(cè)試中，子鼠在黑箱中度過(guò)的時(shí)間反映其環(huán)境導(dǎo)致的焦慮水平。在黑箱中所處時(shí)間越長(zhǎng)表示測(cè)試鼠的焦慮水平越高。每次測(cè)試后實(shí)驗(yàn)鼠都放回籠中，并將裝置徹底清潔除味。

4對(duì)PVN和SON中OXT和AVP免疫組化染色：在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，用10%水合氯醛（300 mg／kg體重）腹腔注射，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。先后使用生理鹽水和4%多聚甲醛（pH 74）經(jīng)心臟對(duì)大鼠灌注固定，取腦，在相同固定液中4℃固定24 h。之后以30μm為厚度連續(xù)切片，－20℃保存在具有防凍功能的固定液中。

采用抗生物素生物素過(guò)氧化酶法（avidin biotin peroxidase complex，ABC）對(duì) OXT和 AVP陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色。具體方法如下，室溫下將冰凍切片用001 M PBS于搖床上洗3遍，置于甲醛固定10 min。再用001 M PBS洗3遍后，03%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育腦片30 min以清除內(nèi)源過(guò)氧化酶活性。001 M PBS洗3遍后，用10%山羊血清和003%Triton X100（001M PBS）在37℃溫箱中封閉30 min。之后加入兔源抗大鼠OXT或AVP單克隆抗體（Abcam，USA，1∶2 000稀釋于含1%山羊血清和03%TritonX100的001 M PBS溶液）于37℃溫箱震蕩孵育2 h，之后置于4℃冰箱繼續(xù)孵育48 h。用001 M PBS洗3遍，每次15 min后加入二抗（用生物素標(biāo)記的山羊源抗兔 IgG，Vectastain，USA，1∶200稀釋），37℃震蕩孵育30 min。PBS洗3遍后，用加鏈酶親和素生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物（Vectastain，USA，1∶200稀釋）于37℃孵育 45 min。PBS洗 3遍后用含 005 M Tris HCl（pH 76）的 05 mg／ml二氨基聯(lián)苯胺和 003%過(guò)氧化氫溶液顯色10 min?？梢?jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕色反應(yīng)產(chǎn)物。對(duì)腦片進(jìn)行貼片、烤干，之后用酒精梯度脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片。

因NI和NTS干預(yù)后雌鼠表現(xiàn)出顯著行為學(xué)改變，故以下實(shí)驗(yàn)聚焦于雌鼠。每組挑選有明顯行為改變的5只雌鼠，通過(guò)測(cè)量PVN和SON免疫組化陽(yáng)性的大細(xì)胞和小細(xì)胞神經(jīng)元數(shù)量，研究雌鼠OXT和AVP表達(dá)水平的改變。

5細(xì)胞計(jì)數(shù)和數(shù)據(jù)分析：本研究使用Olympus顯微鏡和Canon相機(jī)對(duì)免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞觀察、照相和計(jì)數(shù)。在顯微鏡下，PVN和SON區(qū)域的神經(jīng)元細(xì)胞核呈棕色染色即為OXT或AVP免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞。本研究所涉及的所有大腦核團(tuán)命名和定位均依據(jù)1997年P(guān)axinos和Watson的文章。在計(jì)數(shù)方面，本研究在距大鼠前囟（bregma）－092～－140 mm的范圍每隔三張腦片對(duì)雙側(cè)免疫組化染色陽(yáng)性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，取數(shù)量最多的平面進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)于大、小細(xì)胞區(qū)域的界定依據(jù)1982年Swanson等［17］，本研究所取平面也與該文章類似（圖 2）。

圖2 計(jì)數(shù)平面

以上2個(gè)示意圖顯示了本研究所選計(jì)數(shù)平面中OXT（A）和AVP（B）染色陽(yáng)性細(xì)胞在PVN的分布情況。pm posterior magnocellular后部大細(xì)胞區(qū)域；dp dorsal parvocellular背側(cè)小細(xì)胞區(qū)域；mp medial parvocellular內(nèi)側(cè)小細(xì)胞區(qū)域

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用Prism 50統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，三組比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），兩兩比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。p＜005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、社會(huì)交往測(cè)試

1同性交往（測(cè)試鼠與社交對(duì)象鼠為同一性別）：NI組的子鼠社交時(shí)間百分比為（6298±299）%，少于 SFR組（7301±197）%及 NTS組（7259±276）%差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3A。

2異性交往（測(cè)試鼠與社交對(duì)象鼠為不同性別）：NI、NTS、SFR組子鼠社交時(shí)間百分比分別為（6867±307）%、（6893±284）%、（7271±193）%，三組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3B。

3雄性子鼠交往時(shí)間（測(cè)試鼠為雄鼠，社交對(duì)象鼠為雄鼠或雌鼠）：NI、NTS、SFR組雄鼠子鼠社交時(shí)間百分比分別為（6826±372）%、（7157±314）%、（7421±258）%，三組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3C。

4雌性子鼠交往時(shí)間（測(cè)試鼠為雌鼠，社交對(duì)象鼠為雄鼠或雌鼠）：NI組的雌性子鼠社交時(shí)間百分比為（6372±241）%，少于 SFR組（7214±160）%及 NTS組（7000±251）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3D。

圖3 NI與NTS對(duì)子鼠成年后社會(huì)交往的影響（三室實(shí)驗(yàn)） A同性交往；B異性交往；C雄鼠；D雌鼠。 p＜005。SFR：正常對(duì)照；NI：新生兒期隔離；NTS：新生兒期撫觸刺激

二、焦慮水平測(cè)試（黑白箱測(cè)試）

NI、NTS、SFR組雌鼠在黑箱中度過(guò)的時(shí)間百分比分別為（6290±284）%、（5514±250）%、（6256±264）%，雄鼠在黑箱中度過(guò)的時(shí)間百分比分別為（7035±540）%、（6993±588）%、（6635±907）%，全部子鼠在黑箱中度過(guò)的時(shí)間百 分 比 分 別 為 （6636±297）%、（6226±338）%、（6388±349）%。三組不同性別子鼠焦慮水平無(wú)差異，見(jiàn)圖4，說(shuō)明NI或NTS對(duì)環(huán)境所導(dǎo)致的焦慮水平無(wú)影響。

圖4 NI與NTS對(duì)子鼠成年后環(huán)境所導(dǎo)致焦慮水平的影響（黑白箱實(shí)驗(yàn)） A雄鼠；B雌鼠；C雌雄鼠合計(jì)。SFR：正常對(duì)照；NI：新生兒期隔離；NTS：新生兒期撫觸刺激

三、OXT在PVN和SON的表達(dá)

在PVN中（圖5A、C），NI組 OXT陽(yáng)性的大細(xì)胞神經(jīng)元數(shù)目為（366±531），較 SFR組（662±749）和 NTS組（714±986）減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NI、NTS、SFR組OXT陽(yáng)性的小細(xì)胞神經(jīng)元數(shù)目分別（220±689）、（302±531）、（296±605），三組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5E、F。在PVN中，NI、NTS、SFR組OXT陽(yáng)性的細(xì)胞神經(jīng)元數(shù)目分別為（882±140）、（668±149）、（1010±158）；在 SON中（圖 5B、D），NI、NTS、SFR組 OXT陽(yáng)性的細(xì)胞神經(jīng)元數(shù)目分別為（914±774）、（898±589）、（890±373），三組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5G、H。

圖5 雌性成年大鼠OXT陽(yáng)性細(xì)胞圖和在各組中的表達(dá) APVN（免疫組化，×20）；BSON（免疫組化，×20）；CPVN（免疫組化，×50）；DSON（免疫組化，×50）。pm posterior magnocellular后部大細(xì)胞區(qū)域；dp dorsal parvocellular背 側(cè) 小 細(xì) 胞 區(qū) 域；mp medial parvocellular內(nèi)側(cè)小細(xì)胞區(qū)域，比例尺＝200μm。成年雌性大鼠PVN（E，F(xiàn)，G）和SON（H）中OXT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。 p＜005

四、AVP在PVN和SON中的表達(dá)

在PVN中（圖6A、C），AVP陽(yáng)性的大細(xì)胞神經(jīng)元的變化與 OXT表達(dá)類似，NI組（3343±320）較SFR組（672±1454）和 NTS組（642±696）減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NI組AVP陽(yáng)性的小神經(jīng)元（88±196）也較 SFP組（344±1061）減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6E、F。在PVN中，NI組陽(yáng)性神經(jīng)元（416±382）較 SFP組（1016±2457）減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6G；在SON中（圖6B、D），NI、NTS、SFR組 AVP陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量分別為（8640±1901）、（9400±2183）、（11600±2607），三組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6H。

圖6 雌性成年大鼠AVP陽(yáng)性細(xì)胞圖和在各組中的表達(dá) APVN（免疫組化，×20）；BSON（免疫組化，×20）；CPVN（免疫組化，×50）；DSON（免疫組化，×50）。pm posterior magnocellular后部大細(xì)胞區(qū)域；dp dorsal parvocellular背 側(cè) 小 細(xì) 胞 區(qū) 域；mp medial parvocellular內(nèi)側(cè)小細(xì)胞區(qū)域，比例尺＝200μm。成年雌性大鼠PVN（E，F(xiàn)，G）和SON（H）中OXT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。 p＜005

五、行為學(xué)測(cè)試結(jié)果與OXT、AVP水平相關(guān)性分析

雌性子鼠社交測(cè)試結(jié)果與其腦內(nèi)PVN中OXT、AVP免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞水平的相關(guān)性見(jiàn)圖7。雌鼠PVN中OXT、AVP免疫組化陽(yáng)性的總細(xì)胞數(shù)目（大小細(xì)胞總合）與其同性交往時(shí)間呈正相關(guān)（r2＝0277，P＝0044；r2＝0325，P＝0017）。雌鼠 PVN中AVP免疫組化陽(yáng)性的大細(xì)胞數(shù)目與同性交往時(shí)間呈正相關(guān)（r＝0372，P＝0009），而雌鼠 PVN中OXT免疫組化陽(yáng)性的大細(xì)胞數(shù)目與同性交往時(shí)間無(wú)相關(guān)性（r＝0191，P＝0103）。

圖7 雌性子鼠社交測(cè)試與其腦內(nèi)PVN中OXT、AVP免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞水平的相關(guān)性 雌鼠PVN中OXT（A）、AVP（B）陽(yáng)性的總細(xì)胞數(shù)目，AVP（D）陽(yáng)性的大細(xì)胞數(shù)目與其同性交往時(shí)間正相關(guān)；雌鼠PVN中OXT（C）陽(yáng)性的大細(xì)胞數(shù)目與其同性交往時(shí)間無(wú)關(guān)

討 論

本研究利用新生兒期間母子隔離（NI）和撫觸刺激（NTS）的大鼠模型研究早期社會(huì)環(huán)境對(duì)成年后社交行為的影響。三室實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，NI組與社交對(duì)象鼠相處時(shí)間較對(duì)照組少，說(shuō)明NI對(duì)大鼠的社交發(fā)展有不良影響。而在NI后進(jìn)行了NTS的大鼠成年后社交行為與同一母鼠撫養(yǎng)的對(duì)照組無(wú)差異，說(shuō)明撫觸刺激部分逆轉(zhuǎn)了母子隔離的不良作用。本研究結(jié)果與之前嬰兒期短期撫觸刺激對(duì)成年社交行為有不良影響的報(bào)道不符［13］，可能與撫觸刺激方式不同有關(guān)，后者為短期干預(yù)。來(lái)自異種生物的短期撫觸可能對(duì)動(dòng)物是一種應(yīng)激刺激，導(dǎo)致對(duì)社交行為發(fā)展產(chǎn)生不良影響。在本實(shí)驗(yàn)條件下，反復(fù)進(jìn)行的人為撫觸刺激，導(dǎo)致動(dòng)物已經(jīng)適應(yīng)，且皮膚刺激對(duì)于OXT、AVP的產(chǎn)生有刺激作用，最終逆轉(zhuǎn)了母子隔離所致的不良社交影響。因此，本研究結(jié)果提示，嬰兒期長(zhǎng)期撫觸刺激可能對(duì)成年期的社交行為有積極作用，即撫觸刺激在我們實(shí)驗(yàn)中可能模仿了母子接觸，從而產(chǎn)生治療作用。

社交減少可能源于焦慮水平增加。在黑白箱實(shí)驗(yàn)中，三組無(wú)差異說(shuō)明親子隔離對(duì)大鼠成年后的焦慮水平無(wú)影響。因此，本研究認(rèn)為，NI和NTS僅特異性地影響社交行為，而對(duì)焦慮水平無(wú)影響。

PVN合成的OXT與社交行為和雌雄配對(duì)有關(guān)，且有報(bào)道顯示PVN小細(xì)胞神經(jīng)元的OXT陽(yáng)性細(xì)胞減少與親近社交行為減少有關(guān)［13］，也曾有報(bào)道稱NI可導(dǎo)致 PVN小細(xì)胞神經(jīng)元 OXT表達(dá)下降［18］。本研究中，NI組PVN處的大細(xì)胞神經(jīng)元OXT表達(dá)下降且NTS可使OXT恢復(fù)，而小細(xì)胞神經(jīng)元無(wú)明顯改變。這些不同的結(jié)果可能由于PVN的大、小細(xì)胞神元均合成OXT。德國(guó)科學(xué)家指出，OXT和AVP由兩類神經(jīng)元合成，一類是PVN和SON的大細(xì)胞神經(jīng)元，另一類是PVN的小細(xì)胞神經(jīng)元；大細(xì)胞神經(jīng)元的下游也有2條通路，一個(gè)是通過(guò)軸突投射到垂體后葉，另一個(gè)是通過(guò)樹(shù)突釋放到細(xì)胞外區(qū)域；而后者不僅影響局部OXT含量，還可以擴(kuò)散到大腦的遠(yuǎn)隔區(qū)域；小細(xì)胞神經(jīng)元的下游通路為通過(guò)軸突投射到其他大腦區(qū)域，如杏仁核、海馬等［19］。因此，大、小細(xì)胞神經(jīng)元均可以合成OXT并對(duì)特定的大腦區(qū)域發(fā)揮作用。據(jù)此推測(cè)，早期的社會(huì)環(huán)境可能對(duì)PVN中這兩類神經(jīng)元OXT的表達(dá)均有影響。本研究也顯示，PVN處總OXT陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目與雌性大鼠同性社會(huì)交往有關(guān)，說(shuō)明OXT可能是介導(dǎo)NI或NTS影響社交行為的途徑之一。

很多綜述總結(jié)了OXT在社交行為上的作用［2021］。OXT可增加理解他人情緒的能力，并可使個(gè)體更愿意接受有風(fēng)險(xiǎn)的合作或信任行為，從而提高社交行為［19］。近期的功能磁共振（functional magnetic resonance imaging，fMRI）研究繪制了可能介導(dǎo)OXT影響社交行為的相關(guān)腦區(qū)。大部分已發(fā)表的文章顯示，經(jīng)鼻OXT吸入可影響杏仁核和其下游腦區(qū)，如腦干［22］。但是，具體的分子機(jī)制仍不清楚。

本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，NI可導(dǎo)致雌鼠PVN的AVP陽(yáng)性神經(jīng)元減少，這與既往研究［16］類似。本研究中NTS對(duì)PVN的AVP陽(yáng)性神經(jīng)元的影響，與之前研究所報(bào)道的因NI而降低的AVP陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目可通過(guò)NTS升高一致［23］。本實(shí)驗(yàn)還分析了雌鼠AVP陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目和社交能力的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PVN的AVP陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目與同性交往水平正相關(guān)。該結(jié)果支持AVP可促進(jìn)社交能力且受NI或NTS影響的假設(shè)。

AVP的功能可能來(lái)源于其在“社交行為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)”中的作用。此概念由Newman在1999年提出，強(qiáng)調(diào)該網(wǎng)絡(luò)中的各個(gè)成分彼此相互影響，共同調(diào)控很多社交行為［24］。AVP和AVP受體（V1a受體等）也在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中廣泛存在［25］?，F(xiàn)有研究指出，AVP可調(diào)節(jié)對(duì)感覺(jué)信息的接收，影響社交決策并促進(jìn)社交行為相關(guān)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的輸出［25］。但是，其具體分子機(jī)制仍不明確。

另外，NI和NTS對(duì)大鼠社交行為的影響有性別特異性。本研究中，NI對(duì)社交的負(fù)面影響在雌鼠中更加明顯，這與之前的報(bào)道一致［26］。由于雌激素可影響雌鼠情緒和焦慮水平，且具有濃度依賴性，為了消除波動(dòng)的雌激素水平對(duì)社交行為的影響，Tsuda等［9］進(jìn)一步探究了NI對(duì)切除卵巢雌鼠的作用，仍發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，即NI可降低雌鼠社交行為。

近期由Dumais和Veenema總結(jié)的OXT和AVP系統(tǒng)的性別差異提出新的觀點(diǎn)［27］。越來(lái)越多的結(jié)果證明，這兩個(gè)系統(tǒng)在合成、受體分布及行為功能上存在性別差異［27］。典型的性別特異性是指在一種性別中的影響大于另一種性別，即不同性別對(duì)OXT和AVP這兩個(gè)系統(tǒng)的敏感性存在差異［28］。且這種性別差異還可能表現(xiàn)為，這兩個(gè)系統(tǒng)在不同性別之間存在相反的作用［29］或僅在一種性別起作用［30］，還可能不存在性別差異［31］。

OXT系統(tǒng)在大鼠社交行為的影響。一方面，Lukas等［32］研究顯示，經(jīng)腦脊液注射OXT可緩解成年雄鼠因社交缺陷導(dǎo)致的社交回避，而對(duì)雌鼠無(wú)影響［33］。而另一方面，經(jīng)腦脊液注射OXT受體拮抗劑可損傷雄鼠［34］和雌鼠的社會(huì)認(rèn)知能力［35］?？赡躉XT系統(tǒng)在兩種性別的社會(huì)認(rèn)知能力中有類似的作用，但雄性對(duì)OXT更加敏感，而雌性已達(dá)到天花板效應(yīng)［27］。Rilling等［36］通過(guò)研究人經(jīng)鼻吸入 OXT后社會(huì)認(rèn)知能力的改變發(fā)現(xiàn)，OXT可增加男性殼核和尾狀核的反應(yīng)，卻降低女性該區(qū)域的反應(yīng)。因此，本研究所觀察到的性別特異性可能源于兩性別的不同敏感性或OXT下游靶點(diǎn)。

對(duì)AVP在人類社交行為中作用的研究，大多以男性為研究對(duì)象，導(dǎo)致難以進(jìn)行性別差異的分析。少數(shù)幾個(gè)包括女性的研究均顯示不同性別存在行為差異。在面對(duì)不熟悉的同性面孔時(shí)，男性經(jīng)鼻吸入AVP可刺激爭(zhēng)勝性面部運(yùn)動(dòng)模式，而在女性則可刺激親近性面部運(yùn)動(dòng)模式［37］。該正常人群中的研究結(jié)果與本研究結(jié)果類似。此外，經(jīng)鼻吸入AVP可增加男性紋狀體、前腦基底層、腦島、杏仁核和海馬的活性，而在女性中則降低或不起作用［36］。該結(jié)果提示AVP作用的性別差異很可能與AVP激活不同腦區(qū)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)另一個(gè)性別相關(guān)的結(jié)果是，NI對(duì)于同性大鼠間的交往影響更大。類似的結(jié)果之前亦有報(bào)道［9］，但具體機(jī)制仍不清楚。

本研究存在以下幾點(diǎn)不足。（1）PVN中OXT和AVP陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的改變并不完全等同于分子功能的改變。因此，通過(guò)功能磁共振對(duì)OXT和AVP功能從受體水平進(jìn)行分析，可更加準(zhǔn)確測(cè)定OXT和AVP功能上的改變。（2）其他母親來(lái)源的因素亦可影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。環(huán)境因素如NI和NTS亦可通過(guò)改變母親養(yǎng)育行為而導(dǎo)致子鼠出現(xiàn)分子和行為水平的改變。（3）未來(lái)的研究對(duì)象應(yīng)包括兩種性別，并需要考慮雌鼠所處的月經(jīng)周期，這樣才能更加準(zhǔn)確地反映性別差異。

總之，經(jīng)歷NI的幼鼠成年后社交能力下降，且在雌鼠及同性交往中更加顯著。NTS可部分逆轉(zhuǎn)NI對(duì)社交行為的不良影響。因此，NTS可能對(duì)社交能力有積極作用。NI降低PVN中OXT和AVP陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量，且這種改變與社交行為正相關(guān)。提示幼鼠早期經(jīng)歷的不良社會(huì)環(huán)境如NI可能通過(guò)誘導(dǎo)與哺乳動(dòng)物社會(huì)聯(lián)系有關(guān)區(qū)域的形態(tài)學(xué)改變，從而引起長(zhǎng)期的行為改變，且NTS可有效逆轉(zhuǎn)這種不良反應(yīng)。因此，建立一個(gè)良好的親子關(guān)系對(duì)于預(yù)防兒童行為障礙性疾病（如孤獨(dú)癥）有重要作用。

致謝：感謝創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃基金（J1030831／J0108）對(duì)北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院的支持，以及 the Research Special Fund for Public Welfare Industry of Health of China（20130200211）對(duì)張嶸教授與韓濟(jì)生院士的支持。特別感謝韓松平教授對(duì)本研究的指導(dǎo)與建議。

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