劉仲凱,郝定均,賀寶榮,方向義,尹新華

西安交通大學附屬西安市紅會醫(yī)院脊柱外科矯形病區(qū)(西安710054)

抑制CR3并阻斷NF-κB通路改善軸突再生環(huán)境的實驗研究*

劉仲凱,郝定均?,賀寶榮,方向義,尹新華

西安交通大學附屬西安市紅會醫(yī)院脊柱外科矯形病區(qū)(西安710054)

目的：對抑制CR3并阻斷NF-κB通路改善軸突再生環(huán)境進行研究，為臨床治療提供參考。方法：將 C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、脊髓損傷模型組、脊髓損傷后椎扳切除術組、脊髓損傷后SN50治療組、脊髓損傷后SN50M治療組、脊髓損傷后注射XVA143組和脊髓損傷后硼替佐米治療組七組各10只，檢測并分析各組小鼠體內(nèi)CR3、NF-κB因子及MEK/ERK通路蛋白表達變化。結(jié)果：與對照組相比，脊髓損傷小鼠血清中CR3、CR1、NF-κB、TGF-β和VEGF、IL-1β、IL-2、IL-6、MEK、ERK、Ras和Raf蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而經(jīng)藥物治療后上述異常表達的蛋白得到明顯的恢復(P<0.05)。結(jié)論：脊髓損傷小鼠存在明顯的CR3和NF-κB通路異常，藥物能夠通過抑制上述通路改善軸突再生環(huán)境。

Kwy words Spinal cord injuries/physiopathology Axons Nerve regeneration Inflammation Interleukins @MEK/ERK pathway Receptors,complement

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)其救治和截癱功能康復是神經(jīng)科學研究中的世界性難題[1-2]。伴隨SCI的炎癥反應產(chǎn)生顯著的神經(jīng)病理問題，也是影響功能恢復的重要因素[3]。補體受體-3(CR3)可能對髓磷脂激活NF-κB信號傳導通路及髓磷脂誘導的炎癥反應有重要作用[4]。CR3拮抗劑XVA143已經(jīng)用于小鼠牙周炎的模型及其他阻斷CR3功能、抑制體內(nèi)炎癥的動物模型，有望用于炎性疾病如脊髓損傷的潛在治療[5]。增強脊髓損傷中髓磷脂的清除，可能是去除髓磷脂抑制軸突的再生及解決脊髓損傷中炎癥反應問題的首要條件[6]。本研究對抑制CR3并阻斷NF-κB通路改善軸突再生環(huán)境進行研究，為臨床治療提供參考。

材料與方法

1 動物及分組 清潔級C57BL/6J小鼠購自上海斯萊克實驗動物中心，體重22～25 g，雌性不拘。所有動物實驗前均適應性飼養(yǎng)1周，維持(22±2)℃，55%±5%。所有動物實驗操作均符合實驗動物福利的相關要求。C57BL/6J小鼠隨機分為七組：對照組、脊髓損傷模型組、脊髓損傷后的椎扳切除術組、脊髓損傷后SN50治療組、脊髓損傷后SN50M治療組、脊髓損傷后注射XVA143組和脊髓損傷后硼替佐米治療組(n=10)。

2 試劑及來源 CR3蛋白檢測試劑盒購自Omega公司；CR1蛋白檢測試劑盒購自Amresco公司；NF-κB蛋白檢測試劑盒購自Abcam公司；TGF-β和VEGF蛋白檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；IL-1β蛋白檢測試劑盒購自Abcam公司；IL-2、IL-6蛋白檢測試劑盒購自Sigma公司；MEK蛋白檢測試劑盒購自R&D公司；ERK蛋白檢測試劑盒購自Snata Cruz公司；Ras和Raf蛋白檢測試劑盒購自Elab Sciences公司。

3 脊髓損傷小鼠模型復制 除對照組小鼠給予磷酸緩沖液注射外，其余各組小鼠給予注射髓磷脂(1μl)復制脊髓損傷模型小鼠。各組治療組小鼠按如下方法進行治療：脊髓損傷后SN50組小鼠在脊髓損傷之后立即注射SN50(20 μg/kg加入到 0.5 μl PBS)到打擊的中心和邊緣(0.5μl/單位)，然后用微量灌流泵將既定濃度的SN50以6 μg/(kg·h)持續(xù)硬膜下給藥到術后4周；脊髓損傷后SN50M治療組小鼠給予SN50M治療；脊髓損傷后硼替佐米治療組小鼠脊髓損傷后立即注射硼替佐米(1 mg/kg加入到0.5 μl PBS)到脊髓損傷的部位，然后持續(xù)給予硼替佐米(0.2mg/kg，每周2次)致術后4周；脊髓損傷后注射XVA143組小鼠脊髓損傷后立即注射XVA143(0.5 μl/單位)到損傷的中心和邊緣，然后通過微量灌流泵以持續(xù)硬膜下給予XVA143[1mM/(只·d) ]至術后4周。

4 觀察指標 本研究分析各組小鼠治療前后血清中炎癥因子CR-3、CR-1、NF-κB、TGFβ和VEGF水平變化，并檢測白細胞介素蛋白家族IL-1β、IL-2、IL-6水平變化，檢測ERK信號轉(zhuǎn)導通路關鍵蛋白MEK、ERK、Ras和Raf蛋白水平變化。

結(jié) 果

1 脊髓損傷小鼠血清中CR3蛋白變化及藥物干預作用分析 與對照組相比，脊髓損傷小鼠血清中CR3及CR1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而經(jīng)藥物治療后上述異常表達的蛋白得到明顯的恢復(P<0.05)，見表1。

表1 脊髓損傷小鼠血清CR3蛋白變化及藥物干預作用

2 脊髓損傷小鼠血清中NF-κB蛋白變化及藥物干預作用分析 與對照組相比，脊髓損傷小鼠血清中NF-κB、TGFβ和VEGF蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而經(jīng)藥物治療后上述異常表達的蛋白得到明顯的恢復(P<0.05)，見表2。

表2 脊髓損傷小鼠血清NF-κB蛋白變化及藥物干預作用

3 脊髓損傷小鼠血清中白細胞介素蛋白變化及藥物干預作用分析 與對照組相比，脊髓損傷小鼠血清中白細胞介素蛋白IL-1β、IL-2和IL-6表達水平明顯升高(P<0.05)，而經(jīng)藥物治療后上述異常表達的蛋白得到明顯的恢復(P<0.05)，見表3。

表3 脊髓損傷小鼠血清白細胞介素蛋白變化及藥物干預作用

4 脊髓損傷小鼠血清中MEK和ERK蛋白變化及藥物干預作用分析 與對照組相比，脊髓損傷小鼠血清中MEK和ERK蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而經(jīng)藥物治療后上述異常表達的蛋白得到明顯的恢復(P<0.05)，見表4。

表4 脊髓損傷小鼠血清MEK和ERK1/2蛋白變化及藥物干預作用

5 脊髓損傷小鼠血清中Ras和Raf蛋白變化及藥物干預作用分析 與對照組相比，脊髓損傷小鼠血清中Ras和Raf蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而經(jīng)藥物治療后上述異常表達的蛋白得到明顯的恢復(P<0.05)，見表5。

表5 脊髓損傷小鼠血清Ras和Raf蛋白變化及藥物干預作用

討 論

脊髓損傷是脊柱損傷的最嚴重的并發(fā)癥，且其發(fā)生率有逐年增高的趨勢。脊髓損傷后的病理學改變相當復雜，包括脊髓出血、神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞壞死、腫脹以及星形膠質(zhì)細胞(AS)反應性膠質(zhì)化等[7],臨床通常表現(xiàn)為損傷節(jié)段以下肢體的嚴重的功能障礙，給患者和家庭帶來沉重的負擔。脊髓損傷后的炎癥反應是引起脊髓繼發(fā)性損傷的重要因素。腫瘤壞死因子、白細胞介素1β、白細胞介素10、髓過氧化物酶等炎癥因子可刺激其他細胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，這些細胞因子還可作為內(nèi)皮細胞活化的信號，刺激細胞粘附分子的產(chǎn)生及白細胞-內(nèi)皮細胞粘附，誘導白細胞向損傷區(qū)浸潤[8]。伴隨脊髓損傷的炎癥反應產(chǎn)生顯著的神經(jīng)病理問題，影響患者的功能恢復。脊髓中浸潤的炎性細胞及固有膠質(zhì)細胞產(chǎn)生促炎介質(zhì)，引發(fā)了一系列病理級聯(lián)反應，導致了炎癥及神經(jīng)的損害。軸突對機械損傷和炎癥介質(zhì)毒性的極其敏感性由此可能致軸突脫髓鞘。在脊髓損傷中，脫髓鞘長期存在，變性的髓磷脂顯著抑制軸突的再生。除了能抑制神經(jīng)的再生，髓磷脂也有觸發(fā)額外的炎癥反應，導致組織的損傷。本研究在對抑制CR3并阻斷NF-κB通路改善軸突再生環(huán)境進行研究時發(fā)現(xiàn)與對照組相比，脊髓損傷小鼠血清中CR3、CR1、NF-κB、TGF-β和VEGF、IL-1β、IL-2、IL-6、MEK、ERK、Ras和Raf蛋白表達水平明顯升高，而經(jīng)藥物治療后上述異常表達的蛋白得到明顯的恢復。其中，血清TNF-β水平呈早期水腫樣表達增強[9]。因此，脊髓損傷小鼠存在明顯的CR3和NF-κB通路異常，藥物能夠通過抑制上述通路改善軸突再生環(huán)境。

NF-κB是細胞內(nèi)最常見的炎癥反應因子，其水平異常也與脊髓損傷及神經(jīng)系統(tǒng)異常密切相關[10-11]。在分析活血通督湯對脊髓缺血再灌注損傷NF-κB、VCAM-1表達作用的研究中發(fā)現(xiàn)活血通督湯能有效改抑制NF-κB、VCAM-1的表達，從而減輕炎性反應,以期達到減輕脊髓缺血再灌注損傷[12]。在分析番茄紅素影響NF-κB表達對脊髓損傷后大鼠神經(jīng)功能恢復作用的研究中也證實番茄紅素可以通過抑制NF-κB的表達降低急性脊髓損傷后的炎癥反應對組織的損傷，并促進大鼠神經(jīng)和運動功能恢復[13]。在研究不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內(nèi)NF-κB表達及血清炎性因子影響時也發(fā)現(xiàn)高劑量阿托伐他汀鈣能降低大鼠EAE的發(fā)病率及病情嚴重程度,可能與其抗炎及免疫調(diào)節(jié)機制有關[14]。在對慢病毒介導RNAi沉默大鼠脊髓神經(jīng)元NF-κB p65基因影響的研究中也發(fā)現(xiàn)構(gòu)建大鼠神經(jīng)元NF-κB p65基因的RNAi慢病毒載體，它可使大鼠脊髓神經(jīng)元NF-κB p65基因表達下調(diào)[15]。在分析神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓NF-κB、NR2B和iNOS的表達及意義時也證實CCI大鼠痛覺過敏的產(chǎn)生和維持可能與脊髓NF-κB和NR2B活化并上調(diào)iNOS表達水平有關[16]。以往的研究還發(fā)現(xiàn)BDNF很可通過上調(diào)Bcl-2的表達參與脊髓繼發(fā)性損傷[17]，而且雌激素能抑制EAE大鼠NF-κB和Rho激酶的表達，其對Rho激酶的抑制作用可能部分通過下調(diào)NF-κB的水平實現(xiàn)的[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)脊髓損傷小鼠血清中NF-κB蛋白表達水平明顯升高，而經(jīng)藥物治療后上述異常表達的蛋白得到明顯的恢復，表明脊髓損傷小鼠存在明顯的NF-κB通路異常，藥物能夠通過抑制上述通路改善軸突再生環(huán)境。

MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導通路參與了細胞外信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導的主要過程，也是脊髓功能維系及損傷的主要調(diào)控通路[19-20]。在研究CXCL12/CXCR4對大鼠少突膠質(zhì)前體細胞遷移的影響及調(diào)控時發(fā)現(xiàn)CXCL12/CXCR4能夠通過MEK1/2通路調(diào)控大鼠OPCs的遷移，為后續(xù)深入探討脊髓損傷治療方法提供實驗基礎[21]。在研究ERK1/2在實驗性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過程中的組織特異性作用中也發(fā)現(xiàn)ERK1/2的表達在EAE發(fā)病過程中存在組織特異性[22]。在分析MEK抑制劑對脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的影響時也證實MEK抑制劑能通過抑制星形膠質(zhì)細胞的增殖，下調(diào)GFAP及Vim的表達，減少膠質(zhì)瘢痕形成;同時可促進脊髓損傷后大鼠雙后肢行為學及神經(jīng)功能的恢復[23]。在研究MEK抑制劑抑制嗎啡依賴及戒斷大鼠脊髓神經(jīng)元NOS表達的研究中也發(fā)現(xiàn)MEK抑制劑能減輕嗎啡依賴及戒斷大鼠的戒斷癥狀和在脊髓水平抑制NOS的表達,表明ERK可能參與調(diào)控NOS的表達[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)脊髓損傷小鼠血清中MEK、ERK、Ras和Raf蛋白表達水平明顯升高，而經(jīng)藥物治療后上述異常表達的蛋白得到明顯的恢復，表明脊髓損傷小鼠存在明顯的NF-κB通路異常，藥物能夠通過抑制上述通路改善軸突再生環(huán)境。

因此，脊髓損傷小鼠存在明顯的CR3和NF-κB通路異常，藥物能夠通過抑制上述通路改善軸突再生環(huán)境。

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(收稿：2016-08-05)

The relationship research on CR3 and NF-κB pathway inhibition with the environmental improvement of axon regeneration

Liu Zhongkai, Hao Dingjun, He Baorong, et al.Department of Spinal Surgery,Honghui Hospital,Xi’an Jiaotong University School of Medicine(Xi’an 710054)

Objective: The present research aimed to explore the relationship on CR3 and NF-κB pathway inhibition with the environmental improvement of axon regeneration. Methods : Clean C57BL/6J mice were divided into 7 groups randomly. The Spinal cord injury mice were duplicated with the injections of myelin. The serum inflammatory factors of NF-κB and MEK/ERK pathway related proteins were assayed. Results The results showed that the serum CR3, CR1, NF-κB, TGF-β, VEGF, IL-1β, IL-2, IL-6, MEK, ERK, Ras and Raf concentration were increased greatly in spinal cord injury mice when compared with control (P<0.05). At the meaning time, these parameters were normalized greatly after the medication of drugs (P<0.05). Conclusion: Abnormal NF-κB and CR3 signaling pathway are involved in the pathogenesis of spinal cord injury in mice and drugs can alleviate the injury by inhibiting the aforementioned pathway.

*陜西省自然科學基金資助項目(2012JM4046)

脊髓損傷/病理生理學 軸突 神經(jīng)再生 炎癥/病理生理學 白細胞介素類 @MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導通路 受體，補體

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.003

?通訊作者