盧宇涵 徐青文 陳琳 孫潘威 張婷 趙烏蘭

耳毒性藥物作為造成聽力損害的原因之一，已在臨床上得到高度重視。慶大霉素作為等氨基糖苷類抗生素的代表性藥物，通過在內(nèi)耳淋巴液中濃度積累對耳蝸毛細(xì)胞和前庭毛細(xì)胞可造成不可逆的損傷，常常表現(xiàn)為延遲性、漸進性聽力下降、平衡障礙和耳鳴[1]。有研究表明這些損傷有可能是因為慶大霉素在淋巴液集聚后，對Corti's器內(nèi)的毛細(xì)胞、支持細(xì)胞等結(jié)構(gòu)造成損傷[2]，目前其損傷機制有鈣超載、氧自由基過量等。左西孟旦作為II型鈣增敏劑，不僅具有良好的抗細(xì)胞凋亡、抗氧自由基作用，還可不增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、不引起鈣超載。因此，本研究從慶大霉素對耳蝸毛細(xì)胞的損傷機制，探究和闡釋左西孟旦通過抗凋亡、抗氧自由基作用保護內(nèi)耳形態(tài)和功能的作用機制，為臨床所有藥物防治耳毒性藥物相關(guān)聽力損傷提供新的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物分組及給藥方法

由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供健康級DHP白化紅目白毛雌性豚鼠60只，體重300～330 g，合格證書：SCXK（滬）20130016。所有動物均通過preyer反射，無耳部疾病，查體無異常。實驗動物隨機分為6組：慶大霉素?fù)p傷組GM(gentamicin modelgroup)組，100 mg.kg-1.d-1,肌肉注射硫酸慶大霉素注射液，川芎嗪陽性對照組TMG(ligustrazine treatmentgroup)組，100 mg.kg-1.d-1肌肉注射硫酸慶大霉素注射液+10 mg.kg-1.d-1腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液聯(lián)合給藥，羥丙基-β-環(huán)糊精輔料對照組CD(hydroxyproplyl-β-cyclodextrin shamgroup)組，100 mg.kg-1.d-1肌肉注射硫酸慶大霉素注射液+350 mg.kg-1.d-1靜脈注射羥丙基-β-環(huán)糊精注射液聯(lián)合給藥，低劑量左西孟旦組LL(low dose of levosim endan tream entgroup)組，100 mg.kg-1.d-1肌肉注射硫酸慶大霉素注射液+1.5 mg.kg-1.d-1靜脈注射左西孟旦注射液聯(lián)合給藥，高劑量左西孟旦組HL(high dose of levosim endan treamentgroup)組，100 mg.kg-1.d-1肌肉注射硫酸慶大霉素注射液+2.5 mg.kg-1.d-1靜脈注射左西孟旦注射液聯(lián)合給藥）和正常對照組，聯(lián)合給藥時前后均存在30 min給藥間隔，造模連續(xù)用藥12 d。

1.2 藥品及試劑

硫酸慶大霉素注射液購自浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司，批號20150505；注射用鹽酸川芎嗪注射液購自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號150104D2；左西孟旦原料藥購自湖北武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥（化工）集團，批號2016011；羥丙基-β-環(huán)糊精購自西安德立化工有限公司，批號20150114。左西孟旦針劑配制方法按照中國人民共和國國家知識產(chǎn)權(quán)局專利《左西孟旦制劑及其制備方法》（專利號ZL03112427.5）實施例4標(biāo)準(zhǔn)配制，左西孟旦與羥丙基-β-環(huán)糊精摩爾比為1:30，針劑配制均嚴(yán)格遵照無菌要求。

1.3 主要儀器

聽性腦干誘發(fā)儀（ICS CHARTR RP 200,丹麥Madsen公司）；HM340E石蠟切片機（德國MICROM公司）；DMLB2型顯微鏡攝像機（德國LEICA公司）；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（中國上海精宏醫(yī)療設(shè)備有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫干燥箱（中國上海精宏醫(yī)療設(shè)備有限公司）；HI120型攤片機（德國Leica公司）。

1.4 聽性腦干誘發(fā)電位測試

ABR測試采用丹麥Madsen聽性腦干誘發(fā)儀CHARTR EP測試系統(tǒng)。實驗動物行1%戊巴比妥鈉30 mg?kg-1腹腔注射麻醉后，俯臥于保溫毯上。兩耳廓前沿連線中點顱頂為記錄電極入針點，參考電極插入外耳廓后軟組織內(nèi)，地極插入鼻尖處，在標(biāo)準(zhǔn)隔聲室內(nèi)用短聲click聲刺激，參數(shù)設(shè)置：采樣重復(fù)率為11.1次/秒，分析時程掃描周期為20 ms，帶通濾波為100～3000 Hz，信號疊加512次。起始聲刺激為90 dB nHL引出后逐步降低幅值10 dB直至無法引出可以重復(fù)的ABR波形，重復(fù)后仍未引出后以幅值5 dB提高刺激強度，以剛出II波和/或III波的刺激強度來確定ABR客觀聽力閾值。ABR測試行畢后立即斷頭取耳蝸，行常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測。

1.5 石蠟切片的HE染色

耳蝸組織外固定后行常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟10分×2次，無水乙醇3分×2次、95%乙醇2分×2次、80%乙醇2分×1次、70%乙醇2分×1次、至自然水化，Gill蘇木素染色液10分鐘，自然水洗2分，鏡下觀察時用0.5%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗、溫水藍(lán)化，95%乙醇1分鐘，0.5%伊紅乙醇染色液染色1分鐘，80%乙醇適當(dāng)分化，95%乙醇脫水3分鐘×2次，100%乙醇脫水3分鐘×2次，二甲苯透明5分鐘×2次、中性樹膠封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察切片并拍照。

1.6 免疫組化染色法

采用丹麥DAKO公司EnVisionTM二步法。石蠟切片后二甲苯脫蠟，采用高溫高壓法修復(fù)（0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液PH 6.0），3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加按比例稀釋的一抗孵育（CaV1.3為兔抗鼠多抗，工作濃度1:60，美國Gene Tex公司，編號GT16633；Capase-3為兔抗鼠多抗，工作濃度1:200，美國CST公司，編號#9662），用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)代替一抗為空白對照。PBS沖洗后滴加二抗（羊抗兔IgG-HRP），二氨基聯(lián)苯氨（diaminobenzidine,DAB)顯色；Harris蘇木素液復(fù)染細(xì)胞核，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.7 陽性結(jié)果判斷和定量分析

免疫組織化學(xué)陽性為黃色或黃棕色，細(xì)胞核襯染呈藍(lán)色。采用圖像分析系統(tǒng)測量，在顯微鏡（×200）下選擇確定毛細(xì)胞區(qū)域并拍照。使用Image-ProPlus 5.0圖像分析軟件測定任意5個視野內(nèi)陽性毛細(xì)胞的平均光密度（mean density），取平均值代表該標(biāo)本的染色強度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 23.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行方差分析處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。數(shù)據(jù)使用方差分析均數(shù)兩兩比較法，若滿足方差齊性，使用LSD法比較組間差異；若不滿足方差齊性，則用Wlech法矯正后用Dunnett’s T3法比較組間差異，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異的檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 聽性腦干誘發(fā)電位

ABR測試分別對各組豚鼠雙耳進行聽力閾值測試。在造模期間出現(xiàn)的豚鼠由于靜脈給藥、慶大霉素毒副作用等死亡現(xiàn)象[3]及實驗中ABR未引出（CG組3耳、TMG組4耳、LL組3耳、HL組3耳、CD組2耳），均排除在納入數(shù)據(jù)外。且為保證實驗條件一致，未進行豚鼠數(shù)量的補充。模型組慶大霉素組與實驗組相比，其聽力閾值高于左西孟旦保護組和川芎嗪陽性對照組，組間均具有顯著性差異（P=0.000＜0.01，P=0.002＜0.01）。正常組與慶大霉素組相比，正常組豚鼠ABR聽閾低于慶大霉素組，組間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；而與左西孟旦組和川芎嗪陽性對照組豚鼠與正常組豚鼠相比則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（見表1）。

2.2 HE染色結(jié)果

慶大霉素組耳蝸毛細(xì)胞崩解，細(xì)胞核散在缺失，血管紋變薄，小血管萎縮（圖1-A），羥丙基-β-環(huán)糊精輔料對照組與其一致。正常組可明顯見耳蝸Corti’s器毛細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整且無損傷，并可見清晰血管紋，胞核明顯（圖1-F），而左西孟旦組和川芎嗪陽性對照組可見均毛細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不同程度的損傷，其中高劑量左西孟旦組毛細(xì)胞排列整齊，胞核明顯（圖1-B），而低劑量左西孟旦組和川芎嗪組出現(xiàn)少許缺失，血管紋部分細(xì)胞胞核散在缺失（圖1-C/D）。

2.3 Capase-3和CaV1.3蛋白表達(dá)情況

組間分析后發(fā)現(xiàn)Caspase-3和CaV1.3蛋白表達(dá)量具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01，F(xiàn)=3.449；P＜0.01，F(xiàn)=7.824）。組內(nèi)分析后發(fā)現(xiàn)，慶大霉素組耳蝸Caspase-3蛋白表達(dá)量與低劑量左西孟旦保護組相比明顯升高（圖2-b/c），具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；而慶大霉素組豚鼠CaV1.3蛋白表達(dá)量降低，與低劑量左西孟旦組豚鼠比較有顯著差異（P＜0.01），與其余組無差異（見表2）。其中可見慶大霉素組豚鼠耳蝸Corti’s器褐染，外毛細(xì)胞崩壞，細(xì)胞核缺失，呈空泡樣變；正常組和左西孟旦組則可見毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常（圖2-a/c）。

3 討論

耳毒性藥物所導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聾是臨床上預(yù)防和治療的難題，以氨基糖苷類抗生素為代表的耳毒性藥物具有廣譜抗菌、抑菌作用、價格低廉等諸多臨床優(yōu)點，且在應(yīng)對一些特殊感染、結(jié)核病[4]、艾滋病[5]的治療有新療效，但因氨基糖苷類抗生素長期用藥伴隨嚴(yán)重的腎毒性和耳毒性副作用限制了其臨床應(yīng)用。近年來多項研究表明，使用有效的藥物可以緩解氨基糖苷類抗生素所導(dǎo)致毒副作用[6～8]。左西孟旦作為一種新型的鈣增敏劑，通過與心肌細(xì)胞上肌鈣蛋白C（TnC）結(jié)合促進心肌收縮，并激活A(yù)TP敏感鉀離子通道，發(fā)揮血管舒張作用和輕度磷酸二脂酶抑制效應(yīng)。

表1 各組豚鼠聽性腦干誘發(fā)電位聽力閾值表（±s, n=74）

表1 各組豚鼠聽性腦干誘發(fā)電位聽力閾值表（±s, n=74）

注：與NC相比，**P＜0.01；與GM組相比，*P＜0.05，△P＜0.01

組別 耳數(shù)（n） 聽性腦干誘發(fā)電位閾值（dB nHL）羥丙基-β環(huán)糊精組 6 55.0±21.0*慶大霉素組 9 51.7±15.2**川芎嗪陽性對照組 16 22.8±16.6△高劑量左西孟旦 13 26.5±14.8△低劑量左西孟旦 13 29.2±10.6△正常組 17 11.2±14.2

表2 組間豚鼠耳蝸毛細(xì)胞Capase-3和CaV1.3平均光密度表達(dá)量統(tǒng)計表（±s,n=39）

表2 組間豚鼠耳蝸毛細(xì)胞Capase-3和CaV1.3平均光密度表達(dá)量統(tǒng)計表（±s,n=39）

注：與慶大霉素組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組相比，□P＜0.05；與羥丙基-β-環(huán)糊精輔料對照組相比，△P＜0.05

組別 耳數(shù)（n） Capase-3 CaV1.3平均光密度值（AOD） 95%置信區(qū)間 平均光密度值（AOD） 95%置信區(qū)間羥丙基-β環(huán)糊精組 3 0.187±0.012 0.158-0.217 0.140±0.008 0.120-0.161慶大霉素組 12 0.184±0.014 0.175-0.192 0.194±0.023△ 0.179-0.209川芎嗪陽性對照組 9 0.197±0.011* 0.189-0.205 0.207±0.026 0.187-0.227高劑量左西孟旦 5 0.188±0.019□ 0.164-0.212 0.188±0.037□ 0.142-0.234低劑量左西孟旦 4 0.156±0.011**□ 0.139-0.173 0.137±0.010* 0.121-0.154正常組 6 0.177±0.025 0.150-0.203 0.172±0.018△ 0.153-0.191 F 3.449 7.824 P 0.008 0.000

圖2 各組豚鼠Caspase-3染色結(jié)果（方底箭頭：完整細(xì)胞；圓底箭頭：受損細(xì)胞）

3.1 川芎嗪和左西孟旦對豚鼠的聽力保護作用

本研究得出，給予慶大霉素的同時給予保護藥物左西孟旦和川芎嗪可以顯著地保護豚鼠的聽力，其中川芎嗪對豚鼠聽力保護效果最佳（閾移22.2 dB），高劑量左西孟旦其次（閾移18.5 dB），低劑量左西孟旦最差（閾移15.8 dB），但由于聽性腦干誘發(fā)電位實驗中以5 dB為步階，對于三者藥物組間構(gòu)不成明顯的差異，不具有功能性的意義。李威[6]研究得出椒苯酮胺（PPTA）對慶大霉素?fù)p傷下的豚鼠聽力具有保護作用，用藥后與慶大霉素?fù)p傷組相比ABR閾值降低。作為與PPTA同為II型鈣增敏劑的左西孟旦，兩者對豚鼠聽力的保護效果一致，由于實驗各項條件不同，PPTA和左西孟旦間對聽力保護作用的差異不作討論。

3.2 川芎嗪和左西孟旦對毛細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響

Forge等[9]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是慶大霉素對耳蝸毛細(xì)胞損傷的主要途徑，Blanchet等[10]研究發(fā)現(xiàn)慶大霉素通過破壞膽堿能受體上鈣離子內(nèi)流，阻滯耳蝸外毛細(xì)胞乙酰膽堿誘發(fā)的K+電位，增加細(xì)胞外鈣離子濃度逆轉(zhuǎn)，通過煙堿樣受體抑制鈣離子內(nèi)流實現(xiàn)對K+電流的阻滯。ATP的消耗造成了ATP依賴鈣通道功能障礙，造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載[11]。細(xì)胞內(nèi)大量的Ca2+作為凋亡刺激因子引起大量細(xì)胞色素C從線粒體膜間隙釋放到胞漿中，與APaf-1結(jié)合，在dATP和ATP的介導(dǎo)下聚合為復(fù)合體[12]，這種復(fù)合體充分聚集門冬氨酸半胱氨酸蛋白酶，啟動Capase-9自動活化，激活在細(xì)胞凋亡中起主要作用下游Caspase（Caspase-3）。本研究結(jié)果可見慶大霉素?fù)p傷組造模后Capase-3表達(dá)量明顯增高，表明慶大霉素在長期用藥過程中緩慢透過血-迷路屏障，在內(nèi)耳淋巴液中緩慢聚集后對內(nèi)耳毛細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，耳蝸外毛細(xì)胞均發(fā)生崩解破解、細(xì)胞核散在缺失，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致[6,11]。

給予高、低劑量左西孟旦和川芎嗪后，顯著地發(fā)現(xiàn)低劑量左西孟旦組豚鼠毛細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量下調(diào)，與慶大霉素?fù)p傷組呈顯著性差異，而高劑量左西孟旦組較慶大霉素組略低，無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能是因為高濃度長期給藥，對豚鼠具有一定的藥物毒副作用。同時在造模過程中可以明顯觀察到高劑量左西孟旦組豚鼠在同期與低劑量左西孟旦組的對比中發(fā)現(xiàn)，毛色、清潔度、活動度均下降。而川芎嗪組豚鼠Caspase-3高于慶大霉素組，說明本實驗中川芎嗪對Caspase-3的表達(dá)無下調(diào)的作用。

3.3 川芎嗪和左西孟旦對毛細(xì)胞CaV1.3表達(dá)的影響

鈣離子通道蛋白CaV1.3作為L型電壓門控離子通道，對組織、細(xì)胞的興奮性及鈣離子信號傳導(dǎo)具有重要的作用[13]。有研究表明，新生的內(nèi)耳毛細(xì)胞敲除了CaV1.3蛋白后，聽力立即喪失，由此可見CaV1.3蛋白在內(nèi)耳聽覺功能的重要性[14]。這種聯(lián)系可能是因為氨基糖苷類抗生素引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高使鈣離子通道拮抗劑部分抵消[15]本課題組前期研究應(yīng)用川芎嗪拮抗GM耳毒性作用中發(fā)現(xiàn)，盡管慶大霉素?fù)p傷組Caspase表達(dá)量明顯升高，提示細(xì)胞大量凋亡，但CaV1.3表達(dá)量較正常對照組及陽性藥物對照組相比有所減少且低于正常值，該結(jié)果與本研究及同類相關(guān)研究結(jié)果一致[15]。這可能是因為慶大霉素?fù)p傷組經(jīng)給藥后慶大霉素在內(nèi)耳淋巴液中聚集使得細(xì)胞裂解，細(xì)胞膜上鈣離子通道蛋白降解，而川芎嗪保護組延緩了凋亡的進程，但仍無法阻止鈣離子大量涌入細(xì)胞內(nèi)。而低劑量左西孟旦保護組毛細(xì)胞CaV1.3表達(dá)量未見升高，且Caspase表達(dá)未見異常，這揭示了左西孟旦對慶大霉素?fù)p傷下有效的抗凋亡和抗鈣超載作用。但是，本實驗仍存在一定局限性，如未對豚鼠納入時進行實驗前的ABR測試，對豚鼠死亡現(xiàn)象未跟蹤原因等。后續(xù)實驗對于在不同濃度慶大霉素對耳蝸毛細(xì)胞損害作用下細(xì)胞膜CaV1.3蛋白的變化及調(diào)節(jié)機制和左西孟旦藥物保護下其變化和調(diào)節(jié)機制還有待研究。

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