顧建青湯 蕊王瑞琦周俊雄尹 佳王良錄支玉香孫勁旅李 宏文利平關 凱李麗莎王子熹徐 濤

[中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài) (過敏)反應科過敏性疾病精準診療研究北京市重點實驗室中國醫(yī)學科學院臨床免疫研究中心，北京100730]

樺樹主要分布于北溫帶，在歐洲國家，樺樹花粉是全年中最重要的致敏花粉，數量達到禾本科花粉的2倍以上[1]。我國北方地區(qū)樺樹同樣也廣泛分布，北京城區(qū)空氣中花粉分析顯示，樺樹花粉的含量占全年花粉總量的5.99%，是我國北方地區(qū)重要的春季致敏花粉，僅次于白蠟樹、柏科和楊屬花粉[2]。對20萬項次過敏原特異性免疫球蛋白E(specific immunoglobulin E，sIgE)檢測結果顯示，樺樹花粉sIgE的陽性檢出率為45.1%，致敏率高[3]。

皮膚試驗是診斷過敏性疾病最常用的體內診斷方法，主要包括皮內試驗和皮膚點刺試驗 (skin prick test，SPT)。1959年，Ebruster首次報道了 SPT用于過敏性疾病的診斷，與皮內試驗相比，SPT具有操作簡便、患者耐受性好、特異度高、重復性好、與臨床相關性好、不良反應發(fā)生率低等優(yōu)點，因此被歐洲變態(tài)反應和臨床免疫學會 (European Academy of Allergy and Clinical Immunology，EAACI)推薦為診斷過敏性疾病的首選檢查方法[4-5]。但在國內，目前仍主要以皮內試驗的方法診斷包括花粉在內的吸入性變應原，而部分已開展花粉變應原點刺試驗進行過敏性疾病診斷時采取的陽性判斷標準也不盡相同[6-8]。本研究旨在以變應原sIgE檢測值作為臨床診斷標準，評價北京協(xié)和醫(yī)院樺樹花粉變應原 (簡稱協(xié)和樺樹花粉變應原)SPT診斷樺樹花粉過敏癥的有效性和安全性，并確定SPT最佳診斷界值。

資料與方法

對象

選擇2015年8月10日至2016年10月20日在北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài) (過敏)反應科就診，患有過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性結膜炎、過敏性皮炎、蕁麻疹等過敏性疾病的門診患者。本研究得到北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署書面知情同意書。

入選標準:年齡4～70歲；男女不限；已完成樺樹花粉皮內試驗和 (或)sIgE檢測。

排除標準:妊娠期及哺乳期婦女；試驗前未停用抗組胺藥物或停藥時間小于藥物5個半衰期；正在服用全身糖皮質激素；皮膚劃痕征陽性；試驗部位有皮膚感染、皮炎或外傷、瘢痕等病理變化；銀屑??；過敏性疾病急性發(fā)作期 (如過敏性哮喘急性發(fā)作)；有嚴重影響全身狀態(tài)的疾病 (包括嚴重的高血壓、冠心病等)；目前正在應用β受體阻滯劑治療 (包括局部應用)；3個月內參加過其他藥物臨床試驗；研究者認為不適合參加試驗的其他情況。

剔除標準:不符合入選標準或符合排除標準；樺樹花粉血清sIgE結果缺失；SPT陽性或陰性對照數據缺失；SPT陽性對照出現陰性反應 [平均風團直徑(mean wheal diameter，MWD) ＜3 mm]，或陰性對照出現陽性反應者 (MWD≥3 mm)。

方法

本研究采用單中心、平行分組的設計方法。

所有入選的受試者同時接受包括圓柏、樺樹、梧桐、洋白蠟4種春季花粉變應原點刺液以及陰性對照、陽性對照在內的SPT，SPT后留觀1 h。本研究所用點刺液均由北京協(xié)和醫(yī)院變應原制劑室生產:樺樹花粉變應原點刺液批號為201508D002，于2～8℃保存。陰性對照為緩沖鹽水甘油溶液，陽性對照為5 mg/ml磷酸組胺緩沖鹽水甘油溶液。點刺針選用施萊TM一次性使用采血針 (片式點刺針)，由淮安藍星塑料器械開發(fā)有限公司生產。

SPT在受試者前臂屈側皮膚進行，方法參照歐洲標準[5]，點刺后15 min觀察結果。以皮膚點刺后出現的風團大小為判斷標準，用MWD表示。先測量風團的最長徑為風團長軸 (D)，于長軸的中點做長軸的垂線，以垂線形成的直徑為風團短軸 (d)。MWD＝(D＋d)/2。同時觀察并記錄受試者在SPT后15 min、1 h以及6 h后出現的不良事件。

SPT后采集受試者血清進行樺樹花粉變應原sIgE檢測，應用ImmunoCAP?系統(tǒng) (Phadia AB)的全自動熒光免疫分析儀Phadia?1000及配套試劑。

研究流程見表1。

表1 研究流程Table 1 Research process

統(tǒng)計學處理

以樺樹花粉變應原sIgE檢測結果為過敏原特異度診斷的相對金標準:sIgE≥0.35 kUA/L為陽性組，sIgE＜0.35 kUA/L為陰性組。

進行受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC曲線)分析，計算ROC曲線下面積 (area under curve，AUC)，估算SPT最佳診斷界值及特異度達95%時的診斷界值。分析樺樹花粉SPT的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。對不良事件的表現、嚴重程度、轉歸以及與SPT的關系等進行總結。

結 果

一般情況

本研究共計入組1 029例，無脫落病例，其中22例受試者的樺樹花粉變應原sIgE結果缺失，不進入全分析集 (full analysis set，FAS)，FAS共1 007例。另有不符合入選標準72例，陰性對照出現陽性反應104例，陽性對照出現陰性反應86例，無陰性、陽性對照1例。共剔除264例，剔除率25.66%，符合方案集 (per protocol set，PPS)765例。

FAS受試者的平均年齡為 (32.14±13.69)歲，最小5.68歲，最大65.28歲；男509例 (50.55%)，女498例 (49.45%)。PPS受試者平均年齡為(32.55±13.62)歲，最小5.68歲，最大65.28歲；男392例 (51.24%)，女373例 (48.76%)。

PPS的SPT組胺陽性對照MWD為 (4.74±1.38)mm，最小值3.00 mm，最大值25.50 mm。

所有受試者均有安全性評估記錄，安全數據集(save set，SS) 為1 029例。

有效性評價

以樺樹花粉變應原sIgE檢測為標準，采用SPT診斷樺樹花粉過敏的ROC曲線:FAS的AUC為0.909，95%可信區(qū)間為0.891～0.928；PPS的 ROC曲線AUC為0.919，95%可信區(qū)間為0.898～0.939(圖1)。由FAS的ROC曲線確定最佳診斷界值為4.25mm，特異度達95%時的診斷界值為5.75 mm。由PPS的ROC曲線確定最佳診斷界值為4.25 mm，特異度達95%時的診斷界值為5.25mm。

圖1 協(xié)和樺樹花粉變應原用于診斷樺樹花粉過敏的受試者工作特征曲線Fig 1 Receiver operating characteristic curve of birch allergen used to diagnose birch pollen allergy FAS:全分析集；PPS:符合方案集

分別以樺樹花粉點刺試驗結果MWD 3.00、4.25及5.75mm為診斷界值，SPT診斷樺樹花粉過敏癥的準確性見表2、3。

安全性分析

SS共納入1 029例受試者，在整個研究過程中共6例出現了7次不良事件，不良事件發(fā)生率0.58%(6/1 029)，這些不良反應均被認為與受試者接受的變應原SPT相關。本研究不良事件表現為鼻癢、噴嚏、流涕、鼻塞、眼癢以及點刺局部皮膚出現較大風團反應等 (表4)。所有不良事件均為輕度，無需特殊處理，且均可自行緩解。本研究過程未發(fā)生嚴重不良事件。

表2 以SPT不同界值診斷樺樹花粉過敏癥的病例分布 (FAS)Table 2 Diagnosis of birch pollen allergy with different boundary values of skin prick test(FAS)(n)

表3 以SPT不同界值診斷樺樹花粉過敏癥的的準確性 (FAS)Table 3 Accuracy of diagnosis of birch pollen allergy by different skin prick tests(FAS)

表4 不良事件分類及其發(fā)生率Tab le 4 Classification and incidence rate of adverse events

討 論

在大多數情況下，過敏性疾病的標準診斷方法是基于詳細的臨床病史以及通過皮膚試驗或體外測試明確的與臨床病史一致的相關過敏原。過敏原激發(fā)試驗作為診斷過敏性疾病的金標準，長期以來一直作為研究過敏性疾病發(fā)病機制或者抗過敏藥物療效的研究手段，由于激發(fā)試驗可能誘發(fā)嚴重過敏反應等安全問題同時缺乏標準化的操作規(guī)程，而且隨著目前體外檢測方法的進步以及高質量的標準化變應原用于皮膚試驗，激發(fā)試驗已很少用于變態(tài)反應臨床工作[9]。

20世紀70年代以來，過敏原體外診斷得到飛速發(fā)展。瑞典Pharmacia公司率先使用熒光酶聯免疫法 (ImmunoCAP?系統(tǒng))進行過敏原sIgE檢測，目前該方法是國際上應用最為廣泛的過敏原sIgE檢測方法，具有很好的重復性與臨床相關性[10]。北京協(xié)和醫(yī)院于1992年將該檢測方法引入國內以來，該檢測系統(tǒng)在國內得到廣泛應用，多年來的臨床資料顯示，ImmunoCAP?系統(tǒng)用于過敏性疾病的特異性診斷準確可靠[11]。國外很多研究資料也表明，SPT與ImmunoCAP?血清 sIgE檢測結果一致性好[12-15]。EAACI推薦，對于常見花粉和寵物過敏原，依據臨床病史，輔以SPT和 (或)sIgE檢測結果，即可做出過敏原特異性診斷[4]。本研究以血清sIgE檢測為相對金標準，評價SPT用于樺樹花粉過敏原特異性診斷的有效性。

點刺針的種類多樣，用不同的點刺針進行SPT的比較研究顯示，針尖1.0 mm長的單頭Lancet鋼針的重復性最好，假陰性和假陽性少，受試者疼痛感輕[16-17]。但由于目前國內尚無變應原點刺試驗的專用點刺針，故本研究選用由淮安藍星塑料器械開發(fā)有限公司生產的一次性鋼片式點刺針。

進行點刺試驗時，點刺針穿過液滴垂直刺入皮膚，需停留至少1 s，點刺壓力適中，如果壓力過輕針尖沒有刺入上皮，會造成假陰性反應；如果刺入過深引起出血，會造成假陽性反應。由于本研究所用的點刺針是原本用于采集指血的采血針，針尖稍大，容易刺入表皮，造成出血或假陽性反應，或者操作護士為了避免出血，用力過輕，造成假陰性反應，因此本研究的剔除病例數較多。但剔除后的PPS研究結果與FAS的分析結果一致。

SPT除了受點刺針、操作者手法的影響外，還受到受試者皮膚條件、用藥史等多方面的影響，為了保證點刺試驗結果的準確性，需同時加做陰性對照和陽性對照。陰性對照通常選用過敏原制劑提取緩沖液。陰性對照出現陽性反應的可能原因包括:受試者皮膚劃痕征陽性，或操作者點刺時用力過度。為避免過敏原點刺試驗結果解釋困難，本研究剔除了陰性對照出現陽性反應者。陽性對照通常選用組胺溶液，目前歐洲推薦使用的是10 mg/ml鹽酸組胺，引起皮膚反應的 MWD約7 mm(5.4～8.5 mm)[18]。因鹽酸組胺的藥用制劑在國內不易獲得，故本研究選用的是5mg/ml磷酸組胺，組胺基質濃度約相當于3 mg/ml的鹽酸組胺。結果顯示，5 mg/ml磷酸組胺陽性對照引起皮膚反應的MWD為 (4.74±1.38)mm(3.0～25.5mm)。

陽性對照出現陰性反應的主要原因是合并用藥對皮膚反應的抑制作用，常見對皮膚反應有抑制作用的藥物，包括抗組胺藥、皮質激素全身大劑量應用或試驗部位局部應用、抗抑郁藥、奧馬珠單抗等[5]，研究者在篩選期應仔細詢問受試者合并用藥種類和停用時間等，對有相關合并用藥者予以排除。為保證試驗結果的準確性，本研究剔除了陽性對照出現陰性結果者。

SPT后15 min觀察和記錄結果。本研究用記號筆沿風團和紅暈的外緣描繪出其形狀，然后用透明膠帶平貼在風團與紅暈上，使記號筆描繪的顏色轉印至膠帶上，揭起膠帶貼于研究記錄紙上。統(tǒng)一量取記錄紙上的內緣直徑作為測量依據。

風團大小可以用掃描面積、MWD或D表示，有研究顯示，掃描面積可以最準確地反映風團大小[19-20]，但量取方法比較復雜，不宜臨床常規(guī)使用；當風團面積＞17 mm2時，D能更好地反映風團大小，而且更易于量取；但MWD仍然最常用，MWD≥3 mm為SPT陽性。雖然皮膚對組胺的反應有個體差異，但這種差異與過敏原引起的皮膚反應無關[21]，所以SPT結果的判讀無需以組胺陽性對照的反應大小為標準。紅暈反應的重復性差，不能作為SPT結果判讀的參考指標。

ROC曲線是對所有可能的閾值作計算顯示敏感度和特異度之間的相互關系，能動態(tài)、客觀地反映診斷系統(tǒng)的效能。以敏感度為縱坐標，以 (1-特異性)為橫坐標繪制曲線，AUC越大，診斷準確度越高。ROC曲線AUC為0.5～1.0，AUC越接近于1.0，說明診斷效果越好。通過ROC曲線能確定檢測系統(tǒng)的最佳工作點，通常以陽性似然比、Youden指數、敏感度與特異度之和或平方和最大的一點的數據定為診斷臨界值，此時準確率最大；但在實際應用中，需要考慮臨床、經濟等多種因素，明確誤診、漏診帶來的后果，有無補救措施等情況綜合考慮，最終確定一個診斷臨界值[22]。

對于SPT的MWD這一連續(xù)性資料，本研究采用了ROC曲線分析。ROC曲線AUC為0.909(95%可信區(qū)間0.891～0.928)，因此可認為協(xié)和樺樹花粉變應原用于樺樹花粉過敏癥的特異性診斷的準確度較高。

由ROC曲線分析推算最佳閾值為4.25 mm，特異度達95%時的閾值為5.25 mm。以國際推薦的MWD 3mm作診斷界值時，試驗敏感度為0.906 1(95%可信區(qū)間0.884 0～0.928 2)；以4.25mm作診斷界值時，試驗敏感度為0.797 3(95%可信區(qū)間0.766 9～0.827 7)。因為SPT操作簡便，價格便宜，常用于過敏原的初步篩查，需要保證較高的敏感度，減少漏診率，所以選擇3 mm作為協(xié)和樺樹花粉變應原點刺試驗的診斷界值為宜。以5.25 mm作診斷界值時，試驗特異度為0.952 4(95%可信區(qū)間0.929 6～0.975 2)，陽性預測值為0.965 7(95%可信區(qū)間0.949 1～0.982 2)，即樺樹花粉點刺試驗MWD達5.25 mm的受試者中，有95%以上過敏原sIgE檢測陽性，誤診率＜5%。以上結果提示在結合臨床病史的前提下，樺樹花粉變應原SPT MWD＞5.25 mm時，基本無需進行過敏原sIgE檢測，即可做出過敏原特異性診斷；當5.25mm＞MWD≥3mm時，過敏可能性大，需進行sIgE檢測以明確診斷；當 MWD＜3 mm時，如無春季花粉過敏的相關病史，則可基本排除樺樹花粉過敏的診斷。Kanceljak-Macan等[23]的研究也發(fā)現對于不同的螨類變應原SPT也存在不同的最佳診斷界值。

點刺試驗的不良反應有皮膚局部反應、遲發(fā)反應、全身性皮疹、鼻炎、哮喘和過敏性休克等全身反應。本試驗1 029例共發(fā)生6例與變應原點刺試驗有關的不良事件，表現為注射部位大風團或多個風團，鼻癢、流涕、噴嚏、鼻塞、眼癢。所有不良反應癥狀輕微，無需處理。試驗中未出現嚴重過敏反應 (如過敏性休克等)，說明該診斷試劑的安全性高。

Liccardi等[24]對皮膚試驗進行的一項回顧性研究指出，1985至2005年皮膚試驗共發(fā)生致死性事件7例，其中SPT未發(fā)生一例。其他歐洲的研究報道也顯示，SPT引起嚴重過敏反應的風險為0.005%～0.008%[25]。盡管點刺試驗出現嚴重不良反應的概率很低，但因為可能出現一些致死性的嚴重不良反應(如過敏性休克)，因此需要經由專業(yè)的醫(yī)護人員實施SPT，并至少觀察30 min，進一步提高SPT的安全性。

綜上所述，采用協(xié)和樺樹花粉變應原進行SPT，操作簡便，安全性好，用于樺樹花粉過敏癥特異性診斷的價值較高，可作為臨床輔助檢查方法。

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