郎剛?cè)A+顧立眾+李西騰

摘要：大米α-球蛋白是大米胚乳中主要的鹽溶蛋白，也是大米的主要致敏原之一。為了建立起大米α-球蛋白的檢測分析方法，將大米α-球蛋白的編碼基因亞克隆到表達(dá)載體pQE30中，并在大腸桿菌中進(jìn)行了重組大米α-球蛋白的表達(dá)。通過金屬親和層析法對(duì)重組大米α-球蛋白進(jìn)行純化，以純化的重組大米α-球蛋白為抗原免疫白兔，制備出了抗大米α-球蛋白多克隆抗體。Western Blotting 檢測結(jié)果顯示，該抗體能夠特異性地與大米α-球蛋白進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)，抗大米α-球蛋白抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合呈現(xiàn)出一定的定量關(guān)系。并且，利用該抗體構(gòu)建起了大米α-球蛋白的 ELISA檢測分析方法，并對(duì)3種大米樣品中α-球蛋白的含量進(jìn)行了檢測分析。

關(guān)鍵詞：大米；α-球蛋白；原核表達(dá)；抗體；檢測分析；Western Blotting；ELISA

中圖分類號(hào)： TS201.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0034-04

水稻是世界三大重要的糧食作物之一，世界上一半以上的人口以大米為主食。大米為人們提供了必需的淀粉、蛋白質(zhì)、脂類、維生素和微量元素等。大米的蛋白質(zhì)成分影響著大米的營養(yǎng)價(jià)值、口感及深加工過程。大米蛋白質(zhì)可以分為水溶性的清蛋白、鹽溶性球蛋白、醇溶蛋白和堿溶性谷蛋白[1]。大米中的貯存蛋白質(zhì)聚集成2種蛋白體，即蛋白體Ⅰ和蛋白體Ⅱ。蛋白體Ⅰ包含有醇溶蛋白，蛋白體Ⅱ是由谷蛋白和球蛋白組成的[2]。大米α-球蛋白是大米球蛋白的一種，它主要存在于大米蛋白體Ⅱ中[3-4]。

雖然大米被認(rèn)為是一種低致敏原食物，但是，基于對(duì)攝食大米產(chǎn)生過敏反應(yīng)患者血清IgE抗體的免疫分析，鑒定出幾種分子量為60、33、26、14～16、9 ku的大米蛋白質(zhì)為致敏原[3-7]。其中分子量為26 ku的蛋白質(zhì)被鑒定為大米 α-球蛋白，而且，大米α-球蛋白是大米鹽溶蛋白的主要組分[3]。轉(zhuǎn)基因水稻是繼轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花和油菜之后最具開發(fā)潛力的轉(zhuǎn)基因作物。被賦予抗病、抗蟲、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等性狀的轉(zhuǎn)基因水稻的研究開發(fā)已經(jīng)在我國和其他國家展開[8-13]。致敏原表達(dá)水平的評(píng)價(jià)是轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，包括α-球蛋白在內(nèi)的大米主要致敏原檢測也是轉(zhuǎn)基因大米安全性分析的重要內(nèi)容之一[13-15]。

為了開發(fā)出對(duì)大米α-球蛋白進(jìn)行定性檢測和定量分析的方法，本研究以大米α-球蛋白基因的cDNA為模板進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增，并把擴(kuò)增的目的片段亞克隆到表達(dá)質(zhì)粒pQE30中，進(jìn)而在大腸桿菌中進(jìn)行大米α-球蛋白的表達(dá)。以重組大米α-球蛋白為抗原制作抗體，既可避免繁瑣的蛋白質(zhì)提取過程，也可以防止由于共存大米蛋白而引起的交叉免疫反應(yīng)。隨后，以重組α-球蛋白為抗原免疫白兔制備了多克隆抗體。本研究分析了該抗體的特異性，并利用此抗體建立了對(duì)大米α-球蛋白進(jìn)行定性和定量分析的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

編碼大米α-球蛋白的cDNA購自日本生物資源研究所；pQ30、Ni-NTA Superflow Cartridge、QIAGEN 質(zhì)粒純化試劑盒、QIAGEN PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒和QIAquick 凝膠提取試劑盒購自QIAGEN公司；蛋白酶抑制劑混合片Complete Mini和PCR 試劑盒Expand High Fidelity PCR System購自德國羅氏公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、去磷酸化試劑盒和Mighty DNA克隆試劑盒購自TaKaRa公司；CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit購自美國貝克曼庫爾特有限公司；Bezonase核酸酶購自默克公司；Can Get Signal Solution 1 和 Can Get Signal Solution 2 購自東洋紡公司；Lysing Matrix D購自日本船越公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，Quick Start Bradford蛋白質(zhì)分析試劑盒、TMB顯色液（A、B 2種），PVDF膜和Precision Plus Protein Dual Color Standards購自美國伯樂公司；ECL Prime Western Blotting System，HiTrap Protein A HP 購自 GE Healthcare公司；Perioxidase Labeling Kit-NH2購自日本同仁化學(xué)研究所；IMMUNO-TEK Construction System購自 ZeptoMetrix公司；大米樣品是從農(nóng)戶處購買的3種東北產(chǎn)糙米。

1.2 編碼大米α-球蛋白基因的亞克隆以及表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 PCR擴(kuò)增目的片段

以編碼大米α-球蛋白基因的cDNA為模板，用Expand High Fidelity PCR System對(duì)編碼大米α-球蛋白的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用于擴(kuò)增大米α-球蛋白基因的正向引物是 5′-AAA[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]CTGAGCGAGTCGGAGATGAGG-3′，其中用下劃線標(biāo)出的序列是BamHⅠ酶切位點(diǎn)；反向引物是 5′-TTT[ZZ（Z]AAGCTT[ZZ）]CTACTACTAGTACTGGCCGGC-3′；其中用下劃線標(biāo)出的序列是HindⅢ酶切位點(diǎn)。

50 μL PCR反應(yīng)體系：5×反應(yīng)液5 μL、 正向和反向引物（10 μmol/L） 各2 μL、 模板DNA 300 ng、 dNTP混合物（每種dNTP各10 mmol/L） 1 μL、 Expand HiFi Enzyme Blend（5 U/μL）0.5 μL，補(bǔ)充MilliQ水至50 μL。 PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.2 目的片段的回收和連接

PCR產(chǎn)物先用QIAGEN PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒純化，再用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，最后用QIAGEN PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。質(zhì)粒pQE30用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下含酶切載體片段的凝膠，用QIAquick 凝膠提取試劑盒純化載體片段，并用去磷酸化試劑盒進(jìn)行去磷酸化。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

用Mighty DNA 克隆試劑盒將酶切后的PCR產(chǎn)物與酶切并去磷酸化的質(zhì)粒載體片斷進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli JM109。挑選青霉素抗性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)過夜，并用QIAGEN 質(zhì)粒純化試劑盒純化質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ酶切質(zhì)粒后，通過瓊脂糖凝膠電泳比較酶切片段長度，鑒定是否有插入子。

1.2.4 重組質(zhì)粒測序

用CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit對(duì)重組質(zhì)粒的插入序列進(jìn)行測序反應(yīng)。采用PQE30的啟動(dòng)子區(qū)引物和反向測序引物分別進(jìn)行正向和反向測序反應(yīng)，并用 Beckman-Coulter CEQ 2000 DNA 分析系統(tǒng)（貝克曼庫爾特有限公司）進(jìn)行測序分析。

1.3 重組大米α-球蛋白的表達(dá)及重組蛋白的金屬親和層析純化

將經(jīng)過測序確定的含有正確基因編碼序列質(zhì)粒的重組大腸桿菌進(jìn)行小規(guī)模液體培養(yǎng)和誘導(dǎo)，確認(rèn)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。將已經(jīng)確認(rèn)表達(dá)重組蛋白的克隆接種于含青霉素50 μg/mL的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)過夜。次日，用含青霉素50 μg/mL的LB培養(yǎng)基把過夜培養(yǎng)液稀釋50倍，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)。當(dāng)D600 nm達(dá)到0.6時(shí)，添加IPTG至1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 ℃、6 000 g 離心20 min。將離心得到的大腸桿菌沉淀保存在 -80 ℃ 低溫冰箱中。

按照QIAGEN公司的試劑盒使用說明，用Ni-NTA Superflow Cartridge在變性條件下從大腸桿菌中對(duì)重組大米α-球蛋白進(jìn)行分離和純化。隨后，向純化得到的重組蛋白質(zhì)溶液中緩緩添加等體積的TBS（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，pH值8.0）并混勻，于 4 ℃ 放置2 h后，用Amicon Ultra超濾離心管（10 ku，Millipore）離心濃縮，并將溶液濃縮到TBS添加前的體積；然后再向蛋白質(zhì)溶液中添加等體積的TBS，于4 ℃放置2 h后再進(jìn)行離心濃縮；如此重復(fù)進(jìn)行溶液置換8次，降低純化的重組蛋白中的尿素濃度，最后，通過進(jìn)一步離心濃縮，使溶液中重組蛋白質(zhì)的濃度達(dá)到1 mg/mL左右。

1.4 抗大米α-球蛋白抗體的制備

準(zhǔn)備2只新西蘭白兔，將重組α-球蛋白溶液與弗氏完全佐劑充分混勻，進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，初次免疫時(shí)每只白兔注射約1 mg的重組蛋白。初次免疫后每隔2周進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫3次。加強(qiáng)免疫時(shí)，給每只白兔注射與弗氏不完全佐劑充分混勻的0.5 mg重組大米α-球蛋白。最后一次加強(qiáng)免疫4周后，取兔全血，并分離血清。

1.5 抗血清效價(jià)的ELISA 測定

以含有重組大米α-球蛋白（10 μg/m L）的包被液 100 μL，包被酶標(biāo)板于4 ℃過夜。次日，用PBST溶液（0.01 mol/L PBS，pH值=7.4，0.1% Tween 20）洗板3次，每孔加入3%牛血清白蛋白-PBS溶液200 μL，于37 ℃保溫 1 h，用PBST溶液洗板3次后，加入100 μL不同稀釋度的抗血清，對(duì)照組用稀釋相應(yīng)倍數(shù)的陰性血清，于37 ℃保溫1 h，再用PBST溶液洗板3次，加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG （1 ∶[KG-*3]6 000）溶液，于37 ℃保溫1 h，用PBST溶液洗板3次后，加入100 μL新鮮配制的TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng) 10 min，加入100 μL 1 mol/L磷酸溶液，并在450 nm下測定吸光度。

1.6 大米蛋白質(zhì)的提取

將大米樣品分別用實(shí)驗(yàn)室碾磨機(jī)IFM-800DG（日本巖谷株式會(huì)社）碾磨成粉末，稱取100 mg 米粉分別加入裝有Lysing Matrix D的裂解管中，加入含有30 mmol/L Tris-HCl （pH值8.0）、1 mol/L NaCl和 Complete Mini的溶液 1 mL，充分混勻后，在冰水浴中放置1 h。隨后，將裂解管放置在 FastPrep System FP100A（MP Biomedicals）中，在設(shè)置速度為 6.0 m/s 的條件下振蕩提取40 s。4 ℃、15 000 g離心10 min，收集上清液，分裝后，于-80 ℃冷凍保存。

1.7 蛋白質(zhì)濃度的測定

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用Quick Start Bradford Protein Assay Kit 對(duì)大米蛋白提取液中的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定。

1.8 用抗血清對(duì)大米α-球蛋白進(jìn)行Western Blotting 檢測

將提取的大米蛋白質(zhì)用SDS-PAGE （4%濃縮膠，15%分離膠）電泳分離后，在1×轉(zhuǎn)膜緩沖溶液（25 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0，200 mmol/L 甘氨酸，20% 甲醇）中用TransBlot Semi-Dry Transfer Cell（伯樂公司）將蛋白質(zhì)條帶從凝膠中轉(zhuǎn)到PVDF膜上，并用5%的脫脂奶粉-TTBS（20 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，140 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween 20）溶液在4 ℃封閉PVDF膜過夜。次日，將封閉的PVDF膜用TBS（20 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，140 mmol/L NaCl）漂洗3次后，室溫下與用Can Get Signal Solution 1稀釋 12 000倍的抗血清結(jié)合1 h。再用TTBS振蕩洗滌3次，每次5 min。隨后，室溫下與用Can Get Signal Solution 2稀釋6 000倍的HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG（H+L）結(jié)合1 h，再用TTBS振蕩洗滌3次，每次5 min。室溫下與ECL Prime化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)5 min，用ATTO發(fā)光攝影裝置AE-6981檢測化學(xué)發(fā)光信號(hào)。

1.9 大米α-球蛋白的 Sandwich ELISA檢測

用 HiTrap Protein A HP從抗大米α-球蛋白抗血清中純化抗體。將用于檢測的抗體用Perioxidase Labeling Kit-NH2進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記。采用IMMUNO-TEK Construction System，用抗大米α-球蛋白抗體（10 μg/mL）對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行包被，并對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行封閉。Sandwich ELISA檢測前，向每孔加200 μL PBS，用封板膜封板后，放置在4 ℃過夜。次日，吸除PBS，加入用PBS稀釋成一定濃度梯度的重組大米α-球蛋白溶液或者待測大米蛋白質(zhì)提取液，并使每孔溶液體積為100 μL，室溫反應(yīng)1h后，棄蛋白質(zhì)溶液，用PBST洗板3次，加入100 μL 1 ∶[KG-*3]2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗大米α-球蛋白抗體，室溫反應(yīng)1 h。用 PBST洗板3次后，加入 TMB （A ∶[KG-*3]B=9 ∶[KG-*3]1）顯色液100 μL，室溫避光反應(yīng)20 min后，加入100 μL 1 mol/L 磷酸溶液，并在450 nm 測定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 大米α-球蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

用PCR擴(kuò)增的編碼大米α-球蛋白的DNA片段經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ 雙酶切后，與雙酶切并且脫磷酸化的質(zhì)粒pQE30載體片段連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從過夜培養(yǎng)的青霉素平板上挑取6個(gè)菌落，接種于含50 μg/mL 青霉素的LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，純化質(zhì)粒，通過用BamHⅠ酶切質(zhì)粒后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，初步確定質(zhì)粒中有無插入子。從圖1可以看出，在挑選的6個(gè)克隆中有5個(gè)克隆所含質(zhì)粒的長度比載體質(zhì)粒大，表明有插入序列，然后通過測序分析，發(fā)現(xiàn)在這5個(gè)質(zhì)粒中的插入子都具有與編碼大米α-球蛋白基因相一致的序列并且以正確的方向插入到載體中。

在BamHⅠ酶切后的重組質(zhì)粒中，有5個(gè)（泳道1、2、4、5、6）質(zhì)粒片段的長度大于酶切的載體質(zhì)粒（泳道7），表明這5個(gè)重組質(zhì)粒中含有插入子。

2.2 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

在用IPTG誘導(dǎo)2 h 后，重組大米α-球蛋白在來自2個(gè)重組大腸桿菌菌落的菌體中均已有了顯著的表達(dá)（圖2），為了獲得更多的重組蛋白，在用IPTG誘導(dǎo)4 h 后進(jìn)行菌體收集。在變性的條件下，用Ni-NTA Superflow Cartridge對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化，因?yàn)橹亟M大米α-球蛋白的表達(dá)水平較高，而且與金屬親和層析凝膠有較強(qiáng)的結(jié)合力，所以，在pH值=4.5的洗脫液中，重組大米α-球蛋白被純化為主要的蛋白質(zhì)組分（圖3）。隨后，通過溶液置換和離心濃縮，使重組蛋白質(zhì)溶液中尿素的濃度降低至0.03 mol/L。雖然在溶液置換過程中，有部分的重組蛋白沉淀出來，但是，仍然回收到了可溶性的重組蛋白組分。

在IPTG誘導(dǎo)后，重組大米α-球蛋白在挑選的2個(gè)克?。–olony 1 和Colony 2）中進(jìn)行了顯著表達(dá)。在IPTG 誘導(dǎo)前，重組大米α-球蛋白無明顯表達(dá)；當(dāng)IPTG 誘導(dǎo)2 h和4 h時(shí)，重組大米α-球蛋白均有顯著表達(dá)。

2.3 抗血清效價(jià)的ELISA檢測

抗血清效價(jià)的ELISA檢測結(jié)果見表1和表2。免疫前 （0周），2只白兔血清的免疫反應(yīng)都非常低，而且1號(hào)白兔血清的免疫反應(yīng)較2號(hào)白兔血清更低。免疫進(jìn)行到4周和6周時(shí)，2只白兔抗血清的抗體滴度均較前次采血樣品有顯著的提高。免疫進(jìn)行到7周時(shí)，2號(hào)白兔血清抗體滴度較6周時(shí)無明顯變化；而1號(hào)白兔血清抗體滴度較6周時(shí)又略有升高，最后，2只白兔血清的抗體滴度均高于1 ∶（1.25×105）。ELISA檢測結(jié)果顯示，2只白兔抗血清中的抗體對(duì)抗原都具有較強(qiáng)的免疫結(jié)合活性。因?yàn)?號(hào)白兔血清的抗體滴度略高于2號(hào)白兔血清的抗體滴度，所以，在后續(xù)的研究中，主要利用1號(hào)白兔血清的抗體進(jìn)行了檢測方法的建立和檢測分析。

2.4 大米α-球蛋白的Western Blotting 檢測

Western Blotting 結(jié)果（圖4-A、圖4-B）顯示，2只白兔的抗血清均與大米蛋白質(zhì)中分子量為26 ku的蛋白質(zhì)發(fā)生了特異性的免疫結(jié)合反應(yīng)，分子量26 ku正是所報(bào)道的大米α-球蛋白的分子量[16-17]，所以，以重組大米α-球蛋白免疫白兔制備的抗血清可以特異性地識(shí)別并結(jié)合大米α-球蛋白。而且，隨著大米蛋白質(zhì)上樣量的提高，檢測信號(hào)逐漸增強(qiáng)[JP3]（圖4-C）。因此，抗大米α-球蛋白抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合呈現(xiàn)一定的定量關(guān)系，表明此抗大米α-球蛋白抗體不僅可用于大米α-球蛋白的定性檢測，而且可用于目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量分析。

2.5 大米α-球蛋白的Sandwich ELISA檢測

利用從抗血清中純化的抗大米α-球蛋白抗體，采用 IMMUNO-TEK Construction System 構(gòu)建了大米α-球蛋白的Sandwich ELISA檢測體系。以重組蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，以在波長450 nm 處的吸光度為縱坐標(biāo)，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.019 7x+0.152 8，檢出限為0.526 ng/mL，在線性范圍為2.5～100 ng/mL的范圍內(nèi)，大米α-球蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999，因此，具有較好的線性關(guān)系，從而保證了定量的準(zhǔn)確性。

利用此Sandwich ELISA檢測體系，對(duì)3種大米樣品中的α-球蛋白含量進(jìn)行了測定，3種大米的α-球蛋白含量見圖6。結(jié)果表明，3種大米樣品中，3號(hào)米中α-球蛋白的含量最高，2號(hào)米中α-球蛋白的含量次之，1號(hào)米中α-球蛋白的含量最低。所以，此Sandwich ELISA檢測體系可應(yīng)用于比較大米樣品之間α-球蛋白的含量，以及用于比較轉(zhuǎn)基因大米與其宿主大米品種之間α-球蛋白的表達(dá)水平。

3 結(jié)論

以pQE30為表達(dá)載體，在大腸桿菌E. coli JM109中實(shí)現(xiàn)了大米α-球蛋白的高效誘導(dǎo)表達(dá)。以重組大米α-球蛋白為抗原免疫白兔制備出了抗大米α-球蛋白的多克隆抗體。利用此抗體對(duì)大米中的α-球蛋白進(jìn)行了Western Blotting檢測，該抗體能夠特異性地與大米α-球蛋白進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，而且，抗大米α-球蛋白抗體與大米α-球蛋白的結(jié)合呈現(xiàn)一定的定量關(guān)系。另外，利用此抗體構(gòu)建了大米α-球蛋白的Sandwich ELISA檢測體系，并利用此檢測體系測定出了3種大米樣品中α-球蛋白的含量。因此，利用抗大米α-球蛋白抗體建立起的Western Blotting和Sandwich ELISA檢測方法可以應(yīng)用于大米α-球蛋白的定性檢測和大米樣品間α-球蛋白含量的比較分析。

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