佳莉娟，曹秀琴，王 琦

免疫性不孕癥患者血清抗體及可溶性FcγRIIB功能檢測及相關(guān)機制的初步研究

佳莉娟1，曹秀琴2，王 琦3

目的 通過檢測免疫性不孕癥患者及正常人群血清免疫性抗體及可溶性FcγRIIB功能，探討分析FcγRIIB在免疫性不孕癥中的相關(guān)作用機制。方法 選取免疫性不孕癥患者30例為觀察組，同期體檢健康女性30例為對照組。ELISA 法檢測所有受試者血清中可溶型FcγRIIB含量、與免疫復(fù)合物結(jié)合力以及抗精子抗體(AsAb)、抗心磷脂抗體(AcAb)、抗子宮內(nèi)膜抗體(EmAb)等免疫性抗體。結(jié)果 觀察組血清中可溶性FcγRIIB濃度低于對照組(t=-9.528，P<0.0001)，差異有統(tǒng)計學意義。相同DNA孵育濃度下，觀察組血清可溶性FcγRIIB與IC結(jié)合力高于對照組。觀察組AsAb、AcAb等抗體陽性率高于對照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 FcγRIIB表達水平下降可能與免疫性不孕的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。

不孕癥；免疫性因素；FcγRIIB；發(fā)病機制

在我國已婚夫婦中，不孕癥的發(fā)生率約為10%～15%，而其中因免疫性因素所導致的不孕約占30%～40%[1-2]。免疫性不孕癥患者體內(nèi)存在抗精子抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體以及抗透明帶抗體等多種抗體，可對受精卵的形成或著床造成影響，進而引發(fā)不孕。FcγRIIB屬免疫球蛋白超家族，是IgG Fc 受體(FcγR)中唯一的抑制型受體，主要介導負反饋效應(yīng)，維持外周免疫耐受的平衡，調(diào)節(jié)機體固有免疫和適應(yīng)性免疫[3]。本研究即對免疫性不孕癥患者血清免疫性抗體及可溶性FcγRIIB功能進行檢測，并對相關(guān)作用機制進行初步分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年2月至2015年12月于寧夏醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院就診的免疫性不孕癥患者30例為觀察組，年齡(33.2±6.6)歲，不孕時間(24.6±9.2)個月，臨床檢查顯示原發(fā)性不孕16例，繼發(fā)性不孕14例。同期體檢健康女性30例為對照組，年齡(31.3±5.6)歲；有妊娠生育史19例，無妊娠生育史11例。

1.2 免疫性不孕納入標準 ①正常夫妻生活12個月以上，未采取避孕手段而女方不孕。②造影檢查示雙側(cè)輸卵管通暢，B超示子宮正常；③B超連續(xù)監(jiān)測示排卵正常，基礎(chǔ)體溫呈雙向型；④免疫性不孕抗體至少1項為陽性。

1.3 排除標準 ①男方因素導致的不孕；②生殖器畸形或染色體異常；③內(nèi)分泌激素檢測異常。

1.4 檢測方法

1.4.1 材料及設(shè)備 誘導純化FcγRIIB蛋白為本實驗室保存；山羊抗人FcγRIIB購于sigma公司；HRP標記兔抗人FcγRIIB(Rabbit Anit-CD32)、山羊抗人IgG(GoatAnit-human IgG/HRP)均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；雙組分TMB顯色試劑盒購于美國Proteintech公司；所有試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)研究所；全自動酶標儀酶標儀Model 680購自BIO-RAD公司。

1.4.2 血清可溶性FcγRIIB含量的檢測 空腹取外周靜脈血3 mL，3 000 r·min-1離心10 min，取血清。FcγRIIB抗體1∶2 000稀釋，每孔100 μL加樣ELISA板中，4 ℃孵育24 h，用洗滌液洗板，封閉液封板，4 ℃孵育24 h，待測血清(正常人、不孕癥患者血清各30例)1∶100與稀釋液稀釋后加至ELISA板中，37 ℃孵育30 min，棄液，洗ELISA板， 抗FcγRIIB抗體1∶2 000稀釋，每孔100 μL加樣ELISA板中，37 ℃孵育30 min，棄液，洗板，HRP標記羊抗人抗體1∶1 000稀釋后加至ELISA板中，37 ℃孵育30 min。洗板，加底物顯色液100 μL，避光顯色20 min后加終止液50 μL，全自動酶標儀測定吸光度(A)值。

1.4.3 可溶型FcγRIIB與免疫復(fù)合物(Immune complex, IC)的結(jié)合力檢測 取血清，分別與0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg·mL-1濃度的小牛胸腺DNA37 ℃孵育30 min，另取1.25 μg·mL-1FcγRIIB 每孔100 μL包被ELISA 板，加入孵育后的上述不同濃度標本，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min，洗板。待測血清(正常人、不孕癥患者血清各30例)1∶100與稀釋液稀釋后加至ELISA板中，37 ℃孵育30 min，棄液，洗ELISA板， HRP標記羊抗人抗體1∶1 000稀釋后加至ELISA板中，37 ℃孵育30 min。棄液洗板，底物顯色液每孔100 μL，37 ℃孵育20 min，每孔加100 UI終止液，全自動酶標液測定吸光值，以倍比稀釋標準品制作標準曲線，計算出待測血清標本可溶性FcγRIIB免疫復(fù)合物結(jié)合力。

1.4.4 免疫性抗體檢測 ①檢測項目：抗精子抗體(anti spermatozoa antibody,AsAb)、抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibody,AcAb)及抗子宮內(nèi)膜抗體(antiendometrium antibody,EmAb)。②檢測方法取血清，嚴格依據(jù)說明書，采用AsAb、AcAb和抗EmAb ELISA試劑盒行血清抗體檢測，全自動酶標檢測儀測定吸光度值并判定結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS19.0軟件，獨立樣本t檢驗分析兩組受試者血清中可溶性FcγRIIB含量及與IC結(jié)合力，χ2檢驗分析免疫性抗體陽性率，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清可溶性FcγRIIB含量 不孕癥患者血清可溶性FcγRIIB的水平低于正常人，30例不孕癥患者可溶性FcγRIIB含量102.54±21.44；30例正常人血清可溶性FcγRIIB含量148.15±24.38，不孕癥患者與正常人血清中可溶性FcγRIIB濃度有顯著有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)。

2.2 可溶型FcγRIIB結(jié)合力 隨小牛胸腺DNA濃度的增加，兩組受試者所測定獲得的A值呈增加趨勢，當孵育DNA 濃度為0.8 mg·mL-1時，A值趨于穩(wěn)定。對不同濃度DNA濃度下兩組A值進行比較顯示，觀察組A值均大于對照組。見圖1。

圖1 兩組受試者可溶型FcγRIIB與IC的結(jié)合力比較

2.3 免疫性抗體陽性率比較 觀察組AsAb、AcAb和EmAb陽性率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在對不同免疫性不孕癥類型進行分析顯示，原發(fā)性不孕患者AsAb陽性率較高，而繼發(fā)性不孕患者AcAb和EmAb陽性率較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1-2。

表1 免疫性不孕癥與正常人免疫性抗體比較 例(%)

注：AsAb:抗精子抗體；AcAb:抗心磷脂抗體；EmAb:抗子宮內(nèi)膜抗體。

表2 不同類型免疫性不孕患者抗體陽性率比較 例(%)

注：AsAb:抗精子抗體；AcAb:抗心磷脂抗體；EmAb:抗子宮內(nèi)膜抗體。

3 討論

免疫性不孕又稱變態(tài)反應(yīng)性不孕，由生殖系統(tǒng)抗原的自身免疫或同種免疫引起。在不孕癥患者中，超過20%原因未明，其中大多數(shù)可以歸結(jié)為免疫因素[4]。目前已知的致病抗體有抗透明帶抗體、抗精子抗體、抗心磷脂抗體、抗卵巢抗體、抗絨毛膜促性腺激素抗體等?？蓪β雅莅l(fā)育、精子的輸送、受精卵的形成、受精卵著床及發(fā)育等一系列過程造成影響，進而導致不孕癥的發(fā)生。

FcγRIIB是唯一的Fcγ抑制性受體，位于染色體1q23 上，在巨噬細胞、中性粒細胞、B細胞以及嗜酸性粒細胞中廣泛表達[5]，主要介導負反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)，負性調(diào)節(jié)機體適應(yīng)性免疫以及固有免疫。FcγRIIB維持外周免疫耐受的平衡主要通過依賴ITIM 的方式進行，但也可通過不依賴ITIM 的方式傳導抑制信號，進而對抗體的分泌、細胞的增殖等多種生物學效應(yīng)進行調(diào)節(jié)[6-7]。FcγRIIB表達異常可引起相關(guān)免疫性疾病的發(fā)生，動物實驗顯示，F(xiàn)cγRIIB基因敲除小鼠均表現(xiàn)為原有自身免疫病加重或自身免疫病易感趨勢[8]。

免疫性不孕癥患者對抗精子抗體等不能進行免疫耐受，從而導致了不孕癥的發(fā)生[9]。馬佳佳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在體外環(huán)境下，IL-17R-FcγRIIB融合基因可阻斷CD86/CD28共刺激通路，誘導樹突狀細胞免疫耐受狀態(tài)，并可對Th1/Th1/Th17分化以及抗原特異性T細胞增殖進行抑制。FcγRIIB是抑制B 細胞激活的關(guān)鍵受體，徐利玲[11]研究顯示，F(xiàn)cγRIIB可對B細胞的活化進行抑制，調(diào)節(jié)免疫耐受，進而可對系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病相關(guān)抗體的分泌進行抑制。因此，推測在免疫性不孕癥患者機體內(nèi)，其FcγRIIB表達水平可能存在異常。在對免疫性不孕癥患者血清可溶性FcγRIIB進行檢測顯示，與正常人群相比較，免疫性不孕癥患者血清中可溶性FcγRIIB濃度及自身抗體分泌能力均較低，提示較低水平的FcγRIIB不能對B細胞的活化進行抑制，因而難以對抗精子抗體等免疫性不孕抗體的分泌進行有效的抑制，而上述抗體則可對受精卵的形成和著床造成影響，引起不孕。目前對于由FcγRIIB水平下調(diào)直接或間接導致的疾病已有相關(guān)報道，周士亮等[12]報道，在原發(fā)性干燥綜合征患者中，F(xiàn)cγRIIB的表達與SSDAI和抗SSA抗體呈負相關(guān)，F(xiàn)cγRIIB表達異常與免疫性疾病的發(fā)生有重要關(guān)系。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，在相同DNA孵育濃度下，免疫性不孕癥患者血清可溶性FcγRIIB與IC結(jié)合力高于正常人。人體血清中均含有一定量的IgG抗體和IC，血清與小牛胸腺DNA孵育后，IgG型IC含量可顯著增加；在與可溶性FcγRIIB進行孵育后，二者可發(fā)生結(jié)合。與正常人相比較，免疫性不孕癥患者血清中含有較多的抗精子抗體等類型抗體，在孵育后可產(chǎn)生更多的IgG型IC，因而可檢測到FcγRIIB與IC結(jié)合力高于正常人。

在對免疫性不孕癥患者體內(nèi)AsAb等免疫性抗體進行檢測顯示，AsAb、AcAb和EmAb陽性率均顯著高于正常人群。如前所述，上述抗體可對精子的輸送、受精卵的形成、受精卵著床及發(fā)育等一系列過程造成影響，進而導致不孕癥的發(fā)生?？贵w由活化的B細胞產(chǎn)生，而FcγRIIB是抑制B 細胞激活的關(guān)鍵受體。在FcγRIIB水平下降后，其難以對B細胞的活化進行抑制，進而導致機體免疫耐受異常，上述抗體作用于精子、受精卵、子宮內(nèi)膜以及胎盤血管，阻礙妊娠發(fā)生，引發(fā)不孕。不同類型的免疫性不孕癥患者體內(nèi)各種免疫性抗體的表達水平不盡相同，在原發(fā)性不孕患者中，AsAb陽性率較高；而繼發(fā)不孕者，AcAb和EmAb陽性率較高。在精液中存在多種抗原，可與宮頸上皮細胞發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生AsAb，進而阻礙精子進入宮腔、干擾精子獲能、抑制頂體反應(yīng)以及干擾精卵黏附與融合。而EmAb是內(nèi)異癥的標志抗體，在多次妊娠以及人流后，可刺激機體產(chǎn)生EmAb。而AcAb與免疫性疾病及多次流產(chǎn)有關(guān)，主要作用于血管導致胎盤供血不足而流產(chǎn)。但本研究顯示，在生育力正常人群中仍存在一定比例的免疫性抗體陽性率，推測可能由于正常人FcγRIIB水平相對較高，可對機體免疫耐受進行調(diào)節(jié)，進而削弱了上述抗體的作用，不會對正常妊娠造成較大影響。

本研究通過對比檢測免疫性不孕癥患者與正常人血清可溶性FcγRIIB相關(guān)指標，對FcγRIIB在免疫性不孕癥中的相關(guān)機制進行了分析。研究顯示，免疫性不孕癥患者FcγRIIB表達水平低于正常人。由于FcγRIIB下調(diào)可引起對B細胞活化的抑制作用不足，可能是導致免疫性抗體表達水平較高，進而導致不孕癥的原因之一。關(guān)于FcγRIIB表達下調(diào)的機制有待進一步研究，而FcγRIIB有望成為免疫性不孕癥治療途徑上的靶標分子。

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Preliminary Study on Function and Mechanism of FcγRIIB in Immune Infertility Patients

JIA Li-juan1, CAO Xiu-qin2, WANG Qin3

(1.Department of Pathogenic Biology and Immunology,School of Basic Medicine,Ningxia Medical University, Yinchuan750004,China; 2.Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance,Ministry of Education,Yinchuan 750004,China; 3.Deparmtent of Pathogenic Biology and Immunology, School of Basic Medicine,Ningxia Medical University, Yinchuan 750004,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of the effect of FcγRIIB on immune infertility by detecting of immuno-antibodies and FcγRIIB in immune infertility patients and normal people.Methods30 cases of immune infertility patients were selected as observation group, and 30 cases of normal female as control group in the same period. The level of FcγRIIB, binding capacity with immune complexes(IC) and immuno-antibodies were detected by ELISA, and compared between the two groups.ResultsThe level of FcγRIIB in the observation group was lower than those of the control group(t=-9.528,P<0.0001), and the difference was statistically significant. The binding capacity with IC of FcγRIIB in observation group was higher than the control group at the same DNA incubation concentration. The positive rate of AsAb, AcAb and other immuno-antibodies in the observation group was higher than that of the control group(P<0.05), the difference was statistically significant.ConclusionThe decrease of expression level of FcγRIIB may be related to the occurrence and development of immune infertility.

infertility；immunologic factors；FcγRIIB；pathogenesis

1672-688X(2017)01-0018-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.01.006

2016-12-30

1.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學與免疫系，寧夏銀川 750004

2.寧夏醫(yī)科大學生育力保持省部級共建教育部重點實驗室，寧夏銀川 750004

佳莉娟(1975—)，女，河南洛陽人，主治醫(yī)師，從事感染與免疫研究工作。

王琦，男，教授，E-mail：wqmxm@126.com

R271.14

A

3.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學與免疫系，寧夏銀川 750004