郭夢(mèng)麗，王建剛，靳 穎，段一夢(mèng)

壁虎醇提物急性毒性研究

郭夢(mèng)麗，王建剛，靳 穎，段一夢(mèng)

目的 觀察壁虎醇提物對(duì)小白鼠的急性毒性作用。方法 運(yùn)用急性毒性的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行半數(shù)致死量(LD50)的計(jì)算。預(yù)實(shí)驗(yàn)用較大范圍壁虎醇提物試液少量動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)求出致死范圍，然后在全數(shù)致死量和零致死量之間將實(shí)驗(yàn)用小白鼠分為5組，計(jì)算各組劑量公比，每組10只雄性小白鼠，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄后運(yùn)用改良寇氏法進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果 灌胃給予壁虎醇提物，小鼠無(wú)死亡出現(xiàn)，但活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，1 h后恢復(fù)正常，小白鼠每日灌胃的最大耐受量(MTD)為48.0 g·kg-1。經(jīng)腹腔注射給藥的LD50為6.475 g·kg-1，95%可信限為6.862～6.088 g·kg-1。結(jié)論 壁虎醇提物毒性極小，臨床應(yīng)用相對(duì)較安全。

壁虎醇提物；急性毒性試驗(yàn)；半數(shù)致死量；最大耐受量

壁虎作為一種傳統(tǒng)中藥具有祛風(fēng)定驚、散結(jié)解毒的功能[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)壁虎有抑制惡性腫瘤、改善組織中血液供應(yīng)、抑菌、降低血壓、平喘等作用，很具藥物開(kāi)發(fā)潛力[2]。目前，隨著壁虎逐漸應(yīng)用于臨床，其藥理作用已有不少報(bào)道[3]，但其成分復(fù)雜，對(duì)于測(cè)定壁虎的急性毒性作用及安全用量的研究還不是很豐富。本研究用改良寇氏法測(cè)定壁虎醇提物半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)，研究壁虎醇提物的急性毒性作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)壁虎藥用價(jià)值及其臨床應(yīng)用提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑與藥品 多疣壁虎粉(安徽省亳州市永剛飲業(yè)廠(chǎng)有限公司，批號(hào)：090301，經(jīng)河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心王曉利高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物 雄性BALB/c小鼠，120只，體質(zhì)量18～24 g，河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)scxk2015-0007)。

1.1.3 主要儀器 電子分析天平(上海梅特勒—托利多儀器有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)、L50膠體磨(上海諾尼輕工機(jī)械有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司)、加熱磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司)、PHS-3C型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 壁虎醇提物的制備 取壁虎干粉(多疣壁虎粉)100 g溶解于蒸餾水500 mL中，用磁力攪拌器攪拌至全部溶解為無(wú)團(tuán)狀粉末，用膠體磨研磨 4 h。取出膠體磨中勻漿液，置于離心管中，用高速離心機(jī)5 500 r·min-1離心5 min，棄去上清，取所剩沉淀。將沉淀用蒸餾水溶解，定容至300 mL，加入無(wú)水乙醇367 mL(使乙醇終濃度為55%)攪拌均勻后置4 ℃冰箱，每隔0.5 h攪拌1次(攪拌4 h)后，置于離心管中，用高速離心機(jī)5 500 r·min-1離心5 min，棄去沉淀，取上清，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(水浴鍋溫度控制在50 ℃)，蒸去酒精(可回收再利用)，負(fù)壓冷凍干燥機(jī)凍干得到壁虎醇提物干粉[4]。

1.2.2 灌胃給藥LD50及最大耐受量測(cè)定 配制不同濃度(800、667、600、556、500、463 mg·mL-1)壁虎醇提物試液，然后將禁食12 h的小鼠進(jìn)行灌胃給藥(分別以0.3 mL·10 g-1劑量用1 mL 注射器將新配制的不同濃度壁虎醇提物灌胃)，空白組小鼠等體積注射用水灌胃，每日給藥2次，每次間隔12 h，給藥后小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，自然光照，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度60%。連續(xù)觀察7 d小鼠的毒性反應(yīng)，包括行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、食欲、大小便、呼吸，口、鼻、眼、耳、肛門(mén)等有無(wú)異常分泌物，毛發(fā)、體質(zhì)量變化及死亡等情況。使用小鼠能夠耐受而不引起死亡的最大耐受量(maximum tolerated dose,MTD)[5]。第8日對(duì)未死亡小鼠進(jìn)行稱(chēng)重并斷頸處死，觀察小鼠內(nèi)臟器官的變化。

1.2.3 腹腔注射給藥LD50的測(cè)定 配制不同濃度(800、714、650、600、550、500 mg·mL-1)壁虎醇提物，然后以0.1 mL·10 g-1劑量用2.5 mL注射器分別將新配制的不同濃度的壁虎醇提物腹腔注射，預(yù)實(shí)驗(yàn)得引起動(dòng)物0%死亡的劑量(most non lethal dose, Dn)=0.0500 g·10 g-1，引起動(dòng)物100%死亡的劑量(minimum lethal dose, Dm)=0.080 g·10 g-1。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果，在Dn=500 mg·mL-1和Dm=800 mg·mL-1的劑量范圍內(nèi)設(shè)置5個(gè)劑量組，各劑量組的動(dòng)物相等。組間劑量比值(1∶r)。在0%和100%死亡劑量范圍內(nèi)，各劑量組的公比如下式：

公式中n為分組數(shù)，則各組劑量分別是Dn，Dn·r，Dn·r2，Dn·r3，Dn·r4。由上述預(yù)實(shí)驗(yàn)可得出各劑量組的公比r=1.12。各組劑量分別為0.050、 0.056、0.063、0.071、0.080g·10g-1。

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分組標(biāo)號(hào)并準(zhǔn)確稱(chēng)重記錄，以0.1mL·10g-1劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射?？瞻捉M小鼠腹腔注射等體積注射用水。在注射2、4、8、16h，第2、3、4、5、6、7 日分別記錄小鼠生存狀況及體質(zhì)量變化，采用改良寇氏法測(cè)定壁虎醇提物的LD50。實(shí)驗(yàn)7d后，對(duì)未死亡小鼠進(jìn)行斷頸處死，觀察小鼠內(nèi)臟器官的變化(死亡率觀察時(shí)間：根據(jù)藥物作用快慢，觀察10～30min、24～72h，個(gè)別為7d。最小劑量藥物組的死亡率不得超過(guò)20%，而最大劑量藥物組的死亡率不得少于80%)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 灌胃給藥 由于測(cè)不出壁虎醇提物的LD50，而其試液最大濃度為0.8g·mL-1，實(shí)驗(yàn)組小白鼠按最大給藥體積0.3mL·10g-1給藥，全部存活，與空白組對(duì)照未見(jiàn)任何異常狀況，均活動(dòng)自如。觀察7d，第8日稱(chēng)體質(zhì)量后處死實(shí)驗(yàn)組小白鼠，解剖發(fā)現(xiàn)胃充盈，腸無(wú)脹氣。解剖肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、胃、腸及胸腔、腹腔等器官均無(wú)異常。給藥前體質(zhì)量為(24.40±1.60)g，第8日體質(zhì)量為(28.70±2.40)g。測(cè)定出小白鼠每日灌胃的最大耐受量為48.0g·kg-1。

2.2 腹腔注射給藥

2.2.1 小鼠死亡情況 最小劑量藥物組的死亡率不得超過(guò)20%，而最大劑量藥物組的死亡率不得少于80%。本實(shí)驗(yàn)小白鼠死亡情況結(jié)果見(jiàn)表1。當(dāng)壁虎醇提物注射劑量為5 000mg·kg-1時(shí)，該組小鼠無(wú)死亡，說(shuō)明在此濃度下壁虎醇提物對(duì)小鼠毒性極小。當(dāng)壁虎醇提物注射劑量為8 000mg·kg-1時(shí)，該組小鼠全死亡，說(shuō)明在此濃度下壁虎醇提物對(duì)小鼠毒性較大。

表1 急性小鼠毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：LgD即為注射劑量D以10為底的對(duì)數(shù)。

2.2.2 計(jì)算LD50(改良寇氏法) LD50=log-1[Xm-i(ΣP-0.5)](mg·kg-1)。式中Xm為最大劑量的對(duì)數(shù)(3.903)，ΣP為各組動(dòng)物死亡率總和(230%)，i為相鄰兩組劑量的對(duì)數(shù)之差(0.05104)或相鄰兩組劑量比值的對(duì)數(shù)。將上列各組數(shù)代入公式得：LD50=log-1[3.903-0.051 (2.3-0.5)](mg·kg-1)=log-13.811=6474.68(mg·kg-1)≈6.475(g·kg-1)

2.2.4 小鼠體質(zhì)量變化 在注射2、4、8、16 h，第2、3、4、5、6、7 日分別記錄小鼠的體質(zhì)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照小鼠體質(zhì)量的變化相比，給藥組小鼠隨著時(shí)間的增加體質(zhì)量均有增加(若死亡較多則不計(jì)平均體質(zhì)量)。

2.2.5 毒性反應(yīng)表現(xiàn) 給藥后開(kāi)始出現(xiàn)自發(fā)活動(dòng)明顯減少、嗜睡、反應(yīng)遲鈍、不喜動(dòng)、少食、步履不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)、雙側(cè)上瞼明顯下垂；2 h后大劑量組小鼠毒性表現(xiàn)加重，拒食，并出現(xiàn)呼吸困難；4 h后大劑量組小鼠開(kāi)始出現(xiàn)呼吸抑制、震顫、驚厥，甚至出現(xiàn)了中毒死亡現(xiàn)象。給予實(shí)驗(yàn)小鼠注射壁虎醇提物的劑量越大，小鼠的毒性癥狀則出現(xiàn)得越早且越重，小鼠的死亡率相應(yīng)越高，且死亡時(shí)間相應(yīng)越短。與對(duì)照小鼠解剖后的各內(nèi)臟器官的變化比較說(shuō)明實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔無(wú)感染，且小鼠死亡前體質(zhì)量均有增加。

3 討論

隨著癌癥發(fā)病率和死亡率的逐年升高，尋找高效并且低毒的抑制癌癥的方法或藥物有著相當(dāng)重要的現(xiàn)實(shí)意義。常規(guī)的化療方案常伴隨有嚴(yán)重的毒副反應(yīng)及耐藥現(xiàn)象，如胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、免疫功能降低等，限制了全程劑量的使用，從而影響療效[6-9]。近年來(lái)，開(kāi)發(fā)無(wú)毒副作用的天然藥物治療癌癥已成為眾多研究者的焦點(diǎn)[10]。壁虎作為傳統(tǒng)中藥治病已有悠久的歷史[11-13]。壁虎有解毒消堅(jiān)、排膿生肌作用，對(duì)多種惡性腫瘤，尤其是乳腺癌、胃癌、肺癌、宮頸癌肝癌、食管癌等都有很好的療效[14]。根據(jù)大量關(guān)于壁虎的臨床報(bào)道顯示，壁虎抑制消化道腫瘤具有獨(dú)特的療效，且毒副作用相對(duì)較小[15]。因此，壁虎在癌癥防治方面具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。壁虎的化學(xué)成分經(jīng)氨基酸測(cè)定含有17種氨基酸:甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、組氨酸、酪氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、賴(lài)氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸等，水溶部分經(jīng)灰化后火焰光譜分析含有18種微量元素(錳、磷、銀、鈉、鉀、鐵、鈣等)，并含維生素C、D和鋅。另有研究發(fā)現(xiàn)壁虎中還含有水分、灰分、粗蛋白、胡蘿卜素、粗纖維、脂肪等[3]。

由于壁虎有效成分的提取和制備方法不同，其成分、含量和穩(wěn)定性不同，急性毒性不同，作用也不同，比如壁虎中所含抗腫瘤有效成分的類(lèi)別、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等尚不明確，在一定程度上限制了壁虎的開(kāi)發(fā)與使用[16]，還有待進(jìn)一步的研究。

本次對(duì)壁虎醇提物的急性毒性研究中，灌胃給藥結(jié)果顯示，壁虎醇提物的毒性較小，但能夠引起小鼠食欲減退。腹腔注射給藥結(jié)果顯示，低濃度藥物的毒性作用較小，不會(huì)引起小鼠死亡。給藥后短期內(nèi)實(shí)驗(yàn)小鼠食欲不振，精神萎靡，4 h后小鼠狀態(tài)逐漸恢復(fù)正常；但隨著藥物濃度的增加，開(kāi)始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡前小鼠眼睛模糊、精神不振，甚至出現(xiàn)驚厥。經(jīng)改良寇氏法計(jì)算出的半數(shù)致死量顯示壁虎醇提物的毒性不大。兩種給藥途徑小鼠均出現(xiàn)食欲不振、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、眼睛模糊、反應(yīng)低下等不良反應(yīng)。但其毒性較小，不會(huì)對(duì)藥效產(chǎn)生太大影響。本研究測(cè)定壁虎醇提物經(jīng)灌胃給藥對(duì)小白鼠無(wú)明顯毒性作用。經(jīng)腹腔注射的LD50為6.475 g·kg-1，說(shuō)明壁虎醇提物的給藥途徑不同，其毒性及其表現(xiàn)也不同。因此，臨床應(yīng)用時(shí)口服給藥較注射給藥安全，副作用相對(duì)腫瘤化療藥來(lái)說(shuō)較小[17]。本實(shí)驗(yàn)中所用的壁虎醇提物的提取方法為無(wú)水乙醇提法[18]，提取方法不同可能導(dǎo)致其有效活性成分發(fā)生變化，應(yīng)對(duì)比不同提取方法的壁虎醇提物的急性毒理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。而且，壁虎醇提物對(duì)小鼠的毒性作用部位靶器官，需要在慢性毒理實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步明確。

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Acute Toxicity of Alcohol Extract from Gecko with Mice

GUO Meng-li, WANG Jian-gang, JIN Ying, DUAN Yi-meng

(Key Laboratory of Pharmacology and Medical Molecular Biology,Medical College, Henan University of Science and Technology,Luoyang 471000,China)

ObjectiveTo investigate the acute toxicity of alcohol extract from gecko with mice.MethodsThe median lethal dose (LD50) was investigated by using acute toxicity test. A small amount of mice with large dose range administration of alcohol extract from gecko were used to find out the lethal range in preliminary experiment, and between total and zero lethal dose experimental male mice were divided into five groups(10 male mice per group) and the dose ratio of each group was calculated. The results were calculated with improved Kou′s method.ResultsNo death appeared in mice with intragastric administration, and reduction of activities and languishment were found during one hour after administration. The maximum tolerated dose (MTD) of was 48.0 g·kg-1. LD50 by intraperitoneal injection was 6.475 g·kg-1in mice and 95% confidence limit was 6.862～6.088 g·kg-1.ConclusionThis study suggested that alcohol extract of gecko was very small toxicity and relative safe in clinical application.

gecko alcohol extract；acute toxicity test；median lethal dose；maximum tolerated dose

1672-688X(2017)01-0004-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.01.02

河南省科技重點(diǎn)攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(102102310063)

2016-10-18

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，藥理學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng) 471003

郭夢(mèng)麗(1993—)，女，河南駐馬店人，從事腫瘤藥理研究。

王建剛(1961—)，男，教授，E-mail：ylwjg@163.com

R285.5

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