高全清，沙馬阿直

1.核工業(yè)416醫(yī)院心內科 (成都610051),2.解放軍第5醫(yī)院心內科(銀川750004)

紅景天苷改善血管內皮舒縮功能實驗研究

高全清1，沙馬阿直2

1.核工業(yè)416醫(yī)院心內科 (成都610051),2.解放軍第5醫(yī)院心內科(銀川750004)

目的：研究低氧環(huán)境下紅景天苷對血管內皮細胞舒縮功能的影響及其機制。 方法：空白對照組內皮細胞暴露正常氧環(huán)境，低氧組、低氧和紅景天苷干預組血管內皮細胞暴露于低氧環(huán)境，檢測血管內皮細胞HIF-1α、內皮素-1、血管內皮NO合成酶基因的表達變化。同時檢測采用siRNA干擾HIF-1α后內皮舒縮因子表達變化。 結果：與空白對照組比較，低氧組血管內皮細胞HIF-1α、內皮素-1表達顯著增加(P<0.05)，而血管內皮NO合成酶表達下降(P<0.05)；與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預組血管內皮細胞內皮細胞HIF-1α、內皮素-1表達受抑制(P<0.05)，而血管內皮NO合成酶表達增加(P<0.05)。siRNA干擾HIF-1α顯示，紅景天苷通過調控HIF-1α調節(jié)內皮細胞舒縮功能(P<0.05)。結論：紅景天苷通過抑制HIF-1α基因表達，抑制血管內皮收縮因子表達及促進血管內皮舒張因子表達，從而改善血管內皮舒縮功能。

缺氧性肺動脈高壓的主要病理機制是缺氧性肺血管收縮及肺循環(huán)重塑。血管內皮細胞對血管舒縮功能發(fā)揮著重要作用[1]。內皮素(Endothelin,ET)是一種多效性內皮依賴性縮血管因子，內皮素有3個同分異構體家族,即ET-1、ET-2、ET-3，其中對于心血管起主要作用的是ET-1。內皮細胞受到腎上腺素、血栓素、血管加壓素、血管緊張素以及血管壁剪切力與壓力的變化及缺氧等物理化因素刺激后合成并釋放ET-1[2]。同時缺氧抑制血管內皮舒張因子NO合成酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)表達[3]。缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)是具有轉錄活性的核蛋白,參與缺氧適應、炎癥發(fā)展及腫瘤生長等相關基因的調控。HIF-1α與靶基因結合后,通過轉錄和轉錄后調控使機體產生一系列反應, HIF-1α過度表達會給機體帶來病理性損害,如低氧性肺動脈高壓、腫瘤加速生長等[4]。

紅景天為多年生草本植物，主要生長在海拔1600～4000 m的高寒、干燥、缺氧、強紫外線照射、晝夜溫差大的地區(qū)，具有極強的環(huán)境適應能力和生命力，紅景天被廣泛運用于高原反應的預防和治療。紅景天苷是從景天科植物大株紅景天的干燥根及根莖或干燥全草中提取的一種化合物，是紅景天的主要有效成分。研究顯示,紅景天苷有預防腫瘤、增強免疫功能、延緩衰老、抗疲勞、抗缺氧、防輻射、雙向調節(jié)中樞神經、修復保護機體等作用[5-6]。本研究觀察缺氧環(huán)境中紅景天苷對血管內皮細胞舒縮功能相關因子的影響，探討紅景天苷治療高原性肺動脈高壓的具體機制。

材料和方法

1 實驗材料 內皮細胞株HUVEC(購自于中國AllCells公司)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液中。紅景天苷(購買于美國Sigma公司)用無血清DMEM細胞培養(yǎng)液制成300 mmol/L試劑?？俁NA提取試劑、RNAiso Reagent、Prime Script RT試劑盒、SYBR-PCR試劑盒(Takara，日本)， Western blot試劑購自Beyotime生物技術研究所(中國)。

2 方 法

2.1 實驗設計：將內皮細胞分為空白對照組、低氧組、低氧及紅景天組，空白對照組內皮細胞于常氧狀態(tài)(氧含量21%)下培養(yǎng)，低氧干預組、低氧和紅景天苷共同干預組內皮細胞置于低氧環(huán)境(氧含量10%)下培養(yǎng)，其中低氧和紅景天苷共同干預組內皮細胞中加入終濃度為300μmol/L的紅景天苷。

2.2 內皮細胞舒縮功能相關基因mRNA表達變化：空白對照組、低氧干預組、低氧和紅景天苷共同干預組內皮細胞培養(yǎng)24h后，采用熒光定量PCR檢測HIF-1α、ET-1、eNOS基因mRNA表達變化。

2.3 Western blotting檢測內皮細胞舒縮功能相關基因蛋白表達變化：空白對照組、低氧干預組、低氧和紅景天苷共同干預組內皮細胞培養(yǎng)48 h后，分別提取內皮細胞總蛋白。使用兔抗HIF-1α、ET-1、eNOS的特異性抗體(Abcam公司，美國) ，羊抗兔二抗(Abcam公司，美國)對提取蛋白樣品進行Western免疫印跡分析(12%SDS-PAGE；每泳道30μg蛋白)。應用增強化學發(fā)光法檢測蛋白質條帶灰度值變化。

2.4 siRNA干擾HIF-1α實驗：低氧干預組、低氧和紅景天苷共同干預組、低氧和siRNA HIF-1α 共同干預組置于低氧環(huán)境中培養(yǎng)96h。之后分別提取總蛋白，Western blotting法檢測HIF-1α、ET-1、eNOS基因蛋白表達變化。

結 果

1 紅景天苷對內皮細胞舒縮功能相關基因mRNA表達的影響 與空白對照組比較，低氧組內皮細胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表達增強(P<0.05)，而縮血管相關因子eNOS基因mRNA表達下降(P<0.05)；與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預組內皮細胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表達受抑制(P<0.05)，而縮血管相關因子eNOS基因mRNA表達增強(P<0.05)(圖1)。

圖1 紅景天苷對內皮細胞舒縮功能相關基因mRNA表達影響

2 紅景天苷對內皮細胞舒縮功能相關基因蛋白表達的影響 與空白對照組比較，低氧組內皮細胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達增強(P<0.05)，而縮血管相關因子eNOS基因蛋白表達下降(P<0.05)；與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預組內皮細胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達受抑制(P<0.05)，而縮血管相關因子eNOS基因蛋白表達增強(P<0.05)(圖2)。

圖2 紅景天苷對內皮細胞舒縮功能相關基因蛋白表達影響

3 缺氧誘導因子-1α參與紅景天苷對內皮細胞舒縮功能的調控 與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預組和低氧及siRNA HIF-1α干擾組的內皮細胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達均受到抑制(P<0.05)，而縮血管相關因子eNOS基因mRNA表達均增強(P<0.05)(圖3)。

圖3 缺氧誘導因子-1α與紅景天苷對內皮細胞舒縮功能調控

缺氧性肺動脈高壓(HPH)是一種慢性缺氧所致疾病，最終會導致右心衰竭。缺氧性肺動脈高壓是一個復雜的病理生理過程，包括一系列相互關聯(lián)的事件，與血管平滑肌細胞增殖引起肺動脈血管重塑，肺部炎癥致白細胞粘附和聚集，血管內皮細胞舒縮功能障礙等有關[7]。

紅景天是目前預防高原慢性缺氧所致高原反應的常用藥物，研究表明紅景天能有效降低低氧對機體心血管系統(tǒng)功能的影響[8]。紅景天苷是紅景天的主要有效成分。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能明顯改善低氧誘導的血管內皮細胞舒縮功能障礙。與常氧環(huán)境比較，暴露于低氧環(huán)境時，低氧組內皮細胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表達增強，而縮血管相關因子eNOS基因mRNA表達下降；與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預組內皮細胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表達受抑制，而縮血管相關因子eNOS基因mRNA表達增強。我們進一步檢測了血管內皮細胞舒縮功能相關基因蛋白表達變化。研究顯示，與常氧環(huán)境比較，暴露于低氧環(huán)境時，低氧組內皮細胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達增強，而縮血管相關因子eNOS基因蛋白表達下降；與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預組內皮細胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達受抑制，而縮血管相關因子eNOS基因蛋白表達增強。這提示缺氧會導致血管內皮細胞舒張相關基因表達受抑制，血管內皮細胞收縮相關基因表達增強；而紅景天苷可明顯改善缺氧所致血管內皮細胞舒縮功能。

HIF-1α 的表達依賴O2水平，在常氧狀態(tài)下HIF-1α 表達水平降低，在缺氧條件下，HIF-1α蛋白表達顯著增加，并調控缺氧適應相關下游靶基因[4]。我們進一步檢測了HIF-1α基因在紅景天苷改善缺氧所致血管內皮細胞舒縮功能中的作用。與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預組和低氧及siRNA HIF-1α干擾組的內皮細胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達均受到抑制，而縮血管相關因子eNOS基因mRNA表達均增強。 這提示紅景天苷通過抑制HIF-1α基因表達，從而改善缺氧所致血管內皮細胞舒縮功能障礙。

綜上所述，紅景天苷通過抑制HIF-1α基因表達，抑制血管內皮收縮因子表達及促進血管內皮舒張因子表達，從而改善血管內皮舒縮功能。

[1] Naeije R, Manes A. The right ventricle in pulmonary arterial hypertension[J]. Eur Respir Rev,2014,23:476-87.

[2] 韓 磊, 李鳴皋, 馬貴喜, 等.缺氧條件下血管緊張素-2對血管內皮細胞內皮素分泌的影響及茶多酚的保護作用[J]. 陜西醫(yī)學雜志, 2005,34 (11):1342-1344 .

[3] Huang CC, Lai CJ, Tsai MH,etal. Effects of melatonin on the nitric oxide system and protein nitration in the hypobaric hypoxic rat hippocampus[J]. BMC Neurosci, 2015,16:61.

[4] 馮 娜, 彭興春, 賀細菊, 等. 低氧濃度改變對神經干細胞增殖分化及HIF-1α表達的影響[J] . 陜西醫(yī)學雜志, 2012, 41(5): 515-518.

[5] 劉新宏，何桂英，姚曉偉，等．圣地紅景天膠囊治療心絞痛30例[J]. 陜西中醫(yī),1999,20(1): 8-9.

[6] Calcabrini C, De Bellis R, Mancini U,etal. Rhodiola rosea ability to enrich cellular antioxidant defences of cultured human keratinocytes[J]. Arch Dermatol Res, 2010, 302(3):191-200.

[7] Sylvester JT, Shimoda LA, Aaronson PI,etal. Hypoxic pulmonary vasoconstriction[J]. Physiol Rev, 2012, 92:367-520.

[8] 杜颯英, 繆士平, 王克勤. 紅景天治療急性高原反應的臨床療效分析[J]. 西南國防醫(yī)藥，2004,14(6):615-616.

(收稿：2015-12-05)

Salidroside improve the contraction and dilatation function of vascular endotheliocyte

Gao Quanqing,Sha Maazhi

Department of Cardiology, 416 Hospital of Nuclear Industry (Chengdu 610051)

Objective: To evaluate the effect of the hypoxia environment and salidroside on the function of vascular endothelial cells. Methods: The blank control group exposed to the normal oxygen environment, hypoxia group, hypoxia and the intervention group vascular endothelial cells exposed to hypoxia environment, detection the gene expression changes of HIF-1α, endothelin -1, vascular endothelial NO synthase in vascular endothelial cells . The expression of HIF-1α, endothelin -1, vascular endothelial NO synthase was detected by siRNA interference. Results:Compared with the blank control group, the expression of HIF-1α and endothelin -1 were significantly increased in vascular endothelial cells in hypoxia group, while vascular endothelial NO synthase expression was decreased. SiRNA interference HIF-1α experiments showed that salidroside improve the function of endothelial cell by regulating HIF-1α. Conclusion: These findings imply that salidroside improvs the function of endothelial cell by regulating, through regulation the expression of ET-1 , eNOS via a HIF-1α-dependent pathway.

Pulmonary hypertension/physiopathology Rhodioloside/pharmacology Hypoxia-inducible Factor- 1α/analysis Endothelin -1/analysis eNOS

肺動脈高壓/病理生理學 紅景天苷/藥理學 缺氧誘導因子1，α亞單位/分析 內皮縮血管因子/分析 血管內皮縮張因子NO合成酶

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.009