王 蕾，張 芳，湯仁仙，張冠群，牛海晨

大鼠腦組織高爾基染色三種制備方法的比較

王 蕾1，張 芳1，湯仁仙1，張冠群2，牛海晨3

腦組織；高爾基染色法；冷凍切片；振動(dòng)切片；石蠟切片

1873年意大利著名的神經(jīng)解剖學(xué)家卡米洛·高爾基發(fā)明硝酸銀染色法，從此可以定性定量地觀察神經(jīng)元的形態(tài)［1］。隨后 Cox等［2－4］對(duì)高爾基染色法的固定液和染色液進(jìn)行改良，提高結(jié)果的可視性，但初學(xué)者選擇合適的染色方法仍較為困難。本實(shí)驗(yàn)采用相同的固定、染色和顯色液，采用不同的制作方法（冷凍切片、石蠟切片、振動(dòng)切片）進(jìn)行大鼠腦組織高爾基染色，比較三種制作方法各自的優(yōu)缺點(diǎn)，為科研實(shí)驗(yàn)和制作典型的教學(xué)示教切片提供可選方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SD大鼠 3只，體重220～240 g，實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 取材首先SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛（國(guó)藥30037516）腹腔注射進(jìn)行常規(guī)麻醉；然后用生理鹽水灌注，去除血液直至澄清；再立刻斷頭，小心取出3個(gè)腦組織，將腦組織根據(jù)所需部位，冠狀切面修成0.5 cm厚的組織塊。

1.3 固定本實(shí)驗(yàn)所采用的固定液、染色液和顯色液均來(lái)自 Genmed的高爾基快速染色試劑盒。將修好的組織塊立刻放入裝有10 m L固定液 A和10 m L固定液 B的混合液離心管中，室溫下避光浸泡、孵育2周。

1.4 制作方法（1）石蠟切片：將固定好的腦組織取出，用去離子水漂洗2次，放入裝有 70%乙醇溶液的離心管中，依次梯度乙醇脫水，70%乙醇 24 h，80%乙醇溶液8 h，95%乙醇溶液Ⅰ6 h，95%乙醇溶液Ⅱ5 h，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2 h，用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各 15 min透明［5］。用蜂蠟和石蠟以 1∶9比例的混合蠟浸蠟、包埋后用普通石蠟切片機(jī)冠狀切片，切片厚度分別為20、40、60μm，漂片、攤片和烤片后，置于二甲苯脫蠟，梯度乙醇補(bǔ)水至去離子水，用濾紙吸干多余水分后，等待染色。（2）冷凍切片：2周后將組織塊取出，用去離子水漂洗2次，放入裝有30%的蔗糖溶液的離心管中，在4℃冰箱里浸泡孵育，直至組織塊沉到離心管底，將組織取出。用去離子水稍加沖洗后，滴加包埋劑OTC適量于腦組織周?chē)?，待稍冷凍后進(jìn)行冠狀切片，切片厚度分別為60、80、100μm，將切好的腦片小心貼在事先掛好膠的明膠玻片上。將貼好的玻片用去離子水漂洗3次，每次5 min。用濾紙吸干多余水分后，等待染色。（3）振蕩切片：將腦組織從固定液中取出，用去離子水漂洗2次后振蕩切片，切片厚200μm，將切好的腦片收集在裝有70%乙醇溶液的離心管中，用毛筆將所需部位的腦片撈出，小心貼在事先掛好膠的明膠玻片上，用濾紙吸干多余的70%乙醇溶液后，將貼好的玻片用去離子水漂洗3次，每次5 min。用濾紙吸干多余水分，等待染色。

1.5染色和封片在50 mL棕色滴瓶加入 10 mL去離子水，然后加入5 mL顯色液 A和顯色液 B，混勻，標(biāo)記為顯色工作液（有效期限 10天），然后進(jìn)行以下操作，整個(gè)染色過(guò)程應(yīng)避免光照：每塊腦片小心滴加500μL顯色工作液，鋪滿(mǎn)整個(gè)切片樣本表面，室溫下孵育30 min，小心用濾紙吸去切片上的染色液，將切片置入去離子水中孵育1 min，用濾紙吸去切片上的去離子水，每塊腦片滴加500μL顯色工作液，鋪滿(mǎn)整個(gè)切片樣本表面，室溫下孵育10～30 min，期間可在顯微鏡下觀察，直至組織呈現(xiàn)黑色，即刻中止，避免光照。用濾紙吸去切片上的顯色工作液，將切片置入去離子水中孵育1 min，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

2 結(jié)果

在光學(xué)顯微鏡下觀察三種制片方法各自的染色結(jié)果并拍照。（1）石蠟切片：厚度分別為20、40、60μm，神經(jīng)元數(shù)量依次增加，背景干凈呈淡黃色，神經(jīng)細(xì)胞的胞體及樹(shù)突、軸突皆呈黑色或黑紅色。大鼠大腦皮質(zhì)6層結(jié)構(gòu)層次顯示不夠清晰，錐體細(xì)胞主樹(shù)突顯示逐漸完整，樹(shù)突數(shù)量逐漸增多，軸突逐漸顯現(xiàn)，可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖1）。（2）冷凍切片：厚度分別為60、80、100μm，神經(jīng)元數(shù)量依次增加，背景干凈呈淺黃色，神經(jīng)細(xì)胞的胞體及樹(shù)突、軸突皆呈黑色或黑紅色。大鼠大腦皮質(zhì)6層結(jié)構(gòu)逐漸清晰明顯，錐體細(xì)胞主樹(shù)突、樹(shù)突和軸突逐漸顯示完整，星形膠質(zhì)細(xì)胞也漸漸顯示完整（圖2）。（3）振蕩切片：厚度分別為200、1 000μm，神經(jīng)元數(shù)量豐富，背景干凈呈黃色，神經(jīng)細(xì)胞的胞體及樹(shù)突、軸突皆呈黑色或黑紅色。大鼠大腦皮質(zhì)6層結(jié)構(gòu)清晰明顯，錐體細(xì)胞主樹(shù)突、樹(shù)突和軸突顯示完整，樹(shù)突棘豐富，星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示完整（圖3）。

圖1 石蠟切片不同厚度的放大效果：A.20 μm；B.40μm；C.60μm

圖2 冷凍切片不同厚度的放大效果：A.20 μm；B.40μm；C.60μm

圖3 振蕩切片不同厚度的放大效果：A. 200μm；B.1 000μm

3 討論

神經(jīng)組織由神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，神經(jīng)細(xì)胞也稱(chēng)為神經(jīng)元［6］。大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元都是多極神經(jīng)元，根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)可分為錐體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和梭形細(xì)胞三大類(lèi)。（1）錐體細(xì)胞：數(shù)量較多，可分為大、中、小三型。胞體形似錐形，尖端發(fā)出一條較粗的頂樹(shù)突，伸向皮質(zhì)表面，沿途發(fā)出許多小分支，胞體還向四周發(fā)出一些水平走向的樹(shù)突，軸突自胞體底部發(fā)出，長(zhǎng)短不一，短的不超出所在的皮質(zhì)，長(zhǎng)的離開(kāi)皮質(zhì)進(jìn)入白質(zhì)，組成投射纖維和聯(lián)合纖維。（2）梭形細(xì)胞：數(shù)量較少，大小不一，胞體為梭形，樹(shù)突自胞體的上下兩端發(fā)出，上端樹(shù)突多伸達(dá)皮質(zhì)表面。軸突從下端樹(shù)突的主干發(fā)出，其終末分支可與錐體細(xì)胞形成突觸。（3）顆粒細(xì)胞：數(shù)量最多，胞體較小，成顆粒狀。它們的軸突通常較短，終止于附近的錐體細(xì)胞或梭形細(xì)胞［7］。

大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元分布，除個(gè)別區(qū)域外，一般從表面至深層依次可分為6層。（1）分子層：神經(jīng)元小而少，主要由水平細(xì)胞和星形細(xì)胞構(gòu)成，還有許多與皮質(zhì)表面平行的神經(jīng)纖維；（2）外顆粒層：主要由許多星形細(xì)胞和少量小型錐體細(xì)胞構(gòu)成；（3）外錐體細(xì)胞層：較厚，由許多中、小型錐體細(xì)胞和星形細(xì)胞組成；（4）內(nèi)顆粒層：細(xì)胞排列緊密、多數(shù)是星形細(xì)胞；（5）內(nèi)錐體細(xì)胞層：主要由中型和大型錐體細(xì)胞組成；（6）多形細(xì)胞層：以梭形細(xì)胞為主，還有錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞［7］。

無(wú)論是進(jìn)行科研試驗(yàn)還是制作典型的教學(xué)示教切片，觀察大腦皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞及其突起、大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的分層，我們最常用到高爾基染色法。近年來(lái)，高爾基染色法最常用的制作方法主要有石蠟［5，8］、冷凍［9］和振蕩［10－11］。筆者對(duì)這三種方法進(jìn)行比較，得出以下幾點(diǎn)體會(huì)：（1）用振蕩方法制作的切片，顯示大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的分層效果最好，層次清晰，神經(jīng)元數(shù)量多，錐體細(xì)胞主樹(shù)突、樹(shù)突和軸突顯示完整，樹(shù)突棘豐富，星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示完整，且1 000μm的切片比200μm的切片層次更清晰。（2）用石蠟方法制作的切片，背景最干凈，但是受普通輪轉(zhuǎn)切片機(jī)最大切片厚度60μm的限制，大鼠大腦皮質(zhì) 6層結(jié)構(gòu)層次不能清晰顯示，錐體細(xì)胞的主樹(shù)突、軸突及樹(shù)突顯示不完整，樹(shù)突棘很難顯示。星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示不完整。（3）用冷凍方法制作的切片，與石蠟切片一樣，受冷凍切片機(jī)最大切片厚度100μm的限制，大鼠大腦皮質(zhì)6層結(jié)構(gòu)層次清晰度介于石蠟切片和振蕩切片之間，錐體細(xì)胞的主樹(shù)突、軸突及樹(shù)突顯示較完整，樹(shù)突棘稀疏；星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示較完整。（4）石蠟切片和冷凍切片要經(jīng)過(guò)脫水等過(guò)程，耗時(shí)較長(zhǎng)，程序相對(duì)振蕩，切片復(fù)雜，且不易切出完整的切片。（5）石蠟切片厚度經(jīng)常出現(xiàn)裂片，本實(shí)驗(yàn)采用熔點(diǎn)在52～54℃的石蠟和熔點(diǎn)在54℃的蜂蠟以 9∶1的比例混合，浸蠟、包埋，以增加切片的潤(rùn)滑和粘滯性，切片刀和組織塊的角度保持在10°以?xún)?nèi)，可減輕裂片的程度。大于10μm的石蠟切片切后易打卷，我們先把打卷的切片放在60℃溫水上，切片會(huì)很快展開(kāi)，接著撈出放入38℃溫水上，待蠟片伸展平整后，用事先掛好膠的明膠玻片撈出，解決切片打卷后漂不開(kāi)，浪費(fèi)所需部位組織的問(wèn)題。（6）冷凍切片也會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)裂片問(wèn)題，把凍臺(tái)溫度控制在－17℃，箱內(nèi)溫度控制在 －20℃，且腦組織涂上包埋劑 OTC后，稍?xún)鼋Y(jié)后開(kāi)始切片，能明顯改善裂片的問(wèn)題。（7）振蕩切片由于組織較厚，為了背景更加清晰，高爾基染色后可以延長(zhǎng)低濃度乙醇溶液的脫水時(shí)間，減少高濃度乙醇溶液的脫水時(shí)間，封片時(shí)由于切片較厚，需增加中性樹(shù)膠的量才能將腦組織封固，并且能減少蓋蓋玻片時(shí)腦組織開(kāi)裂。筆者認(rèn)為振蕩切片制作方法觀察大鼠大腦皮質(zhì)層次清晰，錐體細(xì)胞主樹(shù)突、樹(shù)突和軸突顯示完整，樹(shù)突棘豐富，星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示完整，且操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，組織裂片率低，振動(dòng)切片機(jī)屬于特殊的切片機(jī)，價(jià)格貴，有些實(shí)驗(yàn)室不一定有振動(dòng)切片機(jī)。

總而言之，高爾基染色法作為一種準(zhǔn)確、可靠的神經(jīng)組織染色，我們可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，根據(jù)科研或者教學(xué)的需要選擇不同的腦組織厚度，選擇合適的切片制作方法。

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R 44

：B

1001－7399（2017）01－0113－03

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.032

接受日期：2016－10－31

徐州醫(yī)學(xué)院2015年度院科研課題立項(xiàng)（2015Kj05）

1徐州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心、3遺傳學(xué)教研室，徐州 221004

2東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬徐州中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，徐州221009

王 蕾，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師。E-mail：wawa831214＠sina. com