韓淑嫻+陳影+張倩+韓冰+葛一蒙+項彥華+廖福龍+游云

[摘要]研究流動條件下血栓通膠囊（XST）抗血小板黏附的效應及其可能的作用機制。利用BioFlux 1000控剪應力微流培養(yǎng)系統(tǒng)模擬體內流動條件，建立TNFα誘導的血管內皮細胞損傷模型，動態(tài)實時觀察XST（03 g·L1）對血小板黏附于受損血管內皮細胞表面的影響。以Western blotting法測定血管內皮細胞VCAM1的表達，以放射免疫法檢測6ketoPGF1α，TXB2的分泌。結果顯示，生理和病理流動條件下XST均可抑制血小板黏附，抑制率分別為150%，341%；在病理低剪應力或靜態(tài)條件下，XST能夠明顯抑制血管內皮細胞VCAM1的表達和TXB2釋放（P<005）。該研究從血流/血管/血液相互作用的角度發(fā)現(xiàn)，XST可能通過內皮細胞保護途徑，抑制血小板黏附，進而發(fā)揮其抗血栓形成的效應。在不同流動條件下，XST抗血小板黏附的效應有所不同，病理低剪應力更有利于XST藥效的發(fā)揮。

[關鍵詞]剪應力； 血栓通膠囊； 血管內皮細胞； 血小板

Antiplatelet adhesive effect and mechanisms of Xueshuantong

capsules under flow conditions

HAN Shuxian1， CHEN Ying1， ZHANG Qian1， HAN Bing2， GE Yimeng2， XIANG Yanhua2， LIAO Fulong1， YOU Yun1*

（1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Science， Beijing 100700， China；

2. Harbin Zhenbao Pharmaceutical Co.， Ltd.， Harbin 150060， China）

[Abstract]To investigate the antiplatelet adhesive effect and possible mechanisms of Xueshuantong capsule （XST） under flow conditions Human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） and human platelets were employed as experimental materials， and TNFα （20 μg·L-1） was used to establish vascular endothelial cell injury models In vivo flow conditions were simulated under controlled shear stress of 01 Pa and 09 Pa by Bioflux1000 assays accordingly Antiplatelet adhesive effects of XST at 03 g·L1 were dynamically monitored by microscopic timelapse photography Western blotting was employed to detect the VCAM1 expression on endothelial cells， and the release of 6ketoPGF1α and TXB2 was tested by radioimmunoassay The results showed that XST could inhibit the platelets adhesion under both physiological and pathological flow conditions， and the inhibition rate was 150% and 341% respectively Under pathological low shear stress or static conditions， XST could significantly inhibit endothelial cells VCAM1 expression and TXB2 release （P<005） These results suggested that XST inhibited platelets adhering to injured endothelium via decreasing VCAM1 expression and TXA2 secretion from endothelium From the interactions among blood flow， vascular endothelium and platelets， the antithrombosis effects of XST were possibly related to endothelial cells protection and therefore inhibiting platelets adhesion Under different flow conditions， the antiplatelet adhesion effect of XST was different， and the pathological low shear stress was more conducive to the efficacy of XST.

[Key words]Shear stress； Xueshuantong capsule； vascular endothelial cells； platelets

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）導致的心、腦血管疾病已經成為危害人類健康的主要疾病[1]。AS的主要并發(fā)癥是血栓形成（atherothrombosis）。血小板在血栓形成中發(fā)揮關鍵作用。血液在血管內的流動，對血管內皮細胞產生了平行于血流方向的剪應力，以及垂直于血流方向的應力（包括壓力與牽張力）。異常的血流剪切應力會導致多種血栓性疾病[23]，例如：在高剪切流場誘導下血小板表面的膜糖蛋白（GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ和GPⅡb/Ⅲa）與血漿中的von Willebrand因子（vWF）相結合，介導血小板的活化、黏附和聚集，是動脈血栓的重要成因；異常的血流剪應力會導致PCI術后內膜增生，支架后再狹窄，動靜脈旁路血栓形成；而在靜脈系統(tǒng)，異常的血流剪應力可引起靜脈炎和紅色血栓形成。因此模擬血流力學環(huán)境，通過抑制血小板與血管內皮下基質的黏附，阻斷血栓形成，已成為新的抗血栓治療策略。

三七Panax notoginseng （Burk） FHChen具有化瘀止血，活血定痛之效，可用于治療各種出血病癥及跌打損傷所致的瘀血腫痛[4]。三七總皂苷（total saponins of P. notognseng，PNS）被認為是三七最主要的活性成分，其中含有多種單體皂苷，包括人參皂苷Rg1，Rb1，Re，Rd，Rb2，Rb3，Rc，以及少量的三七皂苷R1，R2，R3，R6[56]。PNS具有抑制血小板聚集、抗心肌缺血、抗腦缺血、抗炎、抗氧化、保護內皮細胞等藥理作用[711]。此外，三七皂苷R1等可明顯抑制oxLDL誘導的血小板內皮細胞黏附[12]。血栓通膠囊（XST）的主要成分是三七總皂苷，臨床用于防治腦絡瘀阻引起的中風偏癱，心脈瘀阻引起的胸痹心痛。但是目前尚無對血栓通膠囊防治血栓形成的分子藥理機制研究。本研究假設在不同流動條件下，XST可能對血小板黏附功能、內皮細胞黏附蛋白VCAM1的表達及PGI2，TXA2的分泌產生不同影響。采用Bioflux1000微流培養(yǎng)系統(tǒng)[13]，模擬生理或者病理流動條件，建立腫瘤壞死因子α（TNFα）誘導的血管內皮細胞炎癥模型，觀察XST防治血栓形成的作用機制。

1材料

11細胞

人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）（美國Sciencell公司，5138）；健康成年人血小板（北京醫(yī)院檢驗科提供）。

12藥物與試劑

血栓通膠囊（規(guī)格，三七總皂苷100 mg/180 mg膠囊，珍寶島藥業(yè)，20140310）。阿司匹林（美國Sigma公司）；ECM培養(yǎng)基（美國ScienCell公司，12376）；TNFα（美國PEPROTECH公司，0906CY25）；甘氨酸，SDS，Tris，AP，Acry，BisAcrylamide，TEMED，脫脂奶粉（美國Amresco公司）；RIPA裂解緩沖液（北京普利萊基因技術有限公司，c1053）；兔抗人VCAM1單克隆抗體（Santa公司，sc8304）；小鼠抗人βactin單克隆抗體（Santa公司，sc47778）；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（北京普利萊基因技術有限公司，c1308）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（北京普利萊基因技術有限公司，c1309）；6ketoPGF1α放射免疫分析試劑盒、TXB2放射免疫分析試劑盒（北京北方生物技術研究所有限公司）。

13儀器

Bioflux1000控剪應力微流細胞培養(yǎng)系統(tǒng)及全自動分析工作站、Bioflux 48孔微流培養(yǎng)板（美國Fluxion Biosciences公司）；Axiovret 135A倒置顯微鏡（德國ZEISS公司）；MCO15A型CO2培養(yǎng)箱（日本三洋電機國際貿易有限公司）；超凈工作臺（北京半導體設備一廠）；細胞培養(yǎng)瓶及細胞刮刀（美國Corning公司）；DT56A型臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；5424R型冷凍高速臺式離心機、微量移液器（德國Eppendorf公司）；Spectra Max M5多功能酶標儀（美國分子儀器公司）；MiniPROTEAN電泳系統(tǒng)（美國BIORAD公司）；DYY6D型電泳儀（北京六一儀器廠）；Gene Genius凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene公司）；KQ2200B超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ZD9550型脫色搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造公司）；DFM96 r放射免疫計數(shù)儀（合肥眾成機電）。

2方法

21劑量設置及分組

血栓通溶液的配制：精密稱取XST內容物粉末約6001 mg，加入生理鹽水5 mL量瓶定容，常溫超聲30 min，3 500 r·min-1離心5 min，吸取上清液，02 μm微孔濾膜過濾后，HPLC法進行含量測定[14]，三七總皂苷質量濃度為6667 g·L-1，4 ℃儲存?zhèn)溆?。實驗?7 ℃溫育20 min，以ECM培養(yǎng)基配成所需工作濃度。

阿司匹林溶液的配制：精密稱取阿司匹林粉末約2252 mg，以PBS溶液溶于25 mL量瓶中，調節(jié)pH至72～74，定容，配成濃度為50 mmol·L-1的實驗用母液，02 μm微孔濾膜過濾，4 ℃儲存?zhèn)溆?。以ECM培養(yǎng)基配成所需工作濃度。

流動狀態(tài)細胞分組：實驗設置01，09 Pa 2種剪應力水平，每種剪應力水平設置正常對照組、模型組、實驗組、陽性對照組。實驗組給藥劑量根據(jù)預實驗結果設定為03 g·L-1。阿司匹林終濃度為1 mmol·L-1。共設8個組，每組各設3個復孔。

靜態(tài)細胞分組：實驗設置正常對照組、模型組、實驗組、陽性對照組。實驗組XST終濃度分別為06，03 g·L-1，阿司匹林溶液終濃度為1 mmol·L-1。

韓淑嫻等：流動條件下血栓通膠囊抗血小板黏附的分子藥理學機制研究22細胞培養(yǎng)

血管內皮細胞接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入適量ECM培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)。3～8代用于實驗。

23藥物與流動預處理及TNFα損傷模型的建立

采用BioFlux 1000控剪應力微流培養(yǎng)系統(tǒng)在流動條件下培養(yǎng)內皮細胞[15]。鋪被Ⅰ型鼠尾膠原（006 g·L-1）于48孔微流培養(yǎng)板，20 μL內皮細胞懸液（2×1010～3×1010 個/L）加至微流通道[16]，利用液體壓力差維持培養(yǎng)基流動內皮細胞的生長，37 ℃孵箱過夜。微流觀察通道的細胞達到90%融合后，分別施加01，09 Pa剪應力，使不同水平剪應力與藥物預處理細胞12 h。加入含TNFα（20 μg·L-1）的培養(yǎng)基與內皮細胞共培養(yǎng)2 h，正常對照組加入等體積的ECM培養(yǎng)基。收集細胞上清液，-20 ℃凍存，備測。

24血小板黏附

將300 μL（約25×1011 個/L）人血小板懸液加入微流觀察通道，37 ℃，001 Pa記錄血小板的黏附過程，記錄時間為45 min；采圖，每組至少3張，計數(shù)黏附的血小板。吸棄剩余血小板懸液，PBS溶液沖洗通道后，用含1 mmol·L-1 PMSF的RIPA細胞裂解液裂解通道內細胞，收集流出液，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，-20 ℃凍存，用于Western blotting蛋白電泳分析。

25靜態(tài)細胞處理

取對數(shù)生長期的血管內皮細胞，025%胰蛋白酶常規(guī)消化制成單細胞懸液，接種于6 cm培養(yǎng)皿中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)皿中細胞達到90%融合后，按照21所述靜態(tài)細胞分組加藥，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。吸棄含藥培養(yǎng)基，將含20 μg·L-1TNFα的培養(yǎng)基加入模型組、實驗組、陽性對照組，37 ℃孵育2 h。吸棄培養(yǎng)基，預冷的PBS溶液洗滌2遍，加入含1 mmol·L-1 PMSF的RIPA細胞裂解液，冰上裂解細胞15 min，收集細胞裂解液，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，-20 ℃凍存，用于Western blotting蛋白電泳分析。

26Western blotting法檢測黏附蛋白VCAM1表達

采用BCA法測定蛋白濃度，經SDSPAGE電泳后，濕轉法轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h；分別加入VCAM1抗體，4 ℃孵育過夜，TBST （100 mmol·L-1Tris，100 mmol·L1 NaCl，01%Tween）漂洗3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，每次5 min。滴加ECL發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)進行掃描成像。Image J軟件進行灰度分析。

27放射免疫法檢測細胞上清液中6ketoPGF1α，TXB2含量

血管內皮細胞接種于96孔板中，每孔1×104個，實驗設置正常對照組、模型組、實驗組、阿司匹林組，每組各設6個復孔。細胞與藥物于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，將含20 μg·L-1TNFα的培養(yǎng)基加入模型組、實驗組、陽性對照組，37 ℃孵育2 h。收集細胞上清液，-20 ℃凍存，備測。以放射免疫法檢測TXB2（TXA2的代謝產物）和6ketoPGF1α（PGI2的代謝產物）含量。

28統(tǒng)計處理

統(tǒng)計變量以±s表示，利用SPSS 200 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P<005為有統(tǒng)計學意義。

3結果

31不同流動條件下XST對血小板黏附的影響

在01，09 Pa流動條件下，各個處理組黏附于TNFα損傷的內皮細胞表面的血小板數(shù)量見表1。在不同流動條件下，XST均可明顯抑制TNFα誘導的血小板內皮細胞黏附，抑制率分別為341%，150%。

32XST對血管內皮細胞黏附蛋白VCAM1表達的影響

321靜態(tài)條件下XST對VCAM1表達的影響

靜態(tài)條件下XST可抑制TNFα誘導的VCAM1的表達。與對照組相比，模型組VCAM1蛋白表達量明顯升高；與模型組相比，XST（03，06 g·L-1）及阿司匹林（1 mmol·L-1）可明顯抑制VCAM1的表達，抑制率分別為165%，219%，226%（圖1）。

322流動條件下XST對VCAM1蛋白表達的影響01 Pa流動條件下，XST可明顯抑制VCAM1的表達。與對照組相比，模型組VCAM1蛋白表達量明顯升高；與模型組相比，XST可明顯抑制VCAM1的表達，抑制率為246%，蛋白表達量低于阿司匹林（圖2）；09 Pa流動條件下，XST對VCAM1表達的影響不明顯，但阿司匹林可明顯抑制VCAM1的表達，抑制率為167%（圖3）。

33流動條件下，XST對血管內皮細胞分泌6ketoPGF1α，TXB2的影響

流動條件下，XST可明顯抑制TNFα誘導的血管內皮細胞分泌TXB2。與對照組相比，模型組血管內皮細胞分泌的TXB2含量明顯升高，與模型組相比，XST、阿司匹林均可明顯抑制TXB2的分泌，抑制率分別為499%，654%（圖4），XST、阿司匹林對血管內皮細胞分泌6ketoPGF1α無明顯影響，統(tǒng)計學分析沒有顯著性差異。

4討論

本實驗室在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)XST具有抑制血小板聚集的效應，雖然效力低于阿司匹林，但是XST抑制血小板聚集效應穩(wěn)定并具有一定的量效關系[14]。本研究是在前期研究工作基礎上，探索XST抑制血小板聚集的可能機制及分子機制。

血栓形成過程是血管內皮細胞、血小板、凝血因子及力學環(huán)境交互作用的復雜過程。首先血管內皮功能紊亂或者結構受損，使正常血管內壁的抗凝特性減弱或喪失；血小板在內皮損傷部位首先發(fā)生黏附、變形和聚集，并招募凝血蛋白及多種血細胞促進血栓形成。在這個過程中，血流力學環(huán)境是影響血栓形成的一個重要因素，特別是剪應力能夠直接影響血管內皮細胞的結構和功能。正常動脈中流體剪應力大約為1～7 Pa，動脈粥樣硬化易發(fā)的區(qū)域，流體剪應力顯著降低（<04 Pa），血流狀態(tài)往往為紊流[17]。低剪切應力（<04 Pa）可誘導內皮細胞增殖、炎癥基因的表達增加，NO 生成減少，白細胞黏附及滲透增加[18]。靜脈血管壓力升高會增強MMP1，8，9及TIMP1，2等酶的活性，這將影響臨界表面受體的活性，而導致炎癥的發(fā)生及內皮功能紊亂[15]。本實驗中01 Pa屬于偏低的病理血流剪應力，09 Pa則屬于正常水平的生理血流剪應力。在不同流動條件下，XST抑制血小板黏附的效應有所差異，提示剪應力影響XST抗血小板黏附的效應。在低剪應力流動條件下，XST抑制血小板黏附的效應與阿司匹林相近，抑制率分別為341%，363%。

在炎癥反應部位，內皮細胞受到致炎因子的刺激后，其表面黏附蛋白表達量增高[19]。VCAM1 是一種重要的黏附分子，是免疫球蛋白超家族成員，在血管損傷炎癥過程中起重要作用[20]。低剪應力（02 Pa）作用于內皮細胞可導致黏附分子VCAM1表達上調，在血小板黏附過程中起重要作用[21]。本研究結果表明在不同血流狀態(tài)下，藥物抑制黏附蛋白表達的效應有所差異，在病理流動條件下，XST抑制血管內皮細胞黏附蛋白VCAM1表達的作用更明顯，與阿司匹林相比，XST抑制VCAM1表達的效應更強（P<001）。以上結果提示，在病理低剪應力條件下XST抑制VCAM1表達的效應可能優(yōu)于阿司匹林。

血小板活化釋放的TXA2通過刺激血管內皮細胞TXA2受體，升高胞內Ca2+濃度，加速血小板激活與聚集、血細胞黏附、血管收縮等生物學效應。研究發(fā)現(xiàn)，oxLDL誘導血管內皮細胞分泌TXB2增加，三七皂苷R1可明顯抑制其分泌[12]。復方血栓通膠囊（由三七、黃芪、丹參、玄參組成）075 g·kg-1能明顯升高大鼠血清PGI2含量，降低TXA2含量及TXA2/PGI2比值，從而發(fā)揮抗血栓形成的作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，TNFα刺激后，血管內皮細胞分泌TXB2增加；XST、阿司匹林均明顯抑制血管內皮細胞分泌TXB2，阿司匹林的抑制效應強于XST（P<001）。此外，本實驗研究結果顯示與靜態(tài)條件相比，流動條件下XST具有明顯升高6ketoPGF1α/ TXB2比值的效應（047±008 vs 070±001）。

綜上所述，本研究從血流/血管/血液相互作用的角度研究發(fā)現(xiàn)，XST可能通過抑制血管內皮細胞VCAM1的表達及TXA2的分泌，抑制血小板黏附于損傷的內皮細胞表面，從而發(fā)揮防治血栓形成。研究發(fā)現(xiàn)在病理低剪應力條件下XST可能更好地發(fā)揮其抗血小板黏附以及內皮保護效應。生物力學環(huán)境直接影響藥物效應的發(fā)揮，通過建立相應的動態(tài)力學藥物篩選模型，有助于發(fā)現(xiàn)抗血小板聚集的中藥及其組合物。

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[責任編輯張寧寧]

[收稿日期]20160809

[基金項目]國家自然科學基金項目（81274006）

[通信作者] *游云，研究員，碩士生導師，研究方向為中藥心腦血管藥理研究與質量控制，Email： youyunrice@126com

[作者簡介]韓淑嫻，碩士研究生，Email： xiaoxianghsx@163com