李亞杰，熊善柏，尹 濤,*，張 晉，尤 娟，胡 楊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國(guó)家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北 武漢 430070）

4 種骨的納米化加工及其制品的特性

李亞杰1,2，熊善柏1,2，尹 濤1,2,*，張 晉1,2，尤 娟1,2，胡 楊1,2

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國(guó)家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北 武漢 430070）

以魚骨、豬骨、牛骨和雞骨為原料，采用高能濕法球磨的方法制備納米骨液，比較研究4 種納米骨液的特性，以期為納米骨液的加工和應(yīng)用提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，4 種骨的化學(xué)組成有顯著性差異（P＜0.05），魚骨的灰分含量最高，而雞骨的脂肪和粗蛋白含量最高。高溫（120 ℃）預(yù)處理后，4 種骨的PO34－官能團(tuán)的特征吸收峰位置和強(qiáng)度無(wú)顯著性差異，魚骨位于1 450～1 700 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)的蛋白特征吸收峰與其他3 種的顯著不同。魚骨顆粒的平均粒徑在1 h球磨后降低至納米級(jí)別（162 nm），在2 h球磨后為135 nm，而豬骨、牛骨和雞骨的平均粒徑分別在2、2 h和5 h球磨后小于200 nm，4 種骨的最小平均粒徑依次分別為117、105、89 nm和153 nm。在球磨過程中，骨液的鈣釋放率呈線性增加，pH值先增加后保持穩(wěn)定，亮度和白度逐漸增加，游離氨基酸和三氯乙酸可溶性肽含量逐漸增加。與其他3 種骨相比，魚骨的納米化粉碎效率和制品的白度最高，為加工納米骨液相對(duì)最適宜的原料。

動(dòng)物骨；濕法球磨；納米顆粒；理化性質(zhì)

歷次全國(guó)營(yíng)養(yǎng)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)居民鈣的日常攝入量?jī)H為推薦量的一半，缺鈣現(xiàn)象較為普遍[1]。缺鈣會(huì)導(dǎo)致佝僂、骨質(zhì)疏松和免疫力下降等疾病，使人體進(jìn)入亞健康狀態(tài)[2]。因此，人們（特別是兒童和老人等特殊人群）除了通過從日常飲食中攝入一定量的鈣以外，還可能需要通過食用補(bǔ)鈣產(chǎn)品等方式補(bǔ)充不足的鈣。骨是畜、禽和水產(chǎn)品等制品加工過程中產(chǎn)生的主要固態(tài)副產(chǎn)物之一，例如豬、牛、雞和魚中骨的含量分別占動(dòng)物總體質(zhì)量的12%～20%、15%～20%、8%～17%和8%～10%[3]。骨中富含鈣，豬骨、牛骨、雞骨和魚骨中總鈣的含量分別為150.8、83.1、29.1、197.7 g/kg[4-5]。目前，副產(chǎn)物骨主要加工為飼料，其經(jīng)濟(jì)附加值低。直接丟棄這些副產(chǎn)物更會(huì)造成環(huán)境污染。如何合理加工和利用這些副產(chǎn)物是制約食品加工業(yè)發(fā)展的瓶頸技術(shù)之一，也日益成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

骨是理想的天然低價(jià)鈣源，可加工成高鈣食品或者添加劑，用于補(bǔ)充人體所需要的鈣。在骨粉和骨泥等制品的加工中，降低骨的粒徑不僅可降低或消除其在咀嚼過程中產(chǎn)生的沙礫感，還可以顯著提高骨鈣的生物利用率[6-8]。Yin Tao等[9]報(bào)道了以高能濕法球磨制備納米魚骨液的方法，并發(fā)現(xiàn)添加納米魚骨液到魚糜凝膠中可有效地起到強(qiáng)化鈣和增強(qiáng)魚糜凝膠強(qiáng)度的作用[10]。納米魚骨液為牛奶狀乳白色液體[9]，可直接加工成補(bǔ)鈣制品或者廣泛地添加于不同食品原料中，用于補(bǔ)充人體所需的鈣。相對(duì)于以往的骨制品，納米骨液可能具有鈣生物利用率高、添加后對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)影響小和具有一定的功能特性等優(yōu)點(diǎn)。不同骨的化學(xué)組成、層級(jí)結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性不同，例如豬骨、牛骨和雞骨的脂肪含量較高，而魚骨中的脂肪含量相對(duì)較低[4-5]；在層級(jí)結(jié)構(gòu)中，豬等哺乳動(dòng)物骨的膠原纖維以有序排列方式形成完整的螺旋結(jié)構(gòu)，而魚骨的膠原纖維無(wú)完整螺旋結(jié)構(gòu)[11]；另外，豬骨和牛骨剛性強(qiáng)而韌性較弱，魚骨卻正好相反。原料差異可能會(huì)影響骨的納米化加工難易程度及其產(chǎn)品的特性。但是，目前關(guān)于豬骨、牛骨和雞骨的納米化產(chǎn)品制備和特性的研究還鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以牛骨、豬骨、雞骨和魚骨為原料，采用高能濕法球磨的方法制備4 種納米骨制品，并比較研究4 種納米骨制品的特性，以期為副產(chǎn)物骨的納米化加工和應(yīng)用提供加工參數(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚骨為白鰱魚糜加工過程中經(jīng)采肉后分離得到的脊骨，由荊州大明水產(chǎn)食品有限公司提供。牛骨、豬骨和雞骨為剔除肉后的脊骨，采購(gòu)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。4 種骨經(jīng)冰水漂洗后，－18 ℃凍藏備用。所用化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZM-100型反壓高溫蒸煮鍋 廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司；JL-8型立式絞肉機(jī) 北京市華聯(lián)工業(yè)有限公司；MKCA6-2型骨泥機(jī) 日本Masuko公司；MINI ZETA 03E濕法高能球磨機(jī) 德國(guó)耐馳儀器制造有限公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度分析儀、Mastersizer 3000超高速智能粒度分析儀 英國(guó)馬爾文公司；AA-6300C原子吸收分光光度計(jì) 日本島津公司；VISTAMPX電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國(guó)Varian公司；C R-4 0 0型色差儀 日本柯尼卡-美能達(dá)公司；NEXUS-470傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)梅特勤公司。

1.3 方法

1.3.1 納米骨液的制備

工藝流程：冷凍原料骨→常溫解凍→加水漂洗除去血污和部分脂肪→高溫蒸煮（120 ℃、60 min）→傾倒蒸煮液并再次漂洗→絞肉機(jī)粗破碎（篩板孔徑3 mm）→骨泥機(jī)破碎（2 000 r/min、磨盤間隙0.3 mm）→加水調(diào)整骨泥總固形物質(zhì)量濃度為5 g/100 mL→高能濕法球磨機(jī)納米化粉碎（3 000 r/min、磨球填充率85%、磨球直徑0.5 mm）→納米骨液。

1.3.2 化學(xué)組成的測(cè)定

1.3.1 節(jié)制備的骨泥在105 ℃干燥后，進(jìn)行化學(xué)組成的測(cè)定。粗蛋白含量和灰分含量測(cè)定分別采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法和GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》中灰化法；粗脂肪的測(cè)定參考何海情[12]的方法，先用6 mol/L鹽酸80 ℃條件下水解骨粉，再用乙醚提取脂肪，最后烘干稱質(zhì)量。礦物質(zhì)組成測(cè)定參照Ersoy等[13]的方法，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

1.3.1 節(jié)制備的骨泥的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析參考Boutinguiza等[14]的方法。骨泥真空冷凍干燥后粉碎，與溴化鉀質(zhì)量比為1∶100混合均勻并壓成半透明薄片，用傅里葉變換紅外光譜儀分析，波數(shù)掃描范圍為400～4 000 cm－1。

1.3.4 粒徑的測(cè)定

1.3.1 節(jié)制備的骨液中顆粒粒徑的測(cè)定參照Yin Tao等[9]的方法，并略作改動(dòng)。測(cè)試前，加去離子水調(diào)整納米骨液固形物質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL，加入六偏磷酸鈉作為分散劑，調(diào)整分散劑的質(zhì)量濃度為0.2 g/100 mL，接著在功率100 W條件下超聲處理10 min。粒徑范圍位于微米級(jí)的樣品采用Mastersizer 3000超高速智能粒度分析儀測(cè)定，而粒徑范圍位于納米級(jí)的樣品采用Zetasizer Nano納米粒度分析儀測(cè)定。

1.3.5 微觀形態(tài)的觀測(cè)

納米骨顆粒微觀形態(tài)的觀測(cè)參照Yin Tao等[9]的方法。納米骨液加去離子水稀釋至質(zhì)量濃度為10－4g/mL，超聲波分散，滴加到表面渡碳的銅網(wǎng)上，室溫條件下靜置過夜，最后在120 kV電壓和亮場(chǎng)條件下用透射電子顯微鏡觀測(cè)。

1.3.6 鈣釋放率的測(cè)定

鈣釋放率的測(cè)定參考Zhang Jin等[15]的方法，并略作改動(dòng)。精確稱取10 g骨液，置于37 ℃恒溫水浴搖床中，100 r/min振蕩提取3 h，接著4 000 r/min離心30 min，取上清液過濾，加去離子水定容和稀釋。最后用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定稀釋液中鈣含量。鈣的釋放率為測(cè)定的可溶性鈣含量與骨液中總鈣含量的百分比（%）。

1.3.7 游離氨基酸、三氯乙酸可溶性肽和水溶性蛋白含量的測(cè)定

稱取10 g骨懸液，4 000 r/min離心30 min，取上清液過濾，加去離子水定容和稀釋，采用茚三酮法測(cè)定游離氨基酸含量[16]，采用福林-酚法測(cè)定水溶性蛋白含量[17]。稱取5 g骨懸液，加入5 mL 的20%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），均質(zhì)，靜置1 h沉淀大分子蛋白，4 000 r/min離心30 min，取上清液過濾，定容和稀釋，采用福林-酚法測(cè)定上清液中的可溶性肽含量[17]。

1.3.8 色度值的測(cè)定

樣品置于CM-A128培養(yǎng)皿中，用色度儀測(cè)定L*、a*和b*，測(cè)試前色度儀用標(biāo)準(zhǔn)白板校正。L*為樣品的明度，范圍為0～100，0表示黑色，100表示白色；a*為樣品的紅度，正值時(shí)表示偏紅，負(fù)值時(shí)表示偏綠；b*為樣品的黃度，正值時(shí)表示偏黃，負(fù)值時(shí)表示偏藍(lán)。W（白度）值的計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

所有指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次。采用Office 2007軟件作圖，用SAS V8.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚骨、豬骨、牛骨和雞骨的化學(xué)組成

表 1 4 種骨的基本化學(xué)組成（x±s, n=3）Table 1 Proximate compositions of four kinds of bones (x± s, n = 3)

魚骨、豬骨、牛骨和雞骨的基本化學(xué)組成如表1所示。4 種骨的蛋白質(zhì)含量為16%～34%，粗脂肪含量為6%～11%，灰分含量為52%～69%。不同骨的粗蛋白、粗脂肪和灰分含量有顯著性差異（P＜0.05）。其中魚骨的灰分含量最高，粗蛋白和脂肪含量最低；而雞骨的灰分含量最低，粗蛋白和脂肪含量最高。畜禽骨的脂肪和蛋白質(zhì)含量顯著高于魚骨的（P＜0.05），這與劉麗莉[4]、馬國(guó)紅[5]等的報(bào)道相一致。

表 2 4 種骨的礦物質(zhì)組成（x±s, n=3）Table 2 Mineral compositions of four kinds of bones (x± s, n= 3)

由表2可知，4 種骨的礦物元素主要是C a（250～299 mg/g）和P（115～146 mg/g），其次是Mg（2.52～3.81 mg/g）和Na（2.21～6.63 mg/g）。動(dòng)物骨的無(wú)機(jī)物質(zhì)主要是無(wú)定形磷酸氫鈣（CaHPO4）和晶體型羥磷灰石 （Ca10(PO4)6(OH)2），這兩種鈣鹽表面上又吸附著Ca2＋、Mg2＋、Na＋、Cl－、HCO3－、F－及檸檬酸根等

離子[18]，因而Ca、P是動(dòng)物骨骼中主要無(wú)機(jī)成分，含量相對(duì)較高。除了Ca，4 種動(dòng)物骨還含有較多的Na、Mg、Zn和Fe元素，這幾種元素助于提高人體免疫、維持正常細(xì)胞代謝及參與合成血紅蛋白等[19]。不同骨的Ca和P含量有顯著的差異（P＜0.05）。其中雞骨和牛骨的Ca含量顯著高于魚骨和豬骨（P＜0.05），而雞骨中P含量顯著低于其他3 種骨（P＜0.05）。

2.2 魚骨、豬骨、牛骨和雞骨顆粒的粒徑分布和微觀形態(tài)

圖 1 4 種骨樣品的平均粒徑與球磨時(shí)間的關(guān)系Fig. 1 Relationship between average particle size of four bone samples and ball-milling time

高能濕法球磨過程中，不同骨的平均顆粒粒徑變化如圖1所示。魚骨、豬骨、牛骨和雞骨在球磨前的初始平均粒徑分別為9、16、17 μm和29 μm。經(jīng)過1 h的球磨，魚骨顆粒的平均粒徑降低至納米級(jí)別（162 nm），而其他3 種骨的平均粒徑仍在微米級(jí)別（2～5 μm）。豬骨、牛骨和雞骨的平均粒徑分別在2、2 h和5 h球磨后小于200 nm。魚骨較豬骨和牛骨更易破碎到納米級(jí)別，雞骨最難破碎到納米級(jí)別，其主要原因可能與4 種骨中蛋白質(zhì)含量（表1）和熱變性、降解特性有關(guān)[15,20-21]。在天然的骨組織中，礦物質(zhì)嵌入膠原蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，形成的有機(jī)物-無(wú)機(jī)物復(fù)合結(jié)構(gòu)使骨同時(shí)具有較高的韌性和硬度，可以有效地抵抗一定外力對(duì)骨的破壞。一般而言，膠原蛋白含量高的骨應(yīng)變能力更強(qiáng)，較難被破碎[22]。骨膠原蛋白在高溫條件下發(fā)生變性和熱降解[23]，有序的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，顯著降低骨的破碎難易程度。不同骨膠原蛋白對(duì)高溫（120 ℃）的耐受度不同，魚骨膠原蛋白在高溫條件下可能更容易發(fā)生變性和降解。魚骨和豬骨的顆粒平均粒徑在球磨6 h時(shí)達(dá)到最小，分別為117 nm和105 nm，牛骨和雞骨的顆粒平均粒徑在球磨5 h時(shí)達(dá)到最小，分別為89 nm和153 nm。不同納米骨顆粒的極限粒徑大小可能主要是與無(wú)機(jī)的羥基磷灰石含量有關(guān)[14]。圖1結(jié)果表明，高能濕法球磨可以有效地降低不同來源骨的顆粒到納米級(jí)別，而骨的納米化破碎難易程度和極限粒徑大小受原料特性的影響。

圖 2 球磨6 h制備的4 種納米骨顆粒的粒徑分布Fig. 2 Particle size distribution of four nanosized bone particles with 6 h milling

圖 3 球磨6 h制備的4 種納米骨顆粒的的透射電子顯微鏡圖Fig. 3 TEM images of four nanosized bone particles with 6 h milling

圖2顯示了球磨6 h制備的4 種納米骨的粒徑分布。納米魚骨、豬骨和牛骨顆粒的粒徑分布較為集中（20～450 nm），納米雞骨顆粒的粒徑分布較廣（20～1 000 nm）。4 種納米骨顆粒的粒徑分布范圍可能與原料中膠原蛋白和羥基磷灰石的組成比例有關(guān)。納米骨顆粒近似為圓球形（圖3）。根據(jù)透射電子顯微鏡結(jié)果估算魚骨、豬骨、牛骨和雞骨顆粒在球磨6 h后的平均粒徑分別為97、74、93、104 nm，略小于激光粒度儀測(cè)定的粒徑大小，這是因?yàn)榧す饬６葍x測(cè)定的平均粒徑為顆粒的水合直徑，其值大于顆粒的實(shí)際直徑[24]。

2.3 魚骨、豬骨、牛骨和雞骨納米骨液的pH值

圖 4 4 種骨液樣品的pH值與球磨時(shí)間的關(guān)系Fig. 4 Relationship between pH of four bone samples and milling time

從圖4可以看出，未經(jīng)高能濕法球磨的4 種骨液為弱堿性，pH值之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。4 種骨液的pH值隨著球磨時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加（P＜0.05），豬骨、牛骨和雞骨液的pH值在球磨2 h后達(dá)到最大值（pH 10.0～11.0），魚骨在球磨5 h后達(dá)到最大值（pH 10.0～11.0）。在球磨過程中，豬骨、牛骨和雞骨液的pH值無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而顯著高于魚骨液的pH值（P＜0.05）。經(jīng)過6 h的球磨后，4 種骨液的pH值之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。有文獻(xiàn)報(bào)道，納米顆粒表面存在不定性區(qū)域，在球磨過程中酸性基團(tuán)數(shù)目減少，顆粒中的金屬陽(yáng)離子（Ca2＋、Na2＋和Mg2＋等）溶解釋放，造成pH值的增加[25-26]。Yin Tao等[9]研究發(fā)現(xiàn)納米魚骨顆粒表面的Ca/P在濕法球磨過程中顯著降低，說明以羥基磷灰石形態(tài)存在的Ca釋放到水中。另一方面，球磨過程中pH值的增加也可能與骨膠原蛋白部分降解生成堿性氨基酸有關(guān)。堿性氨基酸中氨基數(shù)比羧基數(shù)多，溶液表現(xiàn)為堿性，例如0.01 mol/L的賴氨酸水溶液的pH值為9.98左右[27]。魚骨液的pH值在球磨過程中顯著低于其他骨液（P＜0.05），這可能與魚骨液的游離氨基酸含量相對(duì)較低有關(guān)。關(guān)于原料差異對(duì)納米骨液pH值的影響還需要進(jìn)一步研究。

2.4 魚骨、豬骨、牛骨和雞骨納米骨液的鈣釋放率

不同球磨時(shí)間的4 種納米骨液的鈣釋放率如圖5所示。未球磨的4 種骨液的鈣釋放率分別為0.13%（魚骨）、0.10%（豬骨）、0.08%（牛骨）和0.08%（雞骨）。骨中鈣的釋放率極低，其原因是骨中的鈣主要是以溶解度低的羥基磷灰石形式存在，而且羥基磷灰石嵌插到膠原蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)的孔隙中難以與水接觸[28]。在球磨過程中，4 種骨液的鈣離子釋放率均隨著球磨時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加（P＜0.05），這主要是與骨粒的表面積增加和膠原纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)[29]。球磨6 h后，納米魚骨、豬骨、牛骨和雞骨液的鈣釋放率分別為1.99%、2.19%、2.49%和1.81%，與未球磨的骨液相比分別提高了14、22、31、22 倍。魚骨和其他3 種骨顆粒的粒徑分別在球磨1 h和3 h后降速顯著變緩（圖1），然而4 種骨液的鈣釋放率隨著球磨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈線性逐漸增加，其原因可能是與球磨過程中生產(chǎn)了可溶性的氨基酸/多肽螯合鈣有關(guān)。添加納米骨液到食品中，釋放的鈣離子增加可能會(huì)改善部分食品的品質(zhì)，例如魚糜制品的質(zhì)地[10]。關(guān)于降低魚骨顆粒粒徑和生成可溶性的氨基酸/多肽螯合鈣對(duì)納米骨鈣生物利用率的影響還需要進(jìn)一步研究。

圖 5 4 種納米骨液的鈣釋放率與球磨時(shí)間的關(guān)系Fig. 5 Relationship between release rate of calcium from four bone samples and milling time

2.5 魚骨、豬骨、牛骨和雞骨骨懸液的色度

4 種納米骨液的色度參數(shù)見表3。隨球磨時(shí)間的延長(zhǎng)，4 種骨液的L*值（明度）和W值（白度）均顯著性增加（P＜0.05），魚骨和牛骨液的b*值（黃色）較顯著增加（P＜0.05），豬骨和雞骨液的b*值變化較?。≒＜0.05）。L*值的在球磨過程中逐漸增加可能是與納米顆粒的粒徑降低有關(guān)。納米魚骨液的L*值和W值最高，其次是納米豬骨和牛骨液的，雞骨的最低。魚骨沒有完整的哈佛氏系統(tǒng)，脊髓、血管和神經(jīng)存在于魚骨的中央管中，而其他動(dòng)物的骨中交錯(cuò)貫通著骨陷窩、骨小管及Volksmnan管，他們與骨髓直接相連來輸運(yùn)骨中的代謝物質(zhì)[30-31]。經(jīng)過前處理后，存在魚骨中的血液和代謝物較其他動(dòng)物骨易去除，因此納米魚骨液的W值最高。納米魚骨液的L*值和W值最高，添加到魚肉、面粉和米粉等底色為白色的食品中，對(duì)產(chǎn)品的感官品質(zhì)影響最小。而雞骨較暗和偏黃，可能會(huì)限制其在部分食品中的應(yīng)用。

表 3 球磨過程中4 種納米骨懸液的色度Table 3 Color parameters of four bone nanoparticle suspensions with different milling times

表 3 球磨過程中4 種納米骨懸液的色度Table 3 Color parameters of four bone nanoparticle suspensions with different milling times

注：同行肩標(biāo)小寫字母不同表示有顯著性差異（P＜0.05）；同列肩標(biāo)大寫字母不同表示同一色度參數(shù)值不同磨球時(shí)間之間有顯著性差異（P＜0.05）。表4同。

色度球磨時(shí)間/h骨種類魚骨豬骨牛骨雞骨L*072.66±0.08Ea60.17±0.65Eb54.14±1.12Ec49.29±0.50Dd173.11±0.83Ea65.45±0.34Cb58.02±0.11Dd60.36±0.31Ac276.26±0.54Da64.44±0.08Db58.12±0.13Dd60.13±0.36ABc377.97±0.28Ca65.30±0.13DCb58.86±0.05CDd59.91±0.33ABc480.28±0.09Ba66.85±0.31Cb60.17±0.12BCc59.48±0.61BCc580.83±0.42ABa71.78±1.22Bb61.50±0.20Bc59.12±0.65Cd681.24±0.01Aa74.77±1.96Ab65.02±1.37Ac58.96±0.25Cda*0－1.46±0.01Cd1.10±0.16Ac5.22±0.43Ab6.10±0.15Aa1－1.56±0.20Dc－0.68±0.02Bc1.16±0.71Bb2.40±0.00Ba2－1.23±0.28BCbc－1.49±0.05Dc－0.78±0.33Cb1.01±0.04Ca3－0.98±0.02ABb－1.71±0.01DEc－0.98±0.15Cb0.24±0.06Da4－0.84±0.02Ab－1.77±0.12Ec－1.24±0.15Cb－0.25±0.17DEa5－0.87±0.08Ab－1.25±0.16Cc－1.52±0.04Cd－0.61±0.21Ea6－0.89±0.05Aa－1.22±0.21Ca－0.94±0.54Ca－0.83±0.49Eab*01.66±0.28Bc7.79±0.08Bb8.39±0.16Bb10.12±0.24Ba10.52±0.43Cd7.58±0.34BCc9.45±0.03ABb11.14±0.40Aa21.91±0.83Bd6.82±0.04Dc8.96±0.13Bb10.66±0.18ABa33.12±0.05Ad6.77±0.07Dc9.08±0.55ABb10.42±0.23ABa43.37±0.19Ac6.94±0.25DCb9.15±0.53ABa10.26±0.41Ba53.65±0.32Ac8.50±0.45Ab8.97±0.09Bab10.17±0.47Ba63.85±0.21Ab8.54±0.17Aa10.45±1.56Aa10.24±0.37Ba072.57±0.10Ea59.39±0.65Eb53.08±1.12Ec47.93±0.42Cd173.05±0.83Ea64.62±0.26DCb56.95±0.09Dd58.75±0.19Ac276.14±0.50Da63.76±0.07Db57.17±0.16Dd58.72±0.30Ac377.73±0.28Ca64.6±0.12DCb57.85±0.07Dd58.58±0.26Ac479.97±0.06Ba66.08±0.26Cb59.11±0.23BCc58.2±0.49ABd580.47±0.47ABa70.49±1.05Bb60.44±0.22Bc57.87±0.52Bd680.83±0.05Aa73.33±1.92Ab63.45±0.88Ac57.69±0.17BdW

2.6 4 種骨泥的傅里葉變換紅外光譜分析

圖 6 4 種骨的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 6 FT-IR spectra of four bone samples

2 920 cm－1和2 850 cm－1處的兩個(gè)低強(qiáng)度峰為CH2基團(tuán)伸縮振動(dòng)峰，它們是骨有機(jī)質(zhì)的骨架振動(dòng)峰[14]。1 600～1 700 cm－1為酰胺Ⅰ帶峰，與膠原蛋白多肽骨架中C＝O基團(tuán)的伸縮振動(dòng)以及三股螺旋構(gòu)象的分子內(nèi)氫鍵有關(guān)，是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)[34]。1 540～1 600 cm－1為酰胺Ⅱ帶峰，與膠原蛋白的N—H彎曲振動(dòng)和C—N伸縮振動(dòng)有關(guān)[35]。1 240～1 450 cm－1為酰胺Ⅲ帶峰，是膠原蛋白的特征吸收峰，與三股螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)[36-37]。在1 450～1 700 cm－1范圍內(nèi)，豬骨、牛骨和雞骨的波形相似，而與魚骨的波形顯著不同，其原因可能主要是與原料骨膠原蛋白的熱穩(wěn)定性差異相關(guān)[38]。魚骨中的羥脯氨酸和脯氨酸含量較低，膠原蛋白在高溫條件下易變性，發(fā)生裂解和高級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變[29,38]。

2.7 4 種納米骨懸液的游離氨基酸、TCA可溶性肽和水溶性蛋白含量

表 4 球磨過程中4 種納米骨懸液的游離氨基酸、TCA可溶性肽、水溶性蛋白含量Table 4 The contents of free amino acids, TCA peptides and water soluble proteins in four bone nanoparticle suspensions with different milling times

如表4所示，在球磨過程中，4 種骨液的游離氨基酸含量、TCA可溶性肽含量顯著增加（P＜0.05），魚骨、豬骨和雞骨液的水溶性蛋白含量顯著增加（P＜0.05），而牛骨液增加不顯著（P＞0.05）。Wu Gangcheng等[39]發(fā)現(xiàn)超微粉碎鰱魚骨粉可以顯著提高其蛋白質(zhì)的溶出率，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論相一致。球磨后，魚骨液中游離氨基酸和水溶性蛋白含量增加最多，雞骨的TCA可溶性肽含量增加最多。4 種骨液中游離氨基酸、TCA可溶性肽和水溶性蛋白含量的差異可能與原料骨的組成和蛋白質(zhì)特性有關(guān)。蛋白質(zhì)在球磨過程中降解生成小肽和氨基酸可能是引起鈣釋放率在骨顆粒粒徑穩(wěn)定后繼續(xù)增加的主要原因。有文獻(xiàn)報(bào)道，氨基酸在堿性介質(zhì)中，受劇烈的外界條件影響，其兩側(cè)的羧基和氨基能與金屬離子聯(lián)結(jié)形成螯合物，其穩(wěn)定常數(shù)可高達(dá)107～1012[40]。

3 結(jié) 論

高能濕法球磨技術(shù)可以有效地用于加工納米骨液。球磨過程中，4 種骨液的鈣釋放率均顯著增加

（P＜0.05），其主要原因除了與骨顆粒的粒徑降低有關(guān)外，還可能與生成氨基酸/肽螯合鈣有關(guān)。魚骨、豬骨、牛骨和雞骨的納米化加工過程及其制品的特性有顯著性差異。魚骨較其他3 種骨的納米化破碎效率高，以其制備的納米骨液的顏色最白。

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Production and Properties of Four Kinds of Nano-Sized Bone Products

LI Yajie1,2, XIONG Shanbai1,2, YIN Tao1,2,*, ZHANG Jin1,2, YOU Juan1,2, HU Yang1,2
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. National R & D Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing (Wuhan), Wuhan 430070, China)

Nano-sized bone products were made from fish bone, pig bone, bovine bone and chicken bone using highenergy wet milling, respectively. Their properties were investigated in order to provide a theoretical foundation for the production and application of nano-sized bone products. The proximate compositions of bones of four different animals were signif i cantly different (P < 0.05). Brief l y, ash content was the highest in fi sh bone while crude fat and protein were the highest in chicken bone. After high temperature treatment (120 ℃), the wavenumbers and intensities of the characteristic absorption bands assigned to phosphate group (PO43-) did not signif i cantly change. However, the protein absorption bands at 1 450?1 700 cm-1were obviously different between fi sh bone and the others. Average particle size of fi sh bone was reduced to nanometer range (162 nm) after 1 h milling, and was 135 nm after 2 h milling, while average particle sizes of pig bone, bovine bone and chicken bone were below 200 nm after 2, 2 and 5 h milling, respectively. The minimum average particle size for fi sh bone, pig bone, bovine bone and chicken bone were 117, 105, 89 and 153 nm, respectively. During the milling process, the release rate of calcium linearly increased, pH increased and then kept steady, lightness and whiteness significantly increased, free amino acid and trichloroacetic acid-soluble peptide contents dramatically increased. Therefore, fi sh bone may be the most suitable material for producing nano-sized bone product with improved breakage eff i ciency and whiteness.

bone; wet milling; nanosized particle; physicochemical properties

10.7506/spkx1002-6630-201705007

TS209

A

1002-6630（2017）05-0038-07

李亞杰, 熊善柏, 尹濤, 等. 4 種骨的納米化加工及其制品的特性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(5): 38-44. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201705007. http://www.spkx.net.cn

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2016-06-23

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31601501）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng) （CARS-46-23）

李亞杰（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：2439331497@qq.com

*通信作者：尹濤（1986—），男，講師，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及副產(chǎn)物高值化利用。E-mail：yintao@mail.hzau.edu.cn