李浩楠 王東霞 王濼瓔 范東艷 王蘋 于姝媛

順鉑（cisplatin）作為一種高效的化療藥物廣泛用于多種腫瘤疾病的治療，如生殖細(xì)胞瘤、卵巢癌、睪丸癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、鼻咽癌[1]。然而它的副作用如耳毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性極大地限制了臨床應(yīng)用，順鉑的耳毒性表現(xiàn)在導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞的缺失、血管紋的退化以及螺旋神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量的減少。據(jù)統(tǒng)計(jì)有93%接受順鉑化療的患者會(huì)引發(fā)感音神經(jīng)性聾[2]，目前對(duì)于順鉑的耳毒性尚無(wú)有效的治療方法。

對(duì)于順鉑的耳毒性機(jī)制，在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證明毛細(xì)胞的死亡是由于順鉑通過(guò)引發(fā)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑所導(dǎo)致的，細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑涉及線粒體的損傷，損傷的線粒體釋放出的細(xì)胞色素C可激活Caspase 9和Caspase 3。其中Caspase 3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡效具體執(zhí)行者之一，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，它能夠水解特定的蛋白底物進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。順鉑治療后耳蝸內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）被認(rèn)為是導(dǎo)致耳蝸細(xì)胞凋亡的主要誘因。順鉑治療后，機(jī)體內(nèi)的氧化與抗氧化平衡狀態(tài)被打破，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高，而過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶活性降低，而且耳蝸又是一個(gè)相對(duì)封閉的系統(tǒng)，不能及時(shí)清理其內(nèi)形成的ROS，使得ROS大量積聚，損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)[3]。

NF-kB是一個(gè)氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，涉及ROS信號(hào)應(yīng)答，參與多種細(xì)胞中的應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[4]。已有研究證明HIF1與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡的調(diào)控有關(guān)，但是對(duì)它在凋亡中發(fā)揮的作用還有一定的爭(zhēng)議[5]。氯化鈷(CoCl2)作為一種可以模擬缺氧的化學(xué)物質(zhì)可使HIF-1α蛋白穩(wěn)定性增加，以促進(jìn)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，從而為常氧條件下研究HIF-1α在順鉑聽(tīng)功能損傷中的內(nèi)源性保護(hù)作用機(jī)制提供條件。本研究擬觀察氯化鈷對(duì)順鉑耳毒性的保護(hù)作用，并初步探討其機(jī)制，試圖找到一種治療順鉑耳毒性的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：36只購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心出生4天Wistar大鼠（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（吉）2007-0003）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)已獲得吉林大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

試劑：培養(yǎng)皿，DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，氯化鈷、NF-200和TRITC-標(biāo)記phalloidin購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，Caspase3、NF-κB和HIF-1α抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，Alexa Fluor 555羊抗鼠IgG抗體為Molecular Probe產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耳蝸基底膜培養(yǎng) 在直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中加入完全培養(yǎng)基（1：1DMEM/F12+5%FBS+1%青霉素）500 μl，室溫放置30 min；在無(wú)菌條件下將大鼠斷頭取出聽(tīng)泡，于顯微鏡下去除螺旋韌帶分離耳蝸基底膜。將基底膜平鋪在預(yù)先加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿底部；3小時(shí)后向培養(yǎng)皿中補(bǔ)充1500 μl完全培養(yǎng)基；37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將36只Wistar大鼠隨機(jī)均分為4組：對(duì)照組、CoCl2處理組、順鉑處理組、CoCl2預(yù)處理加順鉑組。對(duì)照組加入1500 μl完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；CoCl2處理組加入1500 μlCoCl2濃度為100μM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后更換為1500 μl完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h；順鉑處理組加入1500 μl順鉑濃度為200 μM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；CoCl2預(yù)處理加順鉑組加入1500 μlCoCl2濃度為100 μM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后更換為1500 μl順鉑濃度為200 μM的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h。各組耳蝸基底膜均培養(yǎng)24 h后棄去原有培養(yǎng)基并用4%多聚甲醛溶液常溫固定1 h。

1.2.3 毛細(xì)胞染色觀察計(jì)數(shù) 棄去固定液，用（phosphate buffer solution，PBS)清洗3遍后加入2%的Triton X-100處理20 min；加入（tetram ethylrhodam ineisothio-cyanate，TRITC）標(biāo)記的phalloidin溶液（1：200稀釋），常溫染色20 min；甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，照相。分別統(tǒng)計(jì)在耳蝸基底膜的中回100 μm長(zhǎng)度范圍的內(nèi)外毛細(xì)胞存活數(shù)目，每個(gè)特定區(qū)域計(jì)數(shù)3個(gè)長(zhǎng)度范圍，取平均值。

1.2.4 螺旋神經(jīng)元免疫熒光染色 棄去固定液，用PBS清洗3遍后加入2% Triton X-100處理20 min；PBS清洗后加入5%羊血清封閉1 h；滴加一抗(mouse anti-NF200，1：400稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，用PBS清洗3遍；加入二抗(Alexa Fluor 555羊抗鼠IgG，1：400稀釋)，室溫避光孵育1h，PBS洗3遍；甘油封片，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。分別在耳蝸基底膜的中回計(jì)數(shù)100*80 μm區(qū)域計(jì)數(shù)螺旋神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)目，每條基底膜計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)域，取平均值。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡 為了探討順鉑導(dǎo)致毛細(xì)胞死亡的分子機(jī)制，以及預(yù)先CoCl2處理保護(hù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本研究采用蛋白質(zhì)印記（weatern blot）的方法分析HIF1α/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和細(xì)胞凋亡因子Caspase 3的表達(dá)變化。終止培養(yǎng)時(shí)收集耳蝸基底膜，加入細(xì)胞裂解液，超聲破碎細(xì)胞，于低溫離心機(jī)內(nèi)（4℃，12000 rpm）離心15 min，取上清，采用二辛可寧酸法（bicinchoninicacid，BCA）進(jìn)行蛋白定量，每孔上樣30 μg/20 μl總蛋白，樣品與5×上樣緩沖液混勻后95℃ 5 min變性。上樣于10 %的SDS-PAGE，120 V電泳2.5 h，電轉(zhuǎn)移1.5 h，將凝膠上的蛋白帶至聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，取出轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(HIF1a，1：500稀釋，NF-kB，1：1000稀釋，Caspase 3，1：1000稀釋，actin，1：5000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，孵育后用TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min，加入二抗，稀釋濃度為1：2000，孵育1 h后，TBST（trisbuffered saline with tween）洗膜3次，然后加入ECL(electrochemical luminescence)化學(xué)發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)蛋白表達(dá)。以actin作為內(nèi)參照，使用Image J軟件對(duì)圖像中條帶的灰度值進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（%）表示，組間比較采用X2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠耳蝸毛細(xì)胞染色觀察

TRITC標(biāo)記的phalloidin染色毛細(xì)胞，共聚焦顯微鏡下對(duì)照組耳蝸毛細(xì)胞呈紅色熒光，3排外毛細(xì)胞和1排內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊，纖毛結(jié)構(gòu)清晰。CoCl2處理組未見(jiàn)毛細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變和數(shù)目缺失。順鉑處理組毛細(xì)胞纖毛出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂缺失，從底回至頂回遞次嚴(yán)重，頂回未見(jiàn)明顯缺失。CoCl2預(yù)處理加順鉑組毛細(xì)胞缺失現(xiàn)象明顯減輕。計(jì)數(shù)中回存活的毛細(xì)胞，見(jiàn)圖1。正常組為42.66±0.57（outerhaircell，OHC），11.66±0.58（inner hair cell.IHC），順鉑組為12.33±1.58（OHC），1.67±0.57（IHC）。內(nèi)毛細(xì)胞損傷尤為嚴(yán)重，明顯高于正常組和CoCl2作用組，P=4.702*10-6,P=3.413*10-6＜0.01。CoCl2預(yù)處理加順鉑組中回毛細(xì)胞存活數(shù)目為34.00±2.00（OHC），4.00±1.00（IHC），明顯高于順鉑處理組（OHC，P=0.000，IHC，P=0.025），氯化鈷預(yù)處理加順鉑保護(hù)組毛細(xì)胞存活數(shù)目是順鉑處理組的2.81倍。

圖1 毛細(xì)胞染色結(jié)果（中回，*800）

2.2 大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元免疫熒光染色結(jié)果

采用NF-200抗體標(biāo)記離體培養(yǎng)的耳蝸放射狀神經(jīng)纖維和神經(jīng)元。如圖2所示，對(duì)照組耳蝸神經(jīng)元核漿清晰，神經(jīng)纖維光滑成束，可見(jiàn)內(nèi)毛細(xì)胞與神經(jīng)纖維末梢接觸緊密。順鉑組神經(jīng)纖維明顯變細(xì)，出現(xiàn)凋亡小結(jié)，神經(jīng)元變小，且細(xì)胞核不清晰，神經(jīng)纖維末梢水腫膨大，與內(nèi)毛細(xì)胞縫隙增大。CoCl2處理組未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變。CoCl2預(yù)處理加順鉑組耳蝸神經(jīng)元形態(tài)學(xué)明顯好于順鉑處理組。計(jì)數(shù)單位面積中SGNs的存活數(shù)量，結(jié)果顯示為對(duì)照組、CoCl2預(yù)處理加順鉑組、順鉑處理組的耳蝸神經(jīng)元單位面積里的神經(jīng)元數(shù)目分別為77.3±6.08、48.67±3.67、34.67±3.57。表明低劑量氯化鈷預(yù)處理組存活神經(jīng)元數(shù)目為單純順鉑組的1.40倍，P=0.009，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如圖3所示，CoCl2處理組HIF1α蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組3.6倍(P=0.000)，順鉑處理組與對(duì)照組未見(jiàn)明顯差異。NF-κB在CoCl2作用后增加1.5倍（P=0.072），在CoCl2預(yù)處理加順鉑組增加2.05倍，順鉑處理組增加1.6倍。Caspase 3表達(dá)在CoCl2預(yù)處理加順鉑組比對(duì)照組高2.5倍，順鉑處理組最高且是對(duì)照組的3.91倍（P=0.001）。CoCl2預(yù)處理加順鉑組的Caspase 3表達(dá)明顯低于順鉑處理組（P=0.009）。

圖3 各組HIF-1α、NF-kB、Caspase 3蛋白表達(dá)

3 討論

順鉑由于其抗腫瘤的高效性廣泛應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療，然而由于順鉑的毒副作用，使其臨床應(yīng)用受限。順鉑對(duì)于聽(tīng)功能損傷的具體機(jī)制目前尚未完全闡明，有研究[6]表明順鉑治療后耳蝸內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（ROS）被認(rèn)為是導(dǎo)致耳蝸細(xì)胞凋亡的主要誘因。

本研究使用順鉑作用于離體培養(yǎng)的耳蝸基底膜，可見(jiàn)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元的重度損傷和數(shù)目的減少。使用氯化鈷預(yù)處理后加順鉑組，觀察到毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元雖較于正常組有所損傷，但是毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)元細(xì)胞狀態(tài)明顯優(yōu)于單純順鉑處理組，且存活細(xì)胞數(shù)目多于順鉑組?？梢?jiàn)，氯化鈷預(yù)處理對(duì)順鉑的耳毒性有一定的保護(hù)作用。

NF-kB是一個(gè)涉及ROS的轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。根據(jù)細(xì)胞的類型和刺激的性質(zhì)不同，NF-kB在細(xì)胞中表現(xiàn)為凋亡因子或抑凋亡因子。NF-kB在神經(jīng)元中被證明為一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，在順鉑處理的毛細(xì)胞細(xì)胞系的研究中[7]，應(yīng)用NF-kB的抑制劑能夠減弱Caspase 3的活性，證明了NF-kB在順鉑處理后的毛細(xì)胞中表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡的轉(zhuǎn)錄因子。在本研究中，順鉑處理組毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)元細(xì)胞損傷嚴(yán)重，存活數(shù)目較少，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明NF-kB與Caspase 3的表達(dá)量較對(duì)照組可見(jiàn)明顯升高。證明在體外實(shí)驗(yàn)中，順鉑處理后毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)元細(xì)胞損傷與NF-kB轉(zhuǎn)錄水平升高導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是由兩個(gè)亞基組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α既是HIF-1的活性亞基又是其調(diào)節(jié)亞基。HIF-1α極不穩(wěn)定，在常氧條件下極易被降解，而在氧氣濃度較低時(shí)，HIF-1α的穩(wěn)定性增加進(jìn)而使HIF-1轉(zhuǎn)錄活性增加[7]。在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在缺氧環(huán)境下，HIF-1α能夠激活一些抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，并促進(jìn)抗凋亡蛋白IAP-2的表達(dá)并降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)[5]。CoCl2是一種常用的HIF-1α的活性誘導(dǎo)劑，其能夠在常氧條件下，通過(guò)與Fe2+競(jìng)爭(zhēng)氧，達(dá)到常氧條件下誘導(dǎo)缺氧的目的[9]。對(duì)于不同類型的細(xì)胞，誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)升高所需氯化鈷的濃度和處理時(shí)間有所不同。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索[10]，發(fā)現(xiàn)氯化鈷濃度在100 μM且處理時(shí)間為6 h時(shí)既能保證有較高的HIF1α表達(dá)，又不會(huì)對(duì)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元有所損傷。在本研究中，CoCl2處理組毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)元細(xì)胞狀態(tài)完好，與對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯差異，且HIF-1α表達(dá)水平明顯提高，但NF-kB與Caspase 3表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異，這表明氯化鈷濃度在100μM且處理時(shí)間為6 h時(shí)對(duì)毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)元無(wú)有害作用。CoCl2預(yù)處理加順鉑組毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)元細(xì)胞狀態(tài)均明顯優(yōu)于順鉑處理組，且存活細(xì)胞數(shù)目明顯多于單純順鉑組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明氯化鈷預(yù)處理對(duì)于順鉑對(duì)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元的損傷具有保護(hù)作用。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，CoCl2預(yù)處理加順鉑組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)水平明顯高于順鉑組，CoCl2預(yù)處理加順鉑組與順鉑處理組NF-kB表達(dá)水平均明顯高于正常組，這與加入順鉑處理引發(fā)的細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有關(guān)，但是CoCl2預(yù)處理加順鉑組Caspase 3表達(dá)量明顯低于順鉑處理組，推測(cè)與其細(xì)胞內(nèi)有高水平的HIF-1α的表達(dá)，部分地抑制了NF-kB導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，CoCl2預(yù)處理加順鉑組Caspase 3表達(dá)量明顯低于順鉑處理組，對(duì)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元有較好的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明了氯化鈷預(yù)處理導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性增加，其表達(dá)水平的提升能夠與促進(jìn)毛細(xì)胞和神經(jīng)元凋亡的炎癥因子NF-kB相互拮抗，部分抑制細(xì)胞的凋亡。本研究同時(shí)證明了氯化鈷預(yù)處理對(duì)減輕順鉑對(duì)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷有明顯作用。

[1]Waissbluth S，Daniel SJ.Cisplatin-induced ototoxicity：transporters playing a role in cisplatin toxicity[J].Hear Res，2013，299：37-45.

[2]Schellens JH，Planting AS，Ma J，et al.Adaptive intrapatient dose escalation of cisplatin in patients with advanced head and neck cancer[J].Anticancer Drugs，2001，12(8)：667-675.

[3]Vogiatzi G，Tousoulis D，Stefanadis C.The role of oxidative stress in atherosclerosis[J].Hellenic J Cardiol，2009，50(5)：402-409.

[4]Taylor CT.Interdependent roles for hypoxia inducible factor and nuclear factor-kappaB in hypoxic inflammation[J]. J Phy siol，2008，586(17)：4055-4059.

[5]Greijer AE，van der Wall E. The role of hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) in hypoxia induced apoptosis[J]. J Clin Pathol，2004，57(10)：1009-1014.

[6]Liu J，Du L.PERK pathway is involved in oxygen-glucoseserum deprivation-induced NF-kB activation via ROS generation in spinal cord astrocytes[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，467(2)：197-203.

[7]Chung WH，Boo SH，Chung MK，et al.Proapoptotic effects of NF-kappaB on cisplatin-induced cell death in auditory cell line[J].Acta Otolaryngol，2008，128(10)：1063-1070.

[8]Wang GL，Jiang BH，Rue EA，et al.Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(12)：5510-5514.

[9]Zhang YB，Wang X，Meister EA，et al.The effects of CoCl2 on HIF-1alpha protein under experimental conditions of autoprogressive hypoxia using mouse models[J].Int J Mol Sci，2014，15(6)：10999-11012.

[10]Wang P，Du B，Yin W，et al.Resveratrol attenuates CoCl2-induced cochlear hair cell damage through upregulation of Sirtuin1 and NF-kappaB deacetylation[J].PLoS One，2013，8(11)：e80854.