萬棟峰，潘珊珊，原陽

心肌線粒體自噬相關(guān)蛋白BNIP3在運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)晚期保護(hù)效應(yīng)中的變化

萬棟峰，潘珊珊，原陽

目的：檢測(cè)和觀察心肌線粒體自噬相關(guān)蛋白BNIP3在運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)（EP）晚期保護(hù)效應(yīng)中的表達(dá)變化，探討EP晚期保護(hù)效應(yīng)和心肌線粒體自噬的關(guān)系。方法：SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、力竭運(yùn)動(dòng)組（EE組）、晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組（LEP組）、晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+力竭運(yùn)動(dòng)組（LEP＋EE組）和wortmannin+晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+力竭運(yùn)動(dòng)組（W+LEP+EE組）。在EP動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，用力竭運(yùn)動(dòng)致大鼠急性心肌損傷，用血漿cTnI含量和HBFP染色綜合評(píng)價(jià)心肌損傷和保護(hù)的程度，用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)大鼠心肌線粒體BNIP3和TOM20的共定位程度，用免疫印跡法檢測(cè)大鼠心肌組織線粒體BNIP3和LC3的表達(dá)變化。結(jié)果：與C組相比，EE組血漿cTnI和MOD值顯著升高，BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體程度、BNIP3水平和LC3II/I水平顯著升高；LEP組BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體程度和BNIP3水平顯著升高，血漿cTnI、MOD值和LC3II/I水平無顯著性差異。與EE組相比，LEP+EE組血漿cTnI和MOD值顯著降低，BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體程度、BNIP3水平和LC3II/I水平顯著降低。與LEP+EE組相比，W+LEP+EE組血漿cTnI和MOD值顯著升高，BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體程度和BNIP3水平顯著升高，LC3II/I水平無顯著性差異。結(jié)論：EP可促使線粒體自噬相關(guān)蛋白BNIP3表達(dá)升高，在EP晚期心肌保護(hù)效應(yīng)中，BNIP3誘導(dǎo)的線粒體自噬參與了EP對(duì)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的保護(hù)作用。

BNIP3；LC3；心肌線粒體自噬；運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)；晚期保護(hù)效應(yīng)

細(xì)胞自噬（Autophagy）是細(xì)胞通過捕獲自身變形、衰老和損傷的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器，然后在溶酶體內(nèi)降解消化并重新利用的過程［4，14］，它是真核細(xì)胞所特有的一種高度保守的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過程。在饑餓、運(yùn)動(dòng)等應(yīng)激條件下，細(xì)胞自噬被激活或增強(qiáng)，成為維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生存的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制［14］。根據(jù)自噬對(duì)降解底物的選擇性，將自噬分為選擇性和非選擇性自噬，而線粒體自噬（mitophagy）屬于選擇性自噬，指在氧化應(yīng)激、能量代謝、細(xì)胞衰老等刺激下，細(xì)胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化損傷，損傷的線粒體被特異性包裹進(jìn)自噬體中，并與溶酶體融合，從而完成損傷線粒體的降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［6，20］。有研究表明，線粒體自噬的程度與自噬相關(guān)蛋白的變化密切相關(guān)［8，26，28］。Bcl-2 19-kDa相互作用蛋白3（Bcl-2 19-kDa interacting protein 3，BNIP3）作為Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白，它不僅參與細(xì)胞凋亡，還調(diào)控細(xì)胞自噬，在促進(jìn)細(xì)胞存活的自噬過程中具有重要作用，并能與受損線粒體結(jié)合參與線粒體自噬［26］。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3）是自噬體形成關(guān)鍵蛋白，可以反映自噬體的形成，它存在兩種可以相互轉(zhuǎn)化的形式LC3I和LC3II，LC3II是自噬體的標(biāo)志分子，隨自噬體膜的增多而增多，因此，LC3II/I比值在一定程度上可以反映自噬水平［8］。在自噬體成熟階段，BNIP3會(huì)募集LC3至線粒體上，促進(jìn)自噬體的形成［28］，并積極清除受損線粒體，誘導(dǎo)線粒體自噬。

反復(fù)短暫的心肌缺血使心肌在后續(xù)的長時(shí)間缺血中得到保護(hù)的現(xiàn)象稱缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning，IP）。反復(fù)短時(shí)間大強(qiáng)度間歇有氧運(yùn)動(dòng)能提高心肌耐受缺血缺氧的能力，使心肌在后續(xù)的持續(xù)性缺血損傷中得到保護(hù)，這種通過運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性心肌保護(hù)效應(yīng)的方式稱運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)（exercise preconditioning，EP）［8，12，24］，與IP的過程類似。EP可以降低心律失常和心肌頓抑的發(fā)生［25］，減少心肌梗塞面積，提高心肌在缺血再灌注（ischemic reperfusion，IR）中的耐受力［11］，減輕缺血心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，降低力竭運(yùn)動(dòng)所致的心肌損傷［17］。EP和IP一樣具有早期和晚期兩個(gè)保護(hù)期，早期保護(hù)期在運(yùn)動(dòng)刺激后即刻出現(xiàn)，持續(xù)1-3 h；晚期保護(hù)期在運(yùn)動(dòng)刺激后12 h發(fā)生，24-48 h達(dá)到頂峰，持續(xù)24-72 h，與早期保護(hù)期相比穩(wěn)定性更明顯。因此，探討EP的晚期保護(hù)效應(yīng)對(duì)于長期的心肌保護(hù)更有意義。EP的保護(hù)效應(yīng)機(jī)制涉及運(yùn)動(dòng)模型和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的制定，氧化緩沖能力的提高，心肌細(xì)胞膜ATP敏感鉀通道亞基的上調(diào)，心肌線粒體的適應(yīng)性改變等［12］，但其機(jī)制至今還不十分明了，尚待探尋新的研究切入點(diǎn)。目前，細(xì)胞自噬與IP及運(yùn)動(dòng)保護(hù)關(guān)系的探討正成為新的研究熱點(diǎn)。有研究表明，IP和運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌都具有適應(yīng)性保護(hù)作用［21，24］，IP心肌保護(hù)效應(yīng)存在線粒體自噬的增強(qiáng)［18，23］。運(yùn)動(dòng)后，為調(diào)控體內(nèi)的線粒體質(zhì)量水平，機(jī)體會(huì)通過自噬途徑降解受損的線粒體，同樣也存在線粒體自噬的增強(qiáng)［27］。因此，我們假設(shè)EP晚期保護(hù)效應(yīng)與心肌線粒體自噬存在關(guān)聯(lián)，本實(shí)驗(yàn)在我們課題組前期研究的基礎(chǔ)上，以線粒體自噬相關(guān)蛋白BNIP3和LC3為切入點(diǎn)，檢測(cè)和觀察BNIP3和LC3在EP晚期保護(hù)效應(yīng)中的變化，探討EP晚期保護(hù)效應(yīng)和心肌線粒體自噬的關(guān)系，為EP心肌保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制的研究提供更新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

健康雄性Sprague-Dawley大鼠100只，體重252±11 g（上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)（5只/籠），輻照鼠用滅菌飼料（蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司）飼養(yǎng)。室溫22℃～24℃，空氣濕度40%～70%，光照時(shí)間為12h/d。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，期間進(jìn)行5天速度為15 m/min、時(shí)間10 min，坡度為0°的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練。適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后休息1天，然后對(duì)大鼠體重分層，隨機(jī)分為5組，每組20只：對(duì)照組（control group，C組）；力竭運(yùn)動(dòng)組（excessive exercise group，EE組）：大鼠在跑臺(tái)上進(jìn)行速度為30m/min的運(yùn)動(dòng)直至力竭，以建立大鼠急性運(yùn)動(dòng)性心肌損傷模型；晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組（late exercise preconditioning group，LEP組）：大鼠在跑臺(tái)上進(jìn)行速度為30 m/min（相當(dāng)于75%VO2max）的間歇運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)10 min，休息10 min，重復(fù)4次，坡度為0°，運(yùn)動(dòng)結(jié)束24 h后進(jìn)行取材；晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+力竭運(yùn)動(dòng)組（late exercise preconditioning+excessive exercise group，LEP＋EE組）：大鼠先進(jìn)行一次EP模型運(yùn)動(dòng)，24 h后進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)；渥曼青霉素（wortmannin）+晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+力竭運(yùn)動(dòng)組（wortmannin +late exercise preconditioning+excessive exercise group，W+LEP+EE組）：在EP運(yùn)動(dòng)前0.5 h腹腔注射wortmannin（美國Cell Signaling公司，0.7 mg/kg體重），EP運(yùn)動(dòng)結(jié)束后24 h進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)。wortmannin是細(xì)胞自噬抑制劑，該組旨在探討細(xì)胞自噬與EP晚期保護(hù)效應(yīng)的關(guān)系。

1.2 動(dòng)物取材

用10%水合氯醛（40 mg/100 g體重）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉。打開腹腔，下腔靜脈取血5 ml，靜置15～30 min，離心取血漿，-80℃保存，用于血漿心肌肌鈣蛋白（Icardiac troponin I，cTnI）含量檢測(cè)。取血后，每組大鼠隨機(jī)抽取10只，打開胸腔，暴露心臟，沿心尖插入灌注針頭，1%肝素抗凝，滴注0.85%生理鹽水250～300 ml，剪斷下腔靜脈，待流出液基本無血色后，繼續(xù)滴注4%多聚甲醛250～300 ml。取出心臟，生理鹽水漂洗，放置4%多聚甲醛中后固定24 h，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，用于心肌HBFP染色和免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)。另外每組10只大鼠迅速打開胸腔，摘取心臟，生理鹽水漂洗，-80℃保存，用于心肌組織免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.3 血漿cTnI含量檢測(cè)

采用化學(xué)發(fā)光法（ChemiLuminescence，CL）測(cè)定血漿cTnI含量。CL是一種雙位點(diǎn)酶免法檢測(cè)。將與堿性磷酸酶結(jié)合的單克隆抗cTnI抗體，連同含表面活性劑的緩沖液和樣本，加入到反應(yīng)管中。短時(shí)間孵育后，加入包被有抗cTnI單克隆抗體的順磁性微粒。cTnI與抗cTnI抗體在固相上結(jié)合，抗cTnI抗體-堿性磷酸酶結(jié)合物與cTnI分子上的不同抗原位點(diǎn)反應(yīng)。添加化學(xué)發(fā)光底物（Lumi-Phos* 530）到反應(yīng)管中，用光度計(jì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生的光進(jìn)行測(cè)量。發(fā)光量與樣本中cTnI的濃度成正比，儀器為Beckman Coulter公司的Access 2免疫分析系統(tǒng)，樣本內(nèi)分析物的量根據(jù)所儲(chǔ)存的多點(diǎn)校準(zhǔn)曲線確定，測(cè)量范圍為0.02～100 ng/ml。

1.4 心肌組織HBFP染色

蘇木素-堿性復(fù)紅-苦味酸染色（hematoxylin basic fuchsin picric acid staining，HBFP染色）可以顯示心肌組織的缺血缺氧變化。正常心肌組織被染成黃色，缺血缺氧心肌組織則被染成艷紅色。先將石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水，用蘇木精浸染細(xì)胞核，0.1%堿性復(fù)紅中浸染3 min，流水沖洗。之后用丙酮浸洗10 s，再用0.1%苦味酸丙酮浸染15～20 s，丙酮浸洗20 s。染色結(jié)果用Olympus DP80顯微鏡進(jìn)行觀察并采集圖像。每組隨機(jī)選取5張組織切片，每張切片隨機(jī)采集5個(gè)視野，在同一放大倍數(shù)下（×400），用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對(duì)每個(gè)視野進(jìn)行圖像分析，測(cè)量參數(shù)選取目標(biāo)物質(zhì)的缺血缺氧面積和積分光密度（integral optical density，IOD），并用平均光密度（mean optical density，MOD）表示缺血缺氧單位面積的損傷程度（MOD=IOD/陽性面積）。

1.5 心肌組織BNIP3和TOM20免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)

多數(shù)蛋白進(jìn)入線粒體內(nèi)部發(fā)揮作用均需通過線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶（translocase of the outer mitochondrial membrane，TOM）系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)，TOM20是線粒體TOM系統(tǒng)的相關(guān)組成亞基，定位于線粒體外膜［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過TOM20識(shí)別和定位線粒體，采用免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)BNIP3和TOM20的表達(dá)及共定位程度。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加消化液，PBST沖洗3次，滴加山羊血漿封閉液。BNIP3和TOM20共定位，需加入一抗（兔抗大鼠BNIP3，1: 200，美國abcom公司；小鼠抗大鼠TOM20，1:200，美國Santa Cruz公司），4℃孵育過夜，PBST沖洗3次，同時(shí)滴加FITC，Cy3標(biāo)記的混合二抗（FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG，1: 200，碧云天生物技術(shù)有限公司；Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，1:200，碧云天生物技術(shù)有限公司），標(biāo)記BNIP3為綠色，TOM20為紅色，兩者熒光融合區(qū)域顯示為黃色，用激光共聚焦顯微鏡Zeiss LSM700觀察免疫熒光結(jié)果并采集圖像，每組隨機(jī)選切片5張，每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野，在同一放大倍數(shù)下（×400），用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Zen 2012（black version）進(jìn)行熒光強(qiáng)度和共定位分析。BNIP3的熒光強(qiáng)度可反映BNIP3在胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)量，TOM20的熒光強(qiáng)度可反映線粒體的表達(dá)量，兩者的共定位可反映BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體的程度。

1.6 心肌組織線粒體BNIP3免疫印跡實(shí)驗(yàn)

大鼠左心室切取小塊組織，稱重，冰浴下在EP管中剪碎，加入線粒體裂解液（MS buffer）提取線粒體蛋白，低溫勻漿，4℃下進(jìn)行1 000 g和3 000 g的差速離心，沉淀為線粒體，上清為剩余胞漿。BCA（bicinchonininc acid）法測(cè)定蛋白濃度。使用SDS-PAGE電泳，5%脫脂奶粉于室溫中孵育1～2 h，加入一抗（兔抗大鼠BNIP3，1:1 000，美國abcom公司），4℃過夜，TBST洗膜5次后加入二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1:3 000，武漢谷歌生物科技有限公司），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，加入發(fā)光液，用Tanon 5200 Multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)曝光，利用Image J分析軟件測(cè)定BNIP3條帶灰度值及對(duì)應(yīng)的內(nèi)參COXⅣ條帶的灰度值。BNIP3相對(duì)灰度值以BNIP3灰度值/COXⅣ灰度值表示，代表BNIP3的水平變化。

1.7 心肌組織LC3免疫印跡實(shí)驗(yàn)

大鼠左心室切取小塊組織，稱重，冰浴下在EP管中剪碎，加入蛋白質(zhì)抽提劑提取LC3，低溫勻漿超聲，4℃下12 000 rpm離心取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度。使用SDS-PAGE電泳，5%脫脂奶粉于室溫中孵育1～2 h，加入一抗（兔抗大鼠LC3，1:500，美國NOVUS公司），4℃過夜，TBST洗膜5次后加入二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1:3 000，武漢谷歌生物科技有限公司），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，加入發(fā)光液，用Tanon 5200 Multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)曝光，利用Image J分析軟件測(cè)定LC3條帶及對(duì)應(yīng)的內(nèi)參β-action條帶的灰度值。LC3相對(duì)灰度值以LC3灰度值/β-action灰度值表示，代表LC3的水平變化，用LC3II/I比值反映自噬水平的高低。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 17.0軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，組間比較采用One-wayANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 血漿cTnI含量的變化

各組大鼠血漿cTnI含量的變化如表1所示。與C組相比，EE組血漿cTnI水平明顯升高，差異具有顯著性（P＜0.05），而LEP組血漿cTnI水平無顯著性差異（P＞0.05）；與EE組相比，LEP+EE組血漿cTnI水平明顯下降，差異具有顯著性（P＜0.05）；與LEP+EE組相比，W+LEP+EE組血漿cTnI水平明顯升高，差異具有顯著性（P＜0.05）。

2.2 心肌組織HBFP染色結(jié)果

大鼠心肌組織HBFP染色結(jié)果顯示，C組心肌組織橫切和縱切面（圖1-A、1-B）顯示，心肌細(xì)胞界限清楚，染色均勻，胞漿呈黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色位于細(xì)胞中央，未見艷紅色缺血缺氧改變。EE組（圖1-C）心肌細(xì)胞界限不清楚，組織染色不均勻，可見大量斑塊狀或片狀艷紅色染色，與C組（圖1-A）相比，有明顯的缺血缺氧改變。LEP組（圖1-D）細(xì)胞界限清楚，僅有少量斑塊狀艷紅色染色。LEP+EE組（圖1-E）部分心肌細(xì)胞界限不清楚，心肌組織中出現(xiàn)部分艷紅色染色，但與EE組（圖1-C）相比，缺血缺氧程度降低。W+LEP+EE組（圖1-F）心肌細(xì)胞界限不清楚，可見大量斑塊狀艷紅色染色，與LEP+EE組（圖1-E）相比，缺血缺氧程度增加。

表1 大鼠血漿cTnI水平變化Table 1Changes of Plasma cTnI in Rats（ng/ml）

圖1 大鼠心肌組織HBFP染色結(jié)果×400Figure 1.Results of HBFP Staining in Rats Myocardium×400

心肌組織HBFP染色圖像分析結(jié)果如表2所示，心肌組織缺血缺氧面積和IOD值變化趨勢(shì)相近，故用MOD值表示各組大鼠心肌組織中單位面積內(nèi)缺血缺氧的程度。與C組相比，EE組MOD值顯著增加，差異具有顯著性（P＜0.05），而LEP組MOD值無顯著性差異（P＞0.05）。與EE組相比，LEP+EE組MOD值顯著減少，差異具有顯著性（P＜0.05）。與LEP+EE組相比，W+LEP+EE組MOD值顯著增加，差異具有顯著性（P＜0.05）。

表2 大鼠心肌組織HBFP染色結(jié)果圖像分析Table 2Image Analysis of HBFP Staining in Rats Myocardium

2.3 心肌組織BNIP3和TOM20免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大鼠心肌組織BNIP3和TOM20免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C組（圖2-A）BNIP3呈綠色，TOM20呈紅色均散在分布于胞質(zhì)中，BNIP3和TOM20共定位呈黃色分布于胞質(zhì)內(nèi)，Dapi標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色，位于細(xì)胞中央；與C組（圖2-A）相比，EE組（圖2-B）、LEP組（圖2-C）BNIP3綠色熒光強(qiáng)度和黃色重疊區(qū)域面積出現(xiàn)不同程度增加，提示BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體不同程度的升高；與EE組（圖2-B）相比，LEP+ EE組（圖2-D）綠色熒光強(qiáng)度減弱，黃色重疊區(qū)域面積減少，提示BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體程度降低。LEP+EE組相對(duì)LEP組，TOM20熒光強(qiáng)度減弱，提示線粒體存在減少。與LEP+EE組（圖2-D）相比，W+LEP+EE組（圖2-E）綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，黃色重疊區(qū)域面積增加，提示BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體程度升高。

各組大鼠心肌組織BNIP3和TOM20熒光強(qiáng)度以及兩者的共定位百分比結(jié)果如表3所示。心肌組織BNIP3熒光強(qiáng)度結(jié)果，與C組相比，EE組BNIP3熒光強(qiáng)度顯著升高（P＜0.05），LEP組和LEP+EE組BNIP3熒光強(qiáng)度無顯著性差異（P＞0.05）；與EE組相比，LEP+EE組BNIP3熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05）；與LEP+EE組相比，W+LEP+EE組BNIP3熒光強(qiáng)度顯著升高（P＜0.05）。心肌組織TOM20熒光強(qiáng)度結(jié)果，與C組相比，EE組、LEP組和LEP+EE組TOM20熒光強(qiáng)度無顯著性差異（P＞0.05）；與EE組相比，LEP+EE組TOM20熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05）；與LEP+ EE組相比，W+LEP+EE組TOM20熒光強(qiáng)度顯著升高（P＜0.05）。BNIP3對(duì)TOM20共定位百分比結(jié)果，與C組相比，EE組和LEP組BNIP3對(duì)TOM20共定位百分比顯著升高（P＜0.05）；與EE組相比，LEP+EE組BNIP3對(duì)TOM20共定位百分比顯著降低（P＜0.05）；與LEP+EE組相比，W+ LEP+EE組BNIP3對(duì)TOM20共定位百分比顯著升高（P＜0.05）。

圖2 大鼠心肌組織BNIP3和TOM20免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果×400Figure 2.Double Immunofluorescence Results of BNIP3 and TOM20 in Rats Myocardium×400

表3 大鼠心肌組織BNIP3和TOM20免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)圖像分析Table 3.Image Analysis of Double Immunofluorescence of BNIP3 and TOM20 in Rats Myocardium

2.4 心肌組織線粒體BNIP3免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大鼠心肌組織線粒體BNIP3 western blot檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。與C組相比，EE組和LEP組BNIP3水平顯著增高（0.23±0.09 vs.0.11±0.08，0.25±0.16 vs.0.11±0.08，P＜0.05）；與EE組相比，LEP+EE組BNIP3水平顯著降低（0.10±0.09 vs.0.23±0.09，P＜0.05）；與LEP+EE組相比，W+ LEP+EE組BNIP3水平顯著增高（0.35±0.33 vs.0.10±0.09，P＜0.05）。

圖3 大鼠心肌組織線粒體BNIP3水平變化Figure 3.Change of Mitochondria BNIP3 Level in Rats Myocardium

2.5 心肌組織LC3免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大鼠心肌組織LC3 western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，LC3I組間無差異（P＞0.05，圖4）。與C組相比，EE組LC3II水平顯著升高（0.56±0.38vs.0.26±0.20，P＜0.05）；與C組相比，LEP組和LEP+EE組LC3II水平無顯著性差異（P＞0.05），但具有一定升高趨勢(shì)；與EE組相比，LEP+EE組LC3II水平顯著降低（0.32±0.12vs.0.56±0.38，P＜0.05，圖5）。與C組相比，EE組LC3II/I比值顯著升高（1.87±1.24 vs.0.81±0.56，P＜0.05）；與C組相比，LEP組和LEP+EE組LC3II/I比值無顯著性差異（P＞0.05），但具有一定升高趨勢(shì)；與EE組相比，LEP+EE組LC3II/I比值顯著降低（1.12±0.68 vs.1.87± 1.24，P＜0.05，圖6）。

圖5 大鼠心肌組織LC3II水平變化Figure 5.Change of LC3II Level in Rats Myocardium

圖6 大鼠心肌組織LC3II/I水平變化Figure 6.Change of LC3II/I Level in Rats Myocardium

3 分析和討論

3.1 運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)晚期心肌保護(hù)效應(yīng)與細(xì)胞自噬的關(guān)系

已有較多研究證實(shí)，EP的晚期心肌保護(hù)效應(yīng)。Domenech等［11］用狗進(jìn)行速度為6 km/h，運(yùn)動(dòng)5 min，休息5 min，重復(fù)5次的一次間歇跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)建立EP模型，在EP結(jié)束后24 h，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支60 min，再灌注270 min，發(fā)現(xiàn)心肌梗死面積較對(duì)照組減少46%，提示EP誘導(dǎo)的晚期保護(hù)效應(yīng)可以減輕IR損傷。Hao等［17］用大鼠進(jìn)行速度為30 m/min，運(yùn)動(dòng)10 min，休息10 min，重復(fù)4次的一次大強(qiáng)度間歇跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)EP心肌保護(hù)效應(yīng)，在EP結(jié)束后24 h，對(duì)大鼠進(jìn)行一次力竭運(yùn)動(dòng)，證實(shí)EP誘導(dǎo)的晚期保護(hù)效應(yīng)可以減輕力竭運(yùn)動(dòng)所致的心肌損傷。cTnI是心肌細(xì)胞特有的收縮調(diào)節(jié)蛋白，在檢測(cè)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷中有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［29］。當(dāng)心肌細(xì)胞缺血缺氧損傷時(shí)，細(xì)胞膜的通透性和完整性發(fā)生改變，導(dǎo)致血液中cTnI升高。HBFP染色是一種檢測(cè)早期心肌缺血缺氧的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，它利用缺血缺氧心肌的親復(fù)紅性原理，顯示心肌組織的缺血缺氧改變。Gerche等［13］在探討運(yùn)動(dòng)性右心室功能紊亂和結(jié)構(gòu)重塑的過程中，發(fā)現(xiàn)血液cTnI含量與右心室功能紊亂關(guān)系密切，他們對(duì)40名訓(xùn)練有素的耐力運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行一次耐力運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)結(jié)束后即刻檢測(cè)血液cTnI含量，發(fā)現(xiàn)所有運(yùn)動(dòng)員血液cTnI含量顯著升高，右心室功能下降，一周后右心室功能得到恢復(fù)。劉澤廣等［3］在探討EP保護(hù)效應(yīng)和B型鈉尿肽關(guān)系的研究中，曾采用血漿cTnI檢測(cè)和HBFP染色方法，從血液和組織學(xué)兩個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)心肌損傷和保護(hù)的程度。本實(shí)驗(yàn)在EP模型的基礎(chǔ)上，在EP結(jié)束后24 h，對(duì)大鼠進(jìn)行一次大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)，探討EP對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)的晚期保護(hù)效應(yīng)，并通過血漿cTnI含量和HBFP染色綜合評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷和保護(hù)的程度。與C組相比，LEP組大鼠血漿cTnI水平和HBFP染色的MOD值無顯著性差異，進(jìn)一步證實(shí)EP是一種無損傷性預(yù)適應(yīng)方式；EE組大鼠血漿cTnI水平和HBFP染色的MOD值明顯升高，提示一次大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠運(yùn)動(dòng)性心肌損傷。與EE組相比，LEP+EE組大鼠血漿cTnI水平和HBFP染色的MOD值明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)EP誘導(dǎo)的晚期保護(hù)效應(yīng)可以減輕力竭運(yùn)動(dòng)所致的心肌損傷。

目前，在細(xì)胞自噬和心肌保護(hù)作用的研究中，細(xì)胞自噬抑制劑已得到廣泛應(yīng)用。Huang等［19］用Langendorff灌注的大鼠心臟探討自噬在IP心肌保護(hù)的作用，在IP開始前，先灌注自噬抑制劑Tat-ATG5K130R15 min，然后再進(jìn)行I/R損傷，結(jié)果顯示，IP后10 min細(xì)胞自噬增強(qiáng)，使用自噬抑制劑Tat-ATG5K130R后IP的心肌保護(hù)作用減弱，提示細(xì)胞自噬在IP誘導(dǎo)的心肌保護(hù)中發(fā)揮作用。劉藝等［2］為探討自噬在IP減少急性心肌I/R損傷中的作用，采用冠脈結(jié)扎術(shù)建立大鼠急性心肌I/R損傷模型，在IP開始前15 min腹腔注射自噬抑制劑wortmannin，結(jié)果顯示，當(dāng)wortmannin抑制細(xì)胞自噬后，IP的心肌保護(hù)作用減弱，提示細(xì)胞自噬在IP減輕I/R損傷中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，EP誘導(dǎo)的晚期保護(hù)效應(yīng)可以減輕力竭運(yùn)動(dòng)所致的心肌損傷，為進(jìn)一步探討細(xì)胞自噬與EP晚期保護(hù)效應(yīng)的關(guān)系，在EP前0.5 h腹腔注射自噬抑制劑wortmannin，特別設(shè)計(jì)W+LEP+ EE組。結(jié)果顯示，與LEP+EE組相比，W+LEP+EE組大鼠血漿cTnI水平和HBFP染色的MOD值明顯升高，提示抑制自噬使EP對(duì)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的晚期保護(hù)作用減弱，細(xì)胞自噬部分參與EP的晚期保護(hù)效應(yīng)。

3.2 BNIP3誘導(dǎo)線粒體自噬與運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)晚期保護(hù)效應(yīng)的關(guān)系

BNIP3作為Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白，它不僅參與細(xì)胞凋亡，還調(diào)控細(xì)胞自噬，在促進(jìn)細(xì)胞存活的自噬過程中具有重要作用，并能與受損線粒體結(jié)合參與線粒體自噬［26］。BNIP3在正常生理?xiàng)l件下可通過C-末端定位在線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，表達(dá)水平較低［1，16］。在心肌中，缺血缺氧條件下BNIP3會(huì)急劇升高，高表達(dá)的BNIP3絕大多數(shù)也定位在線粒體外膜［26］。此時(shí)細(xì)胞受到刺激被活化，由單體形式轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠w形式，二聚體形式的BNIP3會(huì)募集LC3，與線粒體緊密結(jié)合，激活線粒體自噬［16］。本實(shí)驗(yàn)在一次大強(qiáng)度的力竭運(yùn)動(dòng)中，免疫熒光雙標(biāo)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EE組BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體的程度和表達(dá)量都要顯著高于C組，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，HBFP實(shí)驗(yàn)結(jié)果中力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致缺血缺氧損傷程度的升高，與BNIP3向線粒體外膜轉(zhuǎn)位以及在線粒體上表達(dá)量的升高存在關(guān)聯(lián)。EE過程中線粒體自噬的激活，其可能與較高的線粒體損傷程度之間存在聯(lián)系。王文成等［5］在探討力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌線粒體功能的影響及與運(yùn)動(dòng)性疲勞關(guān)系的研究中，發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)可造成線粒體和心肌損傷，力竭運(yùn)動(dòng)后24 h各項(xiàng)指標(biāo)基本恢復(fù)。在EP模型中，與C組相比，LEP組BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體的程度和表達(dá)量顯著增加，這一結(jié)果提示，LEP促使BNIP3表達(dá)量升高，也可以誘導(dǎo)線粒體自噬，但與EE誘導(dǎo)的線粒體自噬可能存在差異，期間并不依賴缺血缺氧損傷程度的改變，說明LEP期間線粒體損傷本身并不嚴(yán)重，可能是TOM20沒有明顯變化的原因。血漿cTnI結(jié)果和HBFP染色結(jié)果顯示，EP是一種無損傷性預(yù)適應(yīng)方式，而這種保護(hù)效應(yīng)可能通過BNIP3誘導(dǎo)的線粒體自噬發(fā)揮作用。Hamacher等［15］探討B(tài)NIP3在心肌I/R損傷中的作用研究中，發(fā)現(xiàn)在I/R損傷模型中，BNIP3通過上調(diào)自噬水平和清除受損線粒體產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，減輕I/R所致的心肌損傷。一次短時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)造成心肌短暫的相對(duì)或絕對(duì)缺血缺氧，Band等［9］在大鼠心臟組織的研究中發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，BNIP3表達(dá)量的升高依賴于缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的升高，同時(shí)BNIP3的表達(dá)可以有效地誘導(dǎo)線粒體自噬。反復(fù)短暫大強(qiáng)度的EP，通過引起較低程度的組織相對(duì)缺血缺氧，可能也誘導(dǎo)了HIF-1α依賴的BNIP3升高。免疫熒光雙標(biāo)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與EE組相比，LEP+EE組BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體的程度和表達(dá)量顯著降低，而與C組相比，LEP+EE組BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體的程度和表達(dá)量無顯著性差異，保持在同一水平。LEP+EE組大鼠先進(jìn)行一次EP模型運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)盡管與C組相比，LEP組BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體的程度和表達(dá)量顯著升高，但24 h后進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)，線粒體自噬效率升高，可能是導(dǎo)致LEP+EE組BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體的程度和表達(dá)量顯著降低的因素［30］。在此期間TOM20熒光強(qiáng)度的顯著降低，說明LEP+EE組線粒體清除數(shù)量顯著增高，并抑制了EE引起的BNIP3增高，在避免了BNIP3誘導(dǎo)的前凋亡因素情況下，也激活了自噬［16］。這一結(jié)果提示在EP晚期心肌保護(hù)效應(yīng)中，BNIP3誘導(dǎo)的線粒體自噬參與了EP對(duì)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的保護(hù)作用。

3.3 LC3依賴的線粒體自噬與運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)晚期保護(hù)效應(yīng)的關(guān)系

BNIP3誘導(dǎo)了自噬在線粒體上的識(shí)別，依賴與之相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)LC3形成連續(xù)的自噬過程［16］。LC3可以反映自噬體的形成，它存在兩種可以相互轉(zhuǎn)化的形式LC3I和LC3II，LC3II是自噬體的標(biāo)志分子，隨自噬體膜的增多而增多，因此，LC3II/I比值在一定程度上可以反映自噬水平［8］。研究發(fā)現(xiàn)，BNIP3在成年大鼠心肌細(xì)胞中可以有效地誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［26］。Chen等［10］證實(shí)，在缺氧的情況下，隨著缺氧時(shí)間的延長，活化BNIP3會(huì)導(dǎo)致LC3II不斷積累。本實(shí)驗(yàn)免疫印跡結(jié)果顯示，與C組相比，EE組細(xì)胞內(nèi)LC3II水平和LC3II/I比值顯著升高，提示BNIP3有充足的LC3可以募集至線粒體，對(duì)誘導(dǎo)線粒體自噬具有潛在性，但也發(fā)現(xiàn)，EE無法引起TOM20熒光強(qiáng)度的顯著降低，提示EE期間的受損線粒體可能未有效清除，推測(cè)EE過程中需降解的損傷物質(zhì)大量產(chǎn)生，造成自噬體的代謝障礙引起堆積，是線粒體自噬過程受阻的主要原因。Ogura等［22］，在研究了一次30 min，30 m/min的大鼠跑臺(tái)模型后不同時(shí)間點(diǎn)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后即刻LC3II表達(dá)水平顯著降低，而在1 h時(shí)超量恢復(fù)超過運(yùn)動(dòng)前達(dá)到峰值，3 h時(shí)出現(xiàn)回落接近運(yùn)動(dòng)前。與C組相比，LEP組LC3II水平和LC3II/I比值盡管無顯著性差異，但具有一定升高趨勢(shì)，可能與LC3II在EP結(jié)束后24 h存在回落有關(guān)［22］，結(jié)合BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體程度和表達(dá)量的顯著升高，提示LEP雖然不會(huì)引起缺血缺氧損傷加劇，但可以誘導(dǎo)BNIP3預(yù)先合成和大量轉(zhuǎn)位促進(jìn)自噬的潛在性表達(dá)。與C組相比，LEP+EE組LC3II水平和LC3II/I比值無顯著性差異，但具有一定升高趨勢(shì)。與EE組相比，LEP+EE組LC3II水平和LC3II/I比值顯著降低，同時(shí)TOM20熒光強(qiáng)度也顯著降低，結(jié)合BNIP3轉(zhuǎn)位線粒體的程度和表達(dá)量，提示LEP誘導(dǎo)的BNIP3和細(xì)胞自噬的升高存在關(guān)聯(lián)，在隨后的EE過程中，自噬體和線粒體數(shù)量相對(duì)EE組都有顯著降低，BNIP3與LC3兩者充分發(fā)揮了線粒體自噬的保護(hù)作用，從而有效清除了受損線粒體，是LEP+EE未引起缺血缺氧損傷的重要原因。綜上，本實(shí)驗(yàn)表明，LC3依賴的線粒體自噬通過BNIP3的誘導(dǎo)，在EP晚期心肌保護(hù)效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

EP可以減輕一次大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌所造成的運(yùn)動(dòng)性損傷，細(xì)胞自噬部分參與EP的晚期保護(hù)效應(yīng)。一次大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)和EP均會(huì)導(dǎo)致BNIP3表達(dá)升高，參與誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體自噬。在EP晚期心肌保護(hù)效應(yīng)中，BNIP3誘導(dǎo)的線粒體自噬參與了EP對(duì)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的保護(hù)作用。

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Changes of Myocardial Mitophagy Related Protein BNIP3 during Late Cardioprotection of Exercise Preconditioning

WAN Dong-feng，PAN Shan-shan，YUAN Yang

Objective:To detect and observe the change of mitophagy related protein Bcl-2 19-kDa interacting protein 3（BNIP3）expression during late cardioprotection of exercise preconditioning，and to determine the relationship between late cardioprotection of exercise preconditioning and myocardial mitophagy.Methods:SD rats were divided into control group（C），EE group，LEP group，LEP＋EE group，and W+LEP+EE group.After establishing of EP animal model，exhaustive exercise on treadmill for inducing myocardial injury.Then the level of cTnI and hematoxylin basic fuchsin picric acid（HBFP）staining were used to evaluate the degree of myocardial injury and protection.Double immunofluorescence was used to evaluate the transposition of BNIP3 and TOM20.Western blotting method was used to detect change of BNIP3 and LC3.Results:As compared with the group C，the cTnI level in plasma and mean optical density（MOD）increased significantly，the degree of the transposition of BNIP3 to mitochondria，the level of BNIP3 and LC3II/I increased significantly in group EE；While compared with the group C，there was no significant difference in the cTnI level，MOD and the level of LC3II/I in group LEP，but the degree of the transposition of BNIP3 to mitochondria and the level of BNIP3 increased significantly.As compared with the group EE，the cTnI level in plasma and MOD decreased significantly，the degree of the transposition of BNIP3 to mitochondria，the level of BNIP3 and LC3II/I decreased significantly in group LEP+EE.As compared with the group LEP+EE，the cTnI level in plasma and MOD increased significantly，the degree of the transposition of BNIP3 to mitochondria and the level of BNIP3 increased significantly in group W+LEP+EE.But there was no significant difference in the level of LC3II/I in group W+LEP+EE.Conclusion:Exercise preconditioning can induce mitophagy related protein BNIP3 to increase expression，and the mitophagy induced by BNIP3 participated in late cardioprotection of exercise-induced myocardial injury preconditioning during late cardioprotection of exercise preconditioning.

1000-677X（2017）03-0035-09

10.16469/j.css.201703004

G804.7

：A

2016-07-15；

：2017-02-24

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31471136）。

萬棟峰，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心血管形態(tài)和機(jī)能，E-mail：derfulwon@126.com；潘珊珊，女，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心血管形態(tài)和機(jī)能，Tel：（021）51253252，E-mail：panshanshan@sus.edu.cn。

上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海200438

Shanghai University of Sport，Shanghai 200438，China.

Key words:BNIP3；LC3；myocardial mitophagy；exercise preconditioning；late cardioprotection