(新希望乳業(yè)控股有限公司產(chǎn)品研發(fā)中心，成都610063)

鼠李糖乳桿菌與嗜熱鏈球菌復(fù)配發(fā)酵乳的工藝優(yōu)化

曾麗萍，王欣璐，李啟明，聶遠(yuǎn)洋

(新希望乳業(yè)控股有限公司產(chǎn)品研發(fā)中心，成都610063)

通過研究分離自新疆傳統(tǒng)酸駱駝奶中的鼠李糖乳桿菌grx10的發(fā)酵特性，將鼠李糖乳桿菌grx10與不同發(fā)酵特性的嗜熱鏈球菌復(fù)配制作發(fā)酵乳，優(yōu)化了鼠李糖乳桿菌grx10的最適接種量和最適發(fā)酵溫度，評價了復(fù)配發(fā)酵乳的發(fā)酵特性、質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)，并測定了其乳酸菌活菌數(shù)。結(jié)果表明，優(yōu)化后的發(fā)酵工藝參數(shù)為：鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌st447復(fù)配，鼠李糖乳桿菌grx10的最適接種量為4%，最適發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時間為5 h，按照此工藝制得的發(fā)酵乳的總活菌數(shù)為1.32×109mL-1，鼠李糖乳桿菌grx10的活菌數(shù)為8.40×108mL-1，且口感、風(fēng)味和整體品質(zhì)俱佳，能同時滿足生產(chǎn)工藝及消費者對產(chǎn)品的需求。

發(fā)酵乳；工藝優(yōu)化；鼠李糖乳桿菌；嗜熱鏈球菌

0 引言

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnose)是一種能夠利用發(fā)酵性糖類產(chǎn)生乳酸的益生菌，具有抑制腸道中有害菌生長、降低血清膽固醇、提高免疫力等生理功能。

筆者實驗室就從新疆傳統(tǒng)酸駱駝奶中分離篩選到一株鼠李糖乳桿菌，體外實驗和動物實驗證明該菌株能耐受胃酸和膽汁酸，具有顯著的降低血清膽固醇功效。但研究表明，只有當(dāng)每天攝取的益生菌數(shù)量達(dá)到108～109才具有保健功效，而大多益生菌的發(fā)酵特性差不利于高活菌數(shù)益生菌產(chǎn)品的工業(yè)化和市場推廣。本研究對新疆酸駱駝奶中篩選到的鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵特性進(jìn)行研究，優(yōu)化發(fā)酵工藝，以期在不添加食品添加劑的條件下得到一款鼠李糖乳桿菌活菌數(shù)達(dá)到保健要求且品質(zhì)穩(wěn)定、良好口感的發(fā)酵產(chǎn)品，為進(jìn)一步推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1菌種

鼠 李 糖 乳 桿 菌 grx10（Lactobacillus rhamnosus grx10），一株分離自新疆傳統(tǒng)乳制品中具有降膽固醇功效的專利菌種（專利號：CN101328470），由河北一然生物科技有限公司代加工成凍干菌粉；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）st079，st447，st071，st328，st338，st077，st073，st446。

1.2主要試劑與儀器

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，CH3COONa 5 g，K2HPO42 g，MgSO4· 7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.2 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至6.2～6.4。

全自動生長曲線分析儀，物性測試儀（TA.XTPlus），恒溫培養(yǎng)箱（SPX-150BSH-II）、超凈工作臺（SW-CJ-2FD）、pH計（梅特勒FE20）等。

1.3方法

1.3.1 接種菌液的制備與活化

分別稱取鼠李糖乳桿菌grx10凍干菌粉2 g至50 mL 40℃滅菌水中和嗜熱鏈球菌凍干菌粉0.25 g至100 mL 40℃滅菌水中，搖勻并孵育10 min制成接種菌液。發(fā)酵接種量按接種的滅菌乳體積計算。

1.3.2 益生菌發(fā)酵乳制備工藝流程

配料（原料乳預(yù)熱至55℃加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%白砂糖和1.5%乳清蛋白粉充分溶解）→均質(zhì)（20～25 MPa）→殺菌（90℃，10～15 min）→冷卻至37℃→接種→發(fā)酵至凝乳（發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵終點pH值為4.5左右）→后熟（4℃，12 h）。所用菌種和接種量如表1所示。

表1 實驗用菌種

1.3.3 鼠李糖乳桿菌grx10單株菌發(fā)酵性能測定

生長曲線測定：取1.3.1制備的鼠李糖乳桿菌grx10接種液按3%的接種量接入已滅菌的MRS培養(yǎng)基中，混勻。在Bioscreen全自動生長曲線分析儀的檢測孔板中，每孔加入300 μL上述已接種培養(yǎng)基，并做三個重復(fù)孔[8]，將已加樣的檢測孔板置于Bioscreen全自動生長曲線分析儀中，37℃靜置培養(yǎng)20 h，每2 h自動掃描讀取每個加樣孔的A600值。

酸化曲線測定：將1.3.1制備的鼠李糖乳桿菌grx10接種液按3%的接種量接入已滅菌的酸奶發(fā)酵基料中，混勻后分裝于10個滅菌瓶中，37℃下靜置發(fā)酵，每隔2 h測定其pH值和滴定酸度，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，pH值和滴定酸度為縱坐標(biāo)，繪制鼠李糖乳桿菌grx10的生長曲線。

1.3.4 與鼠李糖乳桿菌grx10復(fù)配發(fā)酵的最適嗜熱鏈球菌的篩選

將1.3.1制備的鼠李糖乳桿菌grx10和嗜熱鏈球菌接種液按表1分別接入已滅菌的酸奶發(fā)酵基料中，混勻后在37℃下靜置發(fā)酵，至pH值達(dá)到4.5時終止發(fā)酵并記錄凝乳時間，然后置于4℃下后熟12 h，進(jìn)行pH值和滴定酸度測定、質(zhì)構(gòu)測定、感官評定并在光學(xué)顯微鏡下觀察乳酸菌形態(tài)，根據(jù)結(jié)果篩選最優(yōu)發(fā)酵組合。

1.3.5 鼠李糖乳桿菌grx10最適接種量的優(yōu)化

分別稱取4 g鼠李糖乳桿菌grx10凍干菌粉溶于50 mL滅菌水中，搖勻制備成接種液，同1.3.1制備的嗜熱鏈球菌接種液一起接種于已滅菌的酸奶發(fā)酵基料中，混勻后在37℃下靜置發(fā)酵，至pH值達(dá)到4.5時終止發(fā)酵并記錄凝乳時間，然后置于4℃下后熟12 h，進(jìn)行pH值和滴定酸度測定、質(zhì)構(gòu)測定、感官評定并在光學(xué)顯微鏡下觀察乳酸菌形態(tài)，根據(jù)結(jié)果確定最適的鼠李糖乳桿菌grx10接種量。

1.3.6 最適發(fā)酵溫度的優(yōu)化

按最適接種量取鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌一起接種于已滅菌的酸奶發(fā)酵基料中，混勻后在37℃下靜置發(fā)酵，至pH值達(dá)到4.5時終止發(fā)酵并記錄凝乳時間，然后置于4℃下后熟12 h，進(jìn)行pH值和滴定酸度測定、質(zhì)構(gòu)測定、感官評定并在光學(xué)顯微鏡下觀察乳酸菌形態(tài)，根據(jù)結(jié)果確定最適發(fā)酵溫度。

1.3.7 發(fā)酵乳酸度和pH值的測定

采用氫氧化鈉直接滴定法測定酸度，用pH計測定pH值[9]。

1.3.8 發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)測定

采用物性測試儀測定發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性，使用P0.5探頭（直徑0.5英寸的圓柱形探頭），測前速度0.5 mm/s，測后速度10.0 mm/s，感受力10 g，返回距離30 mm，測定樣品的黏度、堅實度和稠度指標(biāo)。樣品均重復(fù)測定三次[10-12]。

1.3.9 感官評定方法

感官評定小組由10名具有乳制品感官評定知識背景的人組成，以表觀特性、氣味、質(zhì)地、風(fēng)味、酸甜比作為主要評價指標(biāo)。組織、狀態(tài)測定：取適量樣品置于潔凈的平板中，在自然光下觀察色澤、組織狀態(tài)及切面；風(fēng)味、口感測定：先聞氣味，溫開水漱口后品嘗樣品[13]。

1.3.10 菌落計數(shù)

參照國標(biāo)GB 478935－2010的方法檢測發(fā)酵乳中的乳酸菌活菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1鼠李糖乳桿菌grx10單株菌的生長曲線和酸化曲線

鼠李糖乳桿菌grx10在培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對數(shù)期，在2～10 h內(nèi)，菌液OD600nm值迅速升高。從12 h開始，菌體培養(yǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，鼠李糖乳桿菌grx10的生長曲線如圖1所示。

圖1 鼠李糖乳桿菌grx10的生長曲線

發(fā)酵實驗結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌grx10的酸化速度比較緩慢，從4 h開始，酸度才有開始明顯提高，在4～12 h內(nèi)酸度上升較快，到12 h時酸度達(dá)到75°T，鼠李糖乳桿菌grx10的酸化曲線如圖2所示。

圖2 鼠李糖乳桿菌grx10的酸化曲線

由圖1與圖2的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鼠李糖乳桿菌grx10的生長進(jìn)入對數(shù)期時其酸度也明顯開始上升，鼠李糖乳桿菌grx10的生長曲線與酸化曲線的變化基本一致。分析原因可能是隨著鼠李糖乳桿菌grx10的生長繁殖，代謝產(chǎn)物（如乳酸等）不斷積累，整個發(fā)酵體系的酸度也隨之升高[14]。

2.2不同嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌grx10復(fù)配發(fā)酵

不同嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌grx10復(fù)配發(fā)酵后樣品的凝乳時間、酸度、pH、感官指標(biāo)如表2所示。方差分析結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，凝乳時間差異顯著，其中純鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵時間最長達(dá)12 h，與嗜熱鏈球菌進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵后，發(fā)酵時間顯著縮短（P＜0.05），與不同的嗜熱鏈球菌復(fù)配發(fā)酵的時間也存在差異，其中I組的發(fā)酵時間最短，但滴定酸度、凝乳pH值均差異不顯著（P＞0.05）。表2中，發(fā)酵產(chǎn)品的感官指標(biāo)均存在明顯差異，其中A、B、E、F、H組的產(chǎn)品均質(zhì)地粗糙松散，C、D、G均風(fēng)味平淡無特色，只有I組質(zhì)地細(xì)膩、口感柔和且有明顯的grx10發(fā)酵風(fēng)味。

不同嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌grx10復(fù)配發(fā)酵酸奶的質(zhì)構(gòu)特性結(jié)果如表3所示。表3中，各組樣品的硬度從大到小為B＞D＞H＞C＞I＞E＞F＞G＞A，即純鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵樣品的硬度最小，與嗜熱鏈球菌復(fù)配發(fā)酵樣品硬度均明顯提高，且B、C、D、H組均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；各組的稠度從大到小為D＞B＞C＞H＞I＞E＞F＞G＞A，即純鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵樣品的稠度最小，除了F、G兩組其于組的稠度均較A組顯著提高（P＜0.05）。黏聚性是用于模擬樣品的內(nèi)部粘合力，各組的黏聚性大小為D＞C＞G＞I＞B＞H＞E＞F＞A，即純鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵樣品的黏聚性最小，除了F組其于組樣品的黏聚性均顯著高于A組（P＜0.05）；黏性是模擬探頭與樣品接觸時用于克服兩者表面間吸引力所需工作，即反映了樣品的黏著性，各組的黏性指數(shù)大小為D＞C＞B＞I＞G＞H＞E＞F＞A，即A組的黏性指數(shù)最小，且顯著小于其于組（P＜0.05）。

表2 不同嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌grx10復(fù)配發(fā)酵結(jié)果

表3 不同嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌grx10復(fù)配發(fā)酵酸奶的質(zhì)構(gòu)特性

綜合各組的發(fā)酵特性、感官品評指標(biāo)以及發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，雖然純種鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵時間長、風(fēng)味難以讓人接受、質(zhì)構(gòu)指標(biāo)也差，但是與嗜熱鏈球菌復(fù)配發(fā)酵后，發(fā)酵特性、風(fēng)味與質(zhì)構(gòu)均得到了顯著改善，不同組之間也存在明顯差異。各組雖發(fā)酵時間均顯著縮短，但是B、E、F、H組均口感粗糙、質(zhì)地松散且質(zhì)構(gòu)大多指標(biāo)均差，C、D組雖硬度、稠度、黏聚性和黏性指數(shù)均高于明顯高于其它組，但是風(fēng)味平淡且太粘稠。分析原因可能是，鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵速率慢，產(chǎn)胞外多糖少，發(fā)酵乳黏度低有顆粒感，C、D、I組的嗜熱鏈球菌能產(chǎn)生較多胞外多糖，影響酪蛋白間的相互鏈接方式，對酪蛋白微球立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)建產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響凝膠結(jié)構(gòu)的形成，改善了發(fā)酵乳的質(zhì)地，同時鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌能協(xié)同生長，從而縮短了發(fā)酵時間。綜合以上結(jié)果，與鼠李糖乳桿菌grx10復(fù)配發(fā)酵益生菌酸奶的最適菌種為嗜熱鏈球菌st447。

2.3鼠李糖乳桿菌grx10最適接種量的確定

選用嗜熱鏈球菌st447與鼠李糖乳桿菌grx10進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，不同接種量發(fā)酵的凝乳時間、酸度、pH值、感官指標(biāo)如表4所示。方差分析表明，接種量對凝乳時間有顯著影響，其中A組的凝乳時間顯著長于B組和C組（P＜0.05），但是B組和C組無差異；滴定酸度、凝乳pH值均差異不顯著（P＞0.05），三個樣品的口感差異不顯著，均質(zhì)地細(xì)膩、口感順滑，但是B組鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵風(fēng)味更柔和且優(yōu)于A組和C組，A組的風(fēng)味太平淡而C組的鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵風(fēng)味太濃烈。

表4 不同接種量的鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵結(jié)果

不同接種量鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性結(jié)果如表5所示。由表5可以看出，接種量對發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)無明顯影響，均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。

表5 不同接種量的鼠李糖乳桿菌grx10發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性

綜合各組的發(fā)酵特性、感官品評指標(biāo)以及發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌grx10接種量的增加能縮短發(fā)酵時間，對口感和質(zhì)構(gòu)指標(biāo)無顯著影響。但是，隨著鼠李糖乳桿菌grx10添加量的增加能明顯提高鼠李糖乳桿菌grx10的發(fā)酵風(fēng)味，不過當(dāng)接種量為6%時其發(fā)酵風(fēng)味太濃烈，使得樣品整體風(fēng)味不太柔和。綜合以上結(jié)果，鼠李糖乳桿菌grx10的最適接種量為4%。

2.4最適發(fā)酵溫度的確定

接種嗜熱鏈球菌st447與鼠李糖乳桿菌grx10進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，不同溫度下發(fā)酵的凝乳時間、酸度、pH值、感官指標(biāo)如表6所示。方差分析結(jié)果表明，在42，37，33℃下復(fù)配發(fā)酵，凝乳時間差異極顯著（P＜0.01），凝乳時滴定酸度、pH值均差異不顯著（P＞0.05）。但發(fā)酵產(chǎn)品感官存在明顯差異，隨著發(fā)酵溫度的降低黏稠度逐漸增加，鼠李糖乳桿菌grx10的發(fā)酵風(fēng)味也逐漸變濃，但是42℃時風(fēng)味最柔和且還有濃濃的奶香。

不同發(fā)酵溫度下的復(fù)配發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性如表7所示。由表7可以看出，溫度除了對發(fā)酵產(chǎn)品的黏聚性沒顯著影響外，對硬度、稠度、黏性指數(shù)均存在顯著影響（P＜0.05），但37℃與33℃除了稠度達(dá)到顯著差異（P＜0.05），其他指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05），且硬度、稠度和黏性指數(shù)均隨溫度的降低而減小。

綜合各組的發(fā)酵特性、感官品評指標(biāo)以及發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，提高發(fā)酵溫度能有效縮短發(fā)酵時間，改善質(zhì)構(gòu)特性，且在42℃時風(fēng)味最佳。綜合以上結(jié)果，復(fù)配發(fā)酵乳的最適發(fā)酵溫度為42℃。

2.5最終發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)測定

表6 不同溫度下的復(fù)配發(fā)酵乳發(fā)酵結(jié)果

表7 不同發(fā)酵溫度對復(fù)配發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性的影響

鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌按4%接種量在42℃下復(fù)配發(fā)酵，產(chǎn)品活菌數(shù)計數(shù)結(jié)果見圖3，其總活菌數(shù)為1.32×109/mL-1，嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)為4.80×108/mL-1，鼠李糖乳桿菌grx10的活菌數(shù)為8.40×108/mL-1。由此可見，經(jīng)工藝優(yōu)化后，復(fù)配發(fā)酵乳的益生菌活菌數(shù)已達(dá)到起保健功效的要求。

圖3 復(fù)配發(fā)酵乳產(chǎn)品最終活菌數(shù)

3 結(jié)論

本研究對新疆傳統(tǒng)的酸駱駝奶中分離出的一株具有降低血清膽固醇功效的鼠李糖乳桿菌grx10的發(fā)酵特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，由于其發(fā)酵時間長、產(chǎn)酸慢，采用純種發(fā)酵其口感和風(fēng)味差等原因，極不利于該菌株的工業(yè)化應(yīng)用和市場推廣。因此通過研究鼠李糖乳桿菌grx10與不同發(fā)酵特性的嗜熱鏈球菌復(fù)配發(fā)酵，優(yōu)化了鼠李糖乳桿菌grx10的最適接種量和最適發(fā)酵溫度，最終確定其發(fā)酵工藝條件為：鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌st447復(fù)配，鼠李糖乳桿菌grx10的最適接種量為4%，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時間為5 h，最終發(fā)酵產(chǎn)品總活菌數(shù)為1.32×109/mL-1，鼠李糖乳桿菌grx10的活菌數(shù)為8.40×108/mL-1，通過感官分析并結(jié)合物性測試儀測定產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性等，表明復(fù)配發(fā)酵乳的口感、風(fēng)味和整體品質(zhì)俱佳，既達(dá)到保健功效作用又達(dá)到市售酸奶品質(zhì)、口感要求，并且配料簡單、無添加任何食品添加劑，滿足了消費者對健康食品的需求。

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Technological optimization of mixed fermented milk prepared by Lactobacillus rhamnosus and Streptococcus thermophiles

ZENG Liping,WANG Xinlu,LI Qiming,NIE Yuanyang
(Product Research Center,New Hope Dairy Holdings co.LTD,Chengdu 610063,China)

The aim of this experiment is to evaluate the mixed fermented milk which is fermented by Streptococcus thermophilus with different fermentation characteristics and Lactobacillus rhamnosus named grx10 which was isolated from camel yogurt in Xinjiang.By optimizing inoculation and fermentation temperature,we measured fermentation characteristics,texture properties,sensory quality,and its viable count of Lacticacid bacteria.The results showed that the optimal inoculation of Lactobacillus rhamnosus were 4%when it was fermented with Streptococcus thermophilus,the fermentation temperature was 42℃ and fermentation time was 5 h,the number of viable Lactobacillus rhamnosus was 8.40×108/ mL-1.Moreover,sensory evaluation results showed that,the taste and flavor of grx10 yogurt was well,which can satisfy both production and consumer’s demand.

fermented milk;technological optimization;Lactobacillus rhamnosus;Streptococcus thermophilus

TS252.54

A

1001-2230（2017）02-0047-04

2016-06-07

國家科技支撐計劃課題(2012BAD12B04)；四川省國際科技合作與交流研究計劃(2016HH0056)。

曾麗萍（1989-），女，碩士，從事乳品微生物方面的研究。

聶遠(yuǎn)洋