黃述斌，侯永微，李松梅，王志強，徐 亮，王海平

乳腺癌組織及間質(zhì)浸潤淋巴細胞中PD-L1的表達及其意義

黃述斌，侯永微，李松梅，王志強，徐 亮，王海平

目的探討程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）在乳腺癌組織及間質(zhì)浸潤淋巴細胞（stromal tumor-infiltrating lymphocyte，sTIL）中的表達及其與臨床病理特征的關系。方法收集 68例乳腺非特殊性浸潤性癌，采用免疫組化EliVision兩步法檢測PD-L1蛋白表達，并分析其與免疫組化亞型及臨床病理特征的關系。結(jié)果乳腺腫瘤細胞中PD-L1總陽性率為35.3%，尤其在三陰型乳腺癌腫瘤細胞中的陽性率最高，在管腔型、HER-2過表達型及三陰型乳腺癌腫瘤細胞中的陽性率分別為16.1%、37.5%、61.9%，差異有統(tǒng)計學意義。PD-L1在 sTIL中的總陽性率為51.5%，且在三陰型乳腺癌中最高，陽性率為81.0%；PD-L1在管腔型、HER-2過表達型及三陰型乳腺癌 sTIL中的表達差異具有統(tǒng)計學意義。PD-L1在乳腺癌與sTIL中的表達呈正相關。結(jié)論PD-L1在三陰型乳腺癌中表達明顯高于其他類型乳腺癌，阻斷 PD-L1／PD-1信號通路，有望成為乳腺癌尤其是三陰型乳腺癌免疫治療的新策略。

乳腺腫瘤；免疫組化亞型；程序性死亡配體-1；免疫治療

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其基因表達譜分型對指導臨床治療非常重要，目前被廣泛使用的是用免疫組化替代基因譜分析進行分型，依據(jù)ER、PR、HER-2、CK5／6、EGFR以及Ki-67的表達，將其分為管腔A型、管腔B型、HER-2過表達型、基底細胞樣型和未分類型；其中基底細胞樣型和未分類型統(tǒng)稱為三陰型乳腺癌［1］。管腔型和 HER-2過表達型目前均有成熟的靶向治療藥物，但三陰型乳腺癌尚未有特異性的靶向藥物，采用常規(guī)化療不敏感；某些靶向藥物治療效果不佳的患者在后期缺乏有效的治療方案。因此，尋找乳腺癌尤其是三陰型乳腺癌的治療靶點是當務之急。

程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是負性共刺激分子 B7家族成員，其在肺癌、惡性黑色素瘤等腫瘤中表達水平較高，針對性的靶向藥物MPDL3280A在臨床試驗中有較好效果。國外文獻對乳腺癌中 PD-L1的表達已有相關報道，但國內(nèi)文獻報道較少。本文采用免疫組化EliVision兩步法檢測68例不同免疫組化亞型非特殊性乳腺浸潤性癌以及腫瘤間質(zhì)浸潤淋巴細胞（stromal tumor-infiltrating lymphocyte，sTIL）中 PD-L1的表達，分析其差異及與臨床病理特征的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料收集池州市人民醫(yī)院 2014年1月 ～2016年4月手術切除的有完整資料的 68例乳腺非特殊性浸潤性癌，術前均未接受輔助化療。所有病例均經(jīng)我院兩位高年資病理醫(yī)師確診并提取原有免疫組化結(jié)果重新評估，依據(jù)文獻中免疫組化替代分型方案分為五種免疫組化亞型：管腔 A型、管腔B型、HER-2過表達型、基底細胞樣型和未分類型。其中管腔 A型和 B型統(tǒng)稱為管腔型，基底細胞樣型和未分類型統(tǒng)稱為三陰型。標本均經(jīng) 10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.2 方法免疫組化染色采用 EliVision兩步法，兔抗人PD-L1單克隆抗體（SP142）及EliVision檢測試劑盒均購自福州邁新公司；具體操作步驟按試劑盒說明書進行。用胎盤組織作為陽性對照，乳腺癌旁正常乳腺組織作為陰性對照，PBS代替一抗作為空白對照，DAB顯色，蘇木精襯染。

1.3 結(jié)果判讀PD-L1染色陽性為胞膜和（或）胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。PD-L1染色結(jié)果根據(jù)陽性細胞所占百分率進行半定量分析［2］：陽性細胞數(shù) ＜1%為（－），1%～5%為（＋），6%～10%為（?），＞10%為（?）；腫瘤浸潤淋巴細胞的判定依據(jù)國際TIL評價工作組推薦［3］，以 sTIL作為分析對象，評分方法同上；（－）為陰性，（＋～?）為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析采用 SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，PD-L1表達與免疫組化亞型及臨床病理特征的關系、腫瘤細胞與 sTIL中表達相關性均采用 χ2檢驗或Fisher確切概率法分析，各因素間的關系應用多因素 Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點68例非特殊性乳腺浸潤性癌患者均為女性，年齡 32～86歲，平均（55.4±12.7）歲；腫瘤最大徑0.8～9 cm，平均（3.2±1.6）cm；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 40例（58.8%）。組織學分級：Ⅰ級4例（5.9%）、Ⅱ級 38例 （55.9%）、Ⅲ級 26例（38.2%）。管腔型31例（45.6%）、HER-2過表達型16例（23.5%）、三陰型21例（30.9%）。

2．2 PD-L1在腫瘤及 sTIL中的過表達及與臨床病理特征的關系PD-L1過表達與患者年齡、腫瘤大小和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關，但在腫瘤細胞和 sTIL中的表達均與病理分級有關。PD-L1在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級腫瘤細胞中陽性率分別為 0.0（0／4）、26.3%（10／38）、42.3%（14／26）；在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級腫瘤sTIL中的陽性率分別為 25.0%（1／4）、39.5%（15／38）、73.1%（19／26），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。多因素 Logistic回歸分析結(jié)果顯示，只有病理分級對腫瘤細胞陽性率和 sTIL陽性率具有顯著的影響作用，與病理分級為Ⅰ級相比，Ⅲ級患者的腫瘤陽性率和 sTIL陽性率分別增加了 10.27（2.44～43.28）和9.06（2.12～38.79）倍。

2．3 PD-L1在腫瘤細胞中的表達與乳腺癌免疫組化亞型的關系乳腺浸潤性癌周圍間質(zhì)往往存在淋巴細胞浸潤（圖1），PD-L1在35.3%的浸潤性乳腺癌腫瘤細胞中表達，表現(xiàn)為胞膜和（或）胞質(zhì)陽性（圖2），其中在三陰型乳腺癌中的陽性率最高，在管腔型、HER-2過表達型及三陰型乳腺癌中的陽性率分別為16.1%（5／31）、37.5%（6／16）、61.9%（13／21），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。

2．4 PD-L1在 sTIL中的表達與乳腺癌免疫組化亞型的關系PD-L1在51.5%的浸潤性乳腺癌的sTIL中表達（圖3），其中在三陰型乳腺癌 sTIL中的陽性率最高，在管腔型、HER-2過表達型及三陰型乳腺癌的sTIL中陽性率分別為 35.5%（11／31）、43.8%（7／16）、81.0%（17／21），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表3）。

2．5 PD-L1在腫瘤細胞與 sTIL中表達的相關性

PD-L1在腫瘤細胞及 sTIL中的表達呈明顯正相關（χ2＝8.067，P＝0.004 5，表4），部分病例在腫瘤細胞與sTIL中 PD-L1均呈強陽性。

表1 PD-L1在腫瘤細胞和sTIL中的表達及與乳腺癌臨床病理特征的關系

表2 PD-L1在腫瘤細胞中表達與乳腺癌免疫組化亞型的關系［n（%）］

表3 PD-L1在sTIL中表達與乳腺癌免疫組化亞型的關系［n（%）］

圖1 A.腫瘤周圍少量間質(zhì)浸潤淋巴細胞；B.腫瘤周圍中等量間質(zhì)浸潤淋巴細胞；C.腫瘤周圍大量間質(zhì)浸潤淋巴細胞 圖2 A.腫瘤細胞中PD-L1呈（＋），EliVision兩步法；B.腫瘤細胞中PD-L1呈（?），EliVision兩步法；C.腫瘤細胞中PD-L1呈（?），EliVision兩步法 圖3 A.sTIL中PD-L1呈（＋），EliVision法；B.sTIL中PD-L1呈（?），EliVision兩步法；C.sTIL中PD-L1呈（?），EliVision兩步法

表4 PD-L1在腫瘤細胞與 sTIL中表達的相關性［n（%）］

3 討論

PD-L1是相對分子質(zhì)量為4.0×104的Ⅰ型跨膜蛋白，通常免疫系統(tǒng)會對聚集在淋巴結(jié)或脾臟的外來抗原產(chǎn)生反應，促進具有抗原特異性的T細胞增生。細胞程序化死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）與PD-L1結(jié)合，可以傳導抑制性的信號，下調(diào)抗原刺激的淋巴細胞增殖及細胞因子的產(chǎn)生，最終導致淋巴細胞“耗盡”以及誘導免疫耐受［4－5］。PD-L1除表達于腫瘤周圍的 sTIL外，還可以在不同的惡性腫瘤如肺癌［6－8］、膀胱癌［9］、惡性黑色素瘤［10］等腫瘤細胞中表達。有文獻報道腫瘤細胞能夠逃避免疫監(jiān)視，其中可能的重要機制是 PDL1表達于腫瘤細胞，其表達水平與腫瘤的不良預后有相關性。

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其中三陰型乳腺癌目前尚未有特異性的靶向藥物，常規(guī)化療效果不佳。本實驗結(jié)果顯示 54.4%的乳腺非特殊性浸潤性癌表達 PD-L1，其中在三陰型乳腺癌中陽性率為81.0%；三陰型乳腺癌中 PD-L1在腫瘤細胞和sTIL中的表達比管腔型和 HER-2過表達型均更高，與 Cimino-Mathews等［11］報道一致。Ghebeh等［12］發(fā)現(xiàn)乳腺癌PD-L1的陽性率為50%，其中34%在腫瘤上皮細胞中表達，41%在sTIL中表達；他們發(fā)現(xiàn)PDL1在瘤內(nèi)的表達與組織學分級和激素受體陰性有關。本組結(jié)果也顯示PD-L1在腫瘤細胞及 sTIL中的表達均與組織學分級有關，以高級別的浸潤性癌表達最為顯著。Ali等［13］發(fā)現(xiàn)PD-L1在原發(fā)性乳腺癌中的總陽性率較低，但約 1／5的基底樣細胞型腫瘤含有浸潤的免疫細胞且表達 PD-L1。通過對 PDL1的擴增觀察發(fā)現(xiàn)基底樣細胞癌受PD-L1的影響，雖然病例較少，但卻發(fā)生在所有的基底細胞樣腫瘤中。提示 PD-L1抑制藥可能對一小群表達 PD-L1的乳腺癌女性患者（大部分為基底樣細胞型）有效。Mittendorf等［14］通過 RNA序列分析數(shù)據(jù)顯示 PD-L1在三陰型乳腺癌中的表達明顯高于非三陰型乳腺癌（P＜0.001）；他們發(fā)現(xiàn)PTEN缺失是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控PD-L1的一種機制，它是通過PI3K通路信號發(fā)揮作用。三陰型乳腺癌中 PD-L1表達的增加對T細胞產(chǎn)生功能性影響，包括 T細胞增殖的減少和凋亡增多。

然而，Muenst等［15］研究顯示PD-L1表達與 Ki-67／HER-2的表達呈正相關，與 ER表達呈負相關，與 PR表達無關，在不同的乳腺癌亞型中無明顯差異。這與本組 PD-L1在三陰型乳腺癌中表達明顯高于其他類型的結(jié)果不同，可能是由于 Muenst等［15］的研究樣本采用的是 TMA，而 PD-L1在腫瘤中的表達具有異質(zhì)性，組織芯片樣本的局限性可能導致結(jié)果的差異。有文獻報道［16］，利用體內(nèi)影像技術進行PD-L1檢測，可以觀察腫瘤細胞整體的 PDL1表達情況和分布規(guī)律，避免表達異質(zhì)性對實驗結(jié)論的影響，提高 PD-L1作為療效預測指標的準確率。

Beckers等［2］發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞與sTIL中同時表達PD-L1與預后好有關。本組結(jié)果顯示相對于PD-L1腫瘤陰性區(qū)域，腫瘤陽性區(qū)域周圍間質(zhì)浸潤淋巴細胞明顯增多，且表達PD-L1也增強。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，PD-L1在腫瘤細胞與sTIL中的表達呈正相關，提示PD-L1在腫瘤細胞中的表達直接受PD-L1＋sTIL的影響，其是否與腫瘤的預后直接相關，尚需進一步隨訪；Pardoll［17］也支持該觀點，其認為在腫瘤微環(huán)境中，免疫細胞產(chǎn)生的炎性因子如干擾素能上調(diào)腫瘤細胞表面 PD-L1的表達，并形成正反饋環(huán)路是腫瘤細胞逃避獲得性免疫的一種可能性機制。

PD-L1在乳腺癌中的部分病例中表達，在三陰型乳腺癌中表達明顯高于其他類型乳腺癌；其在腫瘤細胞和 sTIL中均有一定的陽性率，其表達與腫瘤的病理分級有關，且在腫瘤細胞中的表達與在 sTIL中的表達呈正相關。PD-L1在乳腺癌中的表達可能有多種機制，阻斷 PD-L1／PD-1信號通路，有望成為乳腺癌尤其是三陰型乳腺癌免疫治療的新策略。

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Expression and significance of PD-L1 in breast cancer tumor cells and tumor-infiltrating lym phocytes

HUANG Shu-bin，HOU Yong-wei，LISong-mei，WANG Zhi-qiang，XU Liang，WANG Hai-ping
（Department of Pathology，the People’s Hospital of Chizhou，Chizhou 247100，China）

PurposeTo investigate the expression of programmed death ligand-1（PD-L1）in breast cancer tumor cells and stromal tumor-infiltrating lymphocyte（sTIL），and to study the relationship between the expression of PD-L1 and the clinicopathological characteristics of the patients.M ethodThe protein expression of PD-L1 was detected by immunohistochemistry of EliVision two-step method in 68 cases of non special type of invasive breast cancer，and the relationship between the expression of PD-L1 protein and the immunohistochemistry subtypes and clinical parameters was analyzed.ResultsThe total expression rate of PD-L1 was 35.3%in breast tumor tissue，specially in triple negative breast cancer（TNBC）which occupy the highest positive rate.The expression rates of PD-L1 in tumor tissue of the luminal subtype，HER-2 over-expression subtype and TNBC subtype were 16.1%，37.5%and 61.9%respectively，and the difference was statistically significant.The total expression rate of PD-L1 in sTIL was 51.5%，and the highest expression rate was 81.0%in TNBC.There were significant differences of PD-L1 expression in sTIL of the luminal subtype，HER-2 over-expression subtype and TNBC subtype.Expression of PDL1 in tumor tissue and sTIL had a significant positive correlation.ConclusionPD-L1 expressed in TNBC was significantly higher than other types of breast cancer，which suggest the blocking of signal pathway of PD-1／PD-L1 may expected to become a new immunotherapy for breast cancer，especially for TNBC subtype.

breast neoplasm；immunohistochemistry subtype；programmed cell death ligand-1；immunotherapy

R 737.9

A

1001－7399（2017）01－0063－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.016

接受日期：2016－11－10

安徽省池州市人民醫(yī)院病理科 247100

黃述斌，男，碩士，副主任醫(yī)師。

E-mail：iamhuangsb1978＠sina.com