朱 潔，王紅寶，孔佳君，宋小飛，陶書(shū)田

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095）

梨幼果多酚的純化及其抗氧化性

朱 潔，王紅寶，孔佳君，宋小飛，陶書(shū)田*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095）

采用5 種大孔吸附樹(shù)脂分離純化梨幼果多酚，并測(cè)定其抗氧化性。結(jié)果表明，綜合分析吸附與解吸效果，NKA-9大孔樹(shù)脂性能較好，最適合用來(lái)純化梨幼果多酚；NKA-9大孔樹(shù)脂對(duì)梨幼果多酚進(jìn)行純化時(shí)，最適宜的條件為：將2 mg/mL的多酚提取液調(diào)至pH值為5.0，設(shè)定進(jìn)樣流速為1 mL/min，充分吸附，然后用70%的乙醇為洗脫液進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，洗脫流速為1 mL/min，用此方法純化后的梨幼果多酚的純度從6.23%提高到30.68%；梨幼果多酚粗品對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals，DPPH）自由基、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) radicals，ABTS＋·）、亞硝酸基的IC50值分別為：151.07、152.48、490.35 μg/mL；梨幼果多酚純品對(duì)DPPH自由基、ABTS＋?、亞硝酸基的IC50值分別為：122.12、130.78、392.09 μg/mL；純化后的多酚樣品抗氧化能力比粗品有所增強(qiáng)。

大孔樹(shù)脂；梨幼果多酚；純化；抗氧化性

朱潔, 王紅寶, 孔佳君, 等. 梨幼果多酚的純化及其抗氧化性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(5): 14-20. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705003. http://www.spkx.net.cn

ZHU Jie, WANG Hongbao, KONG Jiajun, et al. Purification and antioxidant activity of polyphenols from young pear fruits[J]. Food Science, 2017, 38(5): 14-20. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705003. http://www.spkx.net.cn

梨屬于薔薇科梨屬，在我國(guó)栽培歷史悠久，已種植3 000多年。梨中不僅富含蛋白質(zhì)、維生素、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，還含有如兒茶素、沒(méi)食子酸等酚類物質(zhì)[2-3]。研究證明，多酚類物質(zhì)在梨幼果中廣泛存在[4]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，因?yàn)槭杌ㄊ韫蚶鏄?shù)本身正常的生理落果，許多梨幼果被丟掉，使多酚類物質(zhì)被大量浪費(fèi)。因此應(yīng)當(dāng)對(duì)梨幼果加以充分利用。

植物多酚（plant polyphenol）別名單寧，包含所有多羥基類化合物，通過(guò)植物體的次生代謝過(guò)程產(chǎn)生，含量很高，主要存在于植物的根、莖、葉、皮、核和果肉中[5-7]。因?yàn)橹参锒喾又泻写罅康姆恿u基，所以其具有清除自由基等抗氧化活性。多酚類物質(zhì)對(duì)自由基的清除作用在其他物種上已有很多報(bào)道，比如蘋(píng)果皮渣多酚能夠還原Fe3＋，清除2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) radicals，ABTS＋·）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧陰離子自由基[8]；板栗總苞多酚能夠清除DPPH自由基和ABTS＋·[9]；玫瑰果多酚對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基都有清除作用[10]。但是，關(guān)于梨多酚對(duì)自由基的清除作用的報(bào)道卻較少。

植物多酚具有抗氧化、抗腫瘤等多種生理功能[11-13]，但因?yàn)槠胀ǖ娜軇┨崛》ㄌ崛〉亩喾哟痔嵋褐须s質(zhì)較多，會(huì)對(duì)多酚含量及其活性的測(cè)定產(chǎn)生干擾，所以將多酚粗提液進(jìn)行純化，得到純度更高的多酚物質(zhì)，對(duì)其后續(xù)研究至關(guān)重要。目前多酚的純化方法主要有：層析法、沉淀分離法、色譜分離法、大孔樹(shù)脂吸附法等。大孔吸附樹(shù)脂是一種性質(zhì)穩(wěn)定的高分子材料，不會(huì)受到酸堿和有機(jī)溶劑的影響，其具有的巨大比表面積，使得吸附容量很大，多孔性的結(jié)構(gòu)還能起到篩分的作用。同時(shí)，大孔樹(shù)脂還能再生可以重復(fù)利用，既環(huán)保又降低了成本，是目前分離純化多酚類物質(zhì)應(yīng)用較廣泛的一種方法[14]。雖然大孔樹(shù)脂純化多酚類物質(zhì)的研究很多，但是在梨多酚的純化上卻鮮有報(bào)道。

因?yàn)樵谏a(chǎn)上梨幼果被大量丟棄，其所含的多酚類資源被浪費(fèi)，所以本實(shí)驗(yàn)以梨幼果為材料，采用5 種大孔吸附樹(shù)脂分離純化梨幼果多酚，篩選出最適樹(shù)脂，并對(duì)梨多酚純化的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，為梨幼果的充分利用和梨多酚的純化及其進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梨幼果：‘翠冠’幼果（花后一個(gè)月）采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦梨資源圃。

A B-8型、D 1 0 1型、S-8型大孔吸附樹(shù)脂上海源葉生物公司；X-5型大孔吸附樹(shù)脂 安徽三星樹(shù)脂有限公司；NKA-9型大孔吸附樹(shù)脂 鄭州華溢有限公司；沒(méi)食子酸、福林-酚、無(wú)水碳酸鈉、DPPH、VC、ABTS等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA1203精密電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；臺(tái)式恒溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)市華美生化儀器廠；水浴鍋 上海新苗醫(yī)療器械有限公司；玻璃層析柱（25 mm×300 mm） 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 梨幼果多酚粗提液的制備

將梨幼果果肉用液氮速凍研磨成粉末，加入60%的乙醇溶液，溶液和樣品比為30∶1（V/m），70 ℃水浴避光浸提2 h，然后12 000 r/min離心20 min，取上清液，就是梨幼果多酚粗提液[15]。

1.3.2 多酚含量的測(cè)定

將沒(méi)食子酸作為基準(zhǔn)物質(zhì)，用福林-酚法[16]測(cè)定梨幼果多酚含量?；貧w方程為y=0.003 3x＋0.064 3，R2=0.999 3。

1.3.3 大孔吸附樹(shù)脂純化梨幼果多酚

1.3.3.1 樹(shù)脂的預(yù)處理

用95%的乙醇浸泡各種大孔吸附樹(shù)脂24 h，再用去離子水沖洗至無(wú)酒精味道。接著用5%的NaOH溶液浸泡8 h，然后蒸餾水沖洗至中性，再用5%的HCl溶液浸泡8 h，蒸餾水處理至中性，預(yù)處理活化結(jié)束[17]。

1.3.3.2 最佳樹(shù)脂類型的選擇

將活化后的5 種樹(shù)脂各稱取1 g，加入50 mL梨多酚粗提液，放在25 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床上避光充分振蕩24 h，測(cè)定上清液的多酚質(zhì)量濃度。過(guò)濾，所得樹(shù)脂用蒸餾水沖洗幾次，再加入50 mL 70%的乙醇溶液進(jìn)行解吸，對(duì)解吸液的多酚質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。吸附量、吸附率、解吸率的計(jì)算見(jiàn)公式（1）～（3）：

式中：C0為吸附前粗提液的多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Cl為吸附后梨幼果多酚質(zhì)量濃度/（m g/m L）；V1為加入梨幼果多酚粗提液體積/mL；m為樹(shù)脂質(zhì)量/g；C2為解吸液中梨幼果多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V2為解吸液體積/mL；W為吸附量/（mg/g）。

1.3.3.3 靜態(tài)吸附曲線的測(cè)定

稱取活化后的NKA-9樹(shù)脂1 g，加入50 mL的多酚粗提液，放在25 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床上避光充分振蕩24 h，隔一段時(shí)間取一次樣，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度。分別以時(shí)間和吸附率為橫縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附曲線。

1.3.3.4 靜態(tài)解吸曲線的測(cè)定

將吸附飽和的樹(shù)脂，用蒸餾水沖洗幾次，放在100 mL錐形瓶中，加入50 mL 70%的乙醇，在25 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床上避光充分振蕩24 h，隔一段時(shí)間取一次樣，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度。分別以時(shí)間和解吸率為橫縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)解吸曲線。

1.3.3.5 pH值對(duì)吸附效果的影響

將活化后的NKA-9樹(shù)脂稱取5 份，每份各1 g，并加入20 mL多酚粗提液，然后用0.01 mol/L 的氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調(diào)節(jié)梨多酚粗提液的pH值至 3、4、5、6、7。于25 ℃、120 r/min 恒溫?fù)u床避光充分振蕩吸附24 h后，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附率。

1.3.3.6 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

將活化后的NKA-9樹(shù)脂稱取7份，每份各1 g，加入不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）的梨幼果多酚粗提液，于25 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床避光充分振蕩吸附24 h后，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附率。

1.3.3.7 上樣速率對(duì)吸附效果的影響

稱取活化的樹(shù)脂20 g，濕法裝進(jìn)內(nèi)徑2.5 cm、高30 cm的層析柱中，首先用去離子水平衡層析柱，后將多酚粗提液分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速進(jìn)行上樣吸附，將流出液進(jìn)行收集，并對(duì)其多酚質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.8 洗脫劑種類對(duì)解吸率的影響

將活化后的NKA-9樹(shù)脂稱取5份，每份各1 g，加入20 mL多酚粗提液，于25 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床避光充分振蕩吸附24 h后，測(cè)定其多酚質(zhì)量濃度，并計(jì)算其吸附量。把吸附飽和的樹(shù)脂取出用蒸餾水沖洗幾次，然后放到100 mL的錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇、乙醇和乙酸乙酯溶液50 mL，于25 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床避光充分振蕩解吸24 h后，對(duì)解吸液中多酚的質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算其解吸率。

1.3.3.9 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

將活化后的NKA-9樹(shù)脂稱取5 份，每份各1 g，加入20 mL多酚粗提液，于25 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床避光充分振蕩吸附24 h后，測(cè)定其多酚質(zhì)量濃度，并計(jì)算其吸附量。把吸附飽和的樹(shù)脂取出用蒸餾水沖洗幾次，然后放到100 mL的錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為 40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液50 mL，于25 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床避光充分振蕩解吸24 h后，對(duì)解吸液中多酚的質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算其解吸率。

1.3.3.10 洗脫劑洗脫流速對(duì)解吸率的影響

將20 g樹(shù)脂放在燒杯中，加入100 mL的多酚粗提液，充分振蕩吸附24 h，測(cè)定吸附后溶液的多酚質(zhì)量濃度，并計(jì)算其吸附量。將吸附飽和的樹(shù)脂濕法裝進(jìn)內(nèi)徑2.5 cm、高30 cm的層析柱中，用去離子水沖洗樹(shù)脂去除雜質(zhì)，然后用70%乙醇溶液分別以0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，將洗脫液進(jìn)行收集，并對(duì)其多酚質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 梨幼果多酚的抗氧化性測(cè)定

1.3.4.1 總抗氧化能力測(cè)定

總抗氧化能力測(cè)定采用亞鐵還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法，梨幼果多酚的總抗氧化能力測(cè)定參照章丹丹等[18]的方法。先將3.6 mL的FRAP溶液（現(xiàn)配）加入到試管中，然后加入35 μL不同質(zhì)量濃度的梨幼果多酚提取液，靜置10 min后于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。FRAP溶液由3 種溶液配制：0.3 mol/L的pH 3.6醋酸鹽緩沖液，溶于40 mmol/L HCl溶液的2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-striazine，TPTZ）和FeCl3溶液以10∶1∶1（V/V）混合。吸光度越高說(shuō)明總抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.4.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.2 mL，加入0.8 mL 60 μmol/L的DPPH溶液（無(wú)水乙醇配制），混勻后反應(yīng)30 min（避光），在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為A1，用70%乙醇溶液代替樣品測(cè)定吸光度為A0，無(wú)水乙醇代替DPPH溶液測(cè)定吸光度為A2。DPPH自由基清除率的計(jì)算見(jiàn)公式（4）：

1.3.4.3 ABTS＋·清除率測(cè)定

ABTS母液配制：ABTS溶液（7 mmol/L）和過(guò)硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）以1∶1（V/V）混合搖勻。室溫放置12～16 h（避光）。然后將ABTS母液用10 mmol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋，稀釋液在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A0，要達(dá)到0.70±0.002。分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液50 μL，加入750 μL的ABTS測(cè)定液，混合均勻，充分反應(yīng)6 min，734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為A1，用無(wú)水乙醇溶液代替ABTS溶液測(cè)定吸光度為A2，ABTS＋·清除率的計(jì)算同公式（4）。

1.3.4.4 亞硝酸基清除率測(cè)定

分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液500 μL，加入亞硝酸鈉溶液（5 μg/mL）250 μL，振蕩搖勻，37 ℃水浴30 min，然后加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液250 μL，搖勻靜置15 min，再加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液125 μL，混合均勻顯色15 min，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1，將樣品換為乙醇其他條件不變測(cè)的吸光度為A0，無(wú)水乙醇代替顯色劑測(cè)定吸光度A2，亞硝酸基清除率的計(jì)算同公式（4）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

對(duì)X-5、AB-8、D101、S-8、NKA-9 5 種樹(shù)脂的吸附解吸效果進(jìn)行比較，篩選最適樹(shù)脂。所用的5 種樹(shù)脂的物理性質(zhì)見(jiàn)表1，這5 種大孔樹(shù)脂對(duì)于梨幼果多酚的吸附率和解吸率的結(jié)果如圖1所示。

表 1 5 種大孔樹(shù)脂的物理特性Table 1 Physical properties of fi ve macroporous resins

圖 1 5 種大孔樹(shù)脂的吸附率和解吸率Fig. l Adsorption and desorption rates of 5 macroporous resins

從圖1可以看出，吸附率最高的是S-8樹(shù)脂，為85.13%，NKA-9樹(shù)脂次之；S-8樹(shù)脂雖然吸附率很高，但是解吸率很低，僅為53.89%，D101樹(shù)脂和NKA-9樹(shù)脂的解吸率都較高。綜合考慮，NKA-9樹(shù)脂的吸附率和解吸率都較高，故NKA-9樹(shù)脂為純化梨幼果多酚的最適樹(shù)脂。

以上結(jié)果說(shuō)明大孔樹(shù)脂吸附性能的好壞與樹(shù)脂的極性有較大關(guān)系。李鴻江等[19]指出極性樹(shù)脂對(duì)極性物質(zhì)有較強(qiáng)的吸附效果。S-8和NKA-9樹(shù)脂都是極性樹(shù)脂，所以容易吸附極性的梨幼果多酚。艾志錄等[20]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于蘋(píng)果多酚的純化效果最佳的也是NKA-9樹(shù)脂。

2.2 NKA-9樹(shù)脂的靜態(tài)吸附解吸分析

2.2.1 NKA-9樹(shù)脂的靜態(tài)吸附曲線

圖 2 NKA-9樹(shù)脂靜態(tài)吸附曲線Fig. 2 Static adsorption curve of NKA-9 resin

如圖2所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)樹(shù)脂的吸附率變化越來(lái)越小，逐漸趨于平緩，2 h后NKA-9樹(shù)脂的吸附基本達(dá)到飽和，即使時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，吸附率也幾乎不再變化，所以NKA-9大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附時(shí)間為2 h。

圖 3 NKA-9大孔樹(shù)脂靜態(tài)解吸曲線Fig. 3 Static desorption curve of NKA-9 resin

2.2.2 NKA-9樹(shù)脂的靜態(tài)解吸曲線如圖3所示，在2 h時(shí)NKA-9樹(shù)脂基本已經(jīng)達(dá)到解吸平衡，解吸時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)解吸率也幾乎不再變化，此時(shí)其解吸率可以達(dá)到74.45%。所以NKA-9大孔樹(shù)脂的靜態(tài)解吸時(shí)間為2 h。

2.2.3 pH值對(duì)吸附效果的影響

圖 4 pH值對(duì)吸附效果的影響Fig. 4 Effect of pH on adsorption eff i ciency

如圖4所示，溶液的酸性或堿性太強(qiáng)都會(huì)降低NKA-9樹(shù)脂對(duì)梨幼果多酚的吸附率。在pH值較低時(shí)，NKA-9樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附率逐漸增加，pH 5時(shí)吸附率最大，達(dá)到85.19%；pH＞5以后，溶液堿性越來(lái)越強(qiáng)，NKA-9樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附率下降，所以最適pH值為5。

pH值不同之所以能夠?qū)е聵?shù)脂吸附效果的不同，是由多酚類物質(zhì)的酸堿性造成的。在酸性條件下，樹(shù)脂對(duì)于酸性物質(zhì)的吸附效果好；在堿性溶液中，樹(shù)脂對(duì)于堿性物質(zhì)的吸附效果好[21]。梨幼果多酚中由于存在咖啡酸、綠原酸等酚酸類物質(zhì)，所以其溶液呈弱酸性，在弱酸性條件下梨幼果多酚多數(shù)呈分子態(tài)，且形成共價(jià)結(jié)構(gòu)，以氫鍵的方式與樹(shù)脂結(jié)合吸附，故在pH值為5時(shí)吸附效果較好。

2.2.4 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

將不同質(zhì)量濃度梨幼果多酚粗提液充分振蕩吸附。上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響如圖5所示。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度較低時(shí)，NKA-9樹(shù)脂對(duì)梨幼果多酚的吸附率逐漸增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL時(shí)吸附率最大，為51.78%；質(zhì)量濃度超過(guò)2.0 mg/mL后，吸附率幾乎不再變化，所以2.0 mg/mL為最適的質(zhì)量濃度。當(dāng)多酚溶液質(zhì)量濃度較低時(shí)，被樹(shù)脂吸附的多酚分子較少，不能使樹(shù)脂達(dá)到飽和狀態(tài)，增大多酚溶液的濃度，可以使更多的多酚分子與樹(shù)脂接觸，從而被其吸附[10]。但是隨著多酚溶液的質(zhì)量濃度增大，樹(shù)脂吸附的多酚分子越來(lái)越多最終達(dá)到飽和，再增大多酚的質(zhì)量濃度，其吸附率也不會(huì)改變，反而會(huì)出現(xiàn)沉淀，阻塞樹(shù)脂。

圖 5 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響Fig. 5 Effect of sample concentration on adsorption eff i ciency

2.2.5 上樣速率對(duì)吸附效果的影響

圖 6 上樣速率對(duì)吸附效果的影響Fig. 6 Effect of sample loading fl ow rate on adsorption eff i ciency

如圖6所示，上樣速率為0.5 mL/min時(shí)的吸附率與1.0 mL/min時(shí)的吸附率差距不大，隨后上樣流速逐漸加快，其吸附率反而呈下降趨勢(shì)。當(dāng)上樣速率較慢時(shí)，多酚分子能有更多的時(shí)間與樹(shù)脂接觸，使其被充分吸附，增加吸附率。隨著上樣速率的加快，多酚分子與樹(shù)脂接觸的時(shí)間越來(lái)越短，還來(lái)不及被吸附，就已經(jīng)通過(guò)了樹(shù)脂，其吸附率迅速下降[22]。但是上樣速率過(guò)慢會(huì)延長(zhǎng)工作時(shí)間，增加成本。綜合考慮以上因素，本實(shí)驗(yàn)選擇上樣速率為1.0 mL/min。

圖 7 洗脫劑種類對(duì)靜態(tài)解吸率的影響Fig. 7 Effect of eluent type on static desorption eff i ciency

2.2.6 洗脫劑種類對(duì)解吸率的影響由圖7可知，洗脫劑的種類不同，解吸效果也不同，乙醇的解吸率顯著高于甲醇和乙酸乙酯（P＜0.05），洗脫效果最好，所以選擇乙醇為洗脫劑。梨多酚是混合物，含有很多成分，各成分極性不同，所以不同極性溶劑對(duì)多酚物質(zhì)的解吸率不同。

2.2.7 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

圖 8 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靜態(tài)解吸率的影響Fig. 8 Effect of ethanol concentration on static desorption eff i ciency

如圖8所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于70%時(shí)，其解吸率逐漸增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)解吸率最高為

92.95 %；隨后乙醇體積分?jǐn)?shù)再增大，其解吸率反而下降。梨幼果多酚與樹(shù)脂間形成氫鍵從而被吸附，乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，會(huì)增強(qiáng)對(duì)氫鍵的破壞作用，使多酚類物質(zhì)被洗脫下來(lái)[23]。但是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，其中含有的水分越來(lái)越少，一些水溶性多酚類物質(zhì)不能被溶解[24]，

所以解吸率降低。因此70%的乙醇溶液為梨幼果多酚的最佳解吸劑。

2.2.8 洗脫劑洗脫流速對(duì)解吸效果的影響

圖 9 乙醇洗脫流速對(duì)解吸效果的影響Fig. 9 Effect of ethanol fl ow rate on desorption eff i ciency

如圖9所示，當(dāng)洗脫流速為1.0 mL/min時(shí)其解吸率最高，為91.8%；當(dāng)洗脫流速超過(guò)1.0 mL/min時(shí)，繼續(xù)加快流速，解吸率開(kāi)始下降。洗脫流速較慢時(shí)，解吸液與樹(shù)脂接觸充分，能夠更好地破壞氫鍵，使多酚類物質(zhì)被解吸出來(lái)。隨著洗脫流速的加快，洗脫液與樹(shù)脂接觸的時(shí)間縮短，使得一部分多酚類物質(zhì)來(lái)不及被解吸出來(lái)，所以解吸率降低[25]。所以選擇1.0 mL/min做為解吸流速。

2.2.9 NKA-9樹(shù)脂對(duì)梨幼果多酚的純化效果

取梨幼果多酚粗提液及在最優(yōu)條件下純化的精提液進(jìn)行冷凍干燥，得到粗提物與純化物的粉末。分別將兩種粉末配成溶液，測(cè)定其質(zhì)量濃度，計(jì)算多酚純度，發(fā)現(xiàn)粗提物純度為6.23%，而純化物可達(dá)到30.68%，純度提高5 倍。

2.3 梨幼果多酚的抗氧化性

2.3.1 梨幼果多酚的總抗氧化能力

圖 10 梨幼果多酚的總抗氧化能力Fig. 10 Total antioxidant capacity of polyphenols from young pear fruits

抗氧化物在酸性溶液中可以將Fe3＋-TPTZ還原成藍(lán)色的Fe2＋-TPTZ，然后在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，就能得到被測(cè)液的總抗氧化能力[26]。梨幼果多酚粗提物、純化物和VC的總抗氧化能力如圖10所示，隨著多酚質(zhì)量濃度的增大，吸光度一直在增加，說(shuō)明多酚質(zhì)量濃度越高總抗氧化能力越強(qiáng)。純化物的總抗氧化能力低于VC，高于粗提物。梨幼果多酚經(jīng)NKA-9樹(shù)脂純化后，總抗氧化能力增強(qiáng)。

2.3.2 梨幼果多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果

圖 11 梨幼果多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig. 11 DPPH radical scavenging capacity of polyphenols from young pear fruits

多酚清除DPPH自由基的原理：多酚類物質(zhì)可以與DPPH自由基中存在的單電子配對(duì)，使其被還原，減弱其紫色醇溶液的顏色，然后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，吸光度變化越大則其清除能力越強(qiáng)[27]。由圖11可知，梨幼果多酚粗提物、純化物和VC都有清除DPPH自由基的能力，VC的清除效果最好，多酚純化物次之，多酚粗提物的效果最差。而且多酚的質(zhì)量濃度越大，對(duì)DPPH自由基的清除效果越好。梨幼果多酚經(jīng)樹(shù)脂純化后，對(duì)DPPH自由基的清除效果增強(qiáng)。

2.3.3 梨幼果多酚對(duì)ABTS＋·的清除效果

圖 12 梨幼果多酚對(duì)ABTS＋·的清除效果Fig. 12 ABTS radical scavenging capacity of polyphenols from young pear fruits

ABTS與氧化劑反應(yīng)會(huì)變成ABTS＋·自由基（藍(lán)綠色），多酚類物質(zhì)會(huì)將ABTS＋·還原成無(wú)色的ABTS，在734 nm或405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。吸光度變化越大，其清除能力越強(qiáng)。由圖12可知，梨幼果多酚粗提物、純化物和VC清除ABTS＋·的效果都很顯著，多酚純化物的清除率高于VC和多酚粗提物，最高能夠達(dá)到90%

以上，其清除效果最好。

圖 13 梨幼果多酚對(duì)亞硝酸基的清除效果Fig. 13 Nitritel scavenging capacity of polyphenols from young pear fruits

2.3.4 梨幼果多酚對(duì)亞硝酸基的清除效果梨幼果多酚粗提物、純化物和VC對(duì)亞硝酸基的清除效果如圖13所示，VC的清除效果高于多酚粗提物和純化物；多酚質(zhì)量濃度越高，對(duì)亞硝酸基的清除能力越強(qiáng)。梨幼果多酚經(jīng)NKA-9樹(shù)脂純化后對(duì)亞硝酸基的清除效果更佳。

2.3.5 IC50值法比較樣品的抗氧化活性

表 2 3 種樣品在不同抗氧化方法下的IC50值Table 2 IC50values of three samples in different radical scavenging assays

IC50可以用來(lái)判斷樣品的抗氧化活性，該值表示當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度。結(jié)果如表2所示，梨幼果多酚經(jīng)過(guò)純化后，抗氧化活性顯著增強(qiáng)，在這4 種方法中，純化物的清除能力均強(qiáng)于粗提物；在總抗氧化能力上，多酚純化物能力比VC強(qiáng)，在DPPH自由基、ABTS＋·和亞硝酸基的清除能力上，多酚純化物與VC相差不多，所以說(shuō)明梨幼果多酚具有抗氧化活性。

3 討論與結(jié)論

目前關(guān)于多酚類物質(zhì)的純化，在蘋(píng)果、葡萄和茶等物種中研究較多，在梨上卻鮮有報(bào)道。賀金娜等[28]對(duì)蘋(píng)果多酚的純化條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到的結(jié)果為：上樣質(zhì)量濃度1.46 mg/mL、上樣pH 5.50、上樣速率1.25 mL/min，洗脫劑種類丙酮、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)90%、洗脫速率1 mL/min；袁林穎等[29]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚純化的最優(yōu)條件為：上樣質(zhì)量濃度0.46 mg/mL、上樣流速1.4 mL/min、溶液pH 3.0、洗脫劑種類乙醇、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)80%、洗脫流速2.0 mL/min。這2 個(gè)研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論都不相同，這可能是由于物種不同，其中含有的多酚類物質(zhì)種類不同所致。

梨中含有兒茶素、沒(méi)食子酸等多酚類物質(zhì)，所以具有抗氧化活性。趙金偉等[30]研究證明蘋(píng)果梨酚類物質(zhì)可以有效清除羥自由基、DPPH自由基和亞硝酸基；李麗梅等[31]研究發(fā)現(xiàn)，梨的果皮、果肉、果心中含有的多酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基和羥自由基都有清除能力。他們的研究結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。但是他們所研究的是梨多酚的粗提物，其中所含的雜質(zhì)較多，對(duì)多酚抗氧化活性的測(cè)定會(huì)有影響，本實(shí)驗(yàn)將梨多酚粗提物進(jìn)行純化，對(duì)粗提物和純化物的抗氧化活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)梨多酚純化后其抗氧化活性顯著增強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)X-5、AB-8、D101、S-8、NKA-9 5 種樹(shù)脂的吸附率和解吸率進(jìn)行比較，篩選出吸附率和解吸率都較高的NKA-9樹(shù)脂為純化梨幼果多酚的最佳樹(shù)脂；通過(guò)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)得到NKA-9大孔樹(shù)脂對(duì)梨幼果多酚進(jìn)行純化時(shí)，最適宜的條件為：將2 mg/mL的多酚提取液調(diào)至pH值為5.0，設(shè)定進(jìn)樣流速為1 mL/min，充分吸附，然后用70%的乙醇為洗脫液進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，洗脫流速為1 mL/min；經(jīng)過(guò)NKA-9樹(shù)脂在最優(yōu)工藝條件下的純化，梨幼果多酚的純度從6.23%提高到了30.68%，純度提高5 倍；梨幼果多酚粗提物和純化物都有很強(qiáng)的總抗氧化能力，對(duì)DPPH自由基、ABTS＋·、亞硝酸基都有清除作用，經(jīng)NKA-9樹(shù)脂純化后的梨幼果多酚抗氧化能力明顯增強(qiáng)。

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Purif i cation and Antioxidant Activity of Polyphenols from Young Pear Fruits

ZHU Jie, WANG Hongbao, KONG Jiajun, SONG Xiaofei, TAO Shutian*
(College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The polyphenols from young pear fruits were purif i ed by 5 kinds of macroporous adsorption resins, and their antioxidant activity was determined. The results indicated that NKA-9 resin had better adsorption and desorption properties than four other resins. Therefore, it was the most suitable resin to purify polyphenols from young pear fruits. The optimum conditions for purification were as follows: after pH adjustment to 5.0, the polyphenol at 2 mg/mL was passed through the resin at a fl ow rate of 1 mL/min, followed by desorption with 70% ethanol at a fl ow rate of 1 mL/min. Under these conditions, the purity of the polyphenols from young pear fruits increased from 6.23% to 30.68%. Both the crude and purif i ed samples had the ability to scavenge 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS) radicals and nitrite, with IC50values of 151.07, 152.48 and 490.35 mg/mL versus 122.12, 130.78 and 392.09 mg/mL, respectively. Conclusively, the antioxidant capacity of the purif i ed polyphenols was better than that of the crude sample.

macroporous resins; polyphenols from young pear fruits; purif i cation; antioxidation

10.7506/spkx1002-6630-201705003

S661.2

A

2016-04-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31372044）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31000888）；

國(guó)家高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA10020602）

朱潔（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麑?shí)生理品質(zhì)。E-mail：458121514@qq.com

*通信作者：陶書(shū)田（1980—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣菲焚|(zhì)發(fā)育生理。E-mail：taost@njau.edu.cn