鄂 文，夏德安

（東北林業(yè)大學，林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

毛果楊富含谷氨酸蛋白PtrGARP1基因啟動子特性

鄂 文，夏德安

（東北林業(yè)大學，林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

為了研究PtrGARP1與楊樹木質化生長的相關性，明確木材發(fā)育及形成的分子機制，以毛果楊幼樹為材料，提取各組織的cDNA進行PCR擴增，并構建植物表達載體在模式植物擬南芥中進行PtrGARP1組織表達分析。結果顯示，PtrGARP1基因在毛果楊木質化組織內高豐度表達，且表達水平與幼莖木質化程度同步增加；用Gateway技術構建該基因啟動子融合報告基因GUS的ProPtrGARP1::GUS植物表達載體，轉化野生型擬南芥獲得5個穩(wěn)定表達的轉基因株系；GUS活性染色分析顯示，PtrGARP1基因啟動子活性集中在轉基因植株發(fā)達的維管組織內。這個結果暗示著PtrGARP1與楊樹木質化生長相關，可能參與木材發(fā)育及形成。

楊樹；富含谷氨酸蛋白；PtrGARP1；啟動子

木材源自于樹木次生生長，由形成層活動產生次生維管組織（vascular system）而形成，這一過程包括形成層細胞增殖、伸長、分化，次生壁加厚以及細胞程序性死亡（Programmed cell death, PCD）等生理反應[1-5]。近年來，這方面的研究報道主要集中在模式植物擬南芥中[6-8]。研究表明，生長素、細胞分裂素和赤霉素等控制形成層活動[9-11]，而MYB、NAC、HD-ZIPⅢ和KNOX等轉錄因子參與調控木質部次生壁形成[12-14]。此外，木質組織內進化出高豐度、特異表達的Tubulin微管蛋白家族成員與次生壁微纖絲沉積（microfibril deposition）有關，不少微管相關蛋白（microtubule associated proteins, MAPs）也被報道參與了次生壁的形成[15-18]。

最近，通過蛋白組學策略篩選鑒定出多個參與楊樹幼莖木質化生長的蛋白質[19]。其中，一個富含谷氨酸的蛋白（Glutamic Acid Rich Protein）簡稱GARP，雖然功能未知，但其豐度隨幼莖木質化生長而劇烈增加，其基因（Potri.014G162800, 被命名為PtrGARP1）轉錄水平也與幼莖木質化程度同步增加。研究還表明，該基因的表達模式為PtrGARP1基因啟動子表達模式，且驅動報告基因GUS的活性主要集中在轉基因擬南芥發(fā)達的維管組織區(qū)域。研究以毛果楊幼樹為材料，提取各組織的cDNA進行PCR擴增，并構建植物表達載體在模式植物擬南芥中進行PtrGARP1組織表達分析，以期進一步證實PtrGARP1與楊樹木質化生長的相關性，明確木材發(fā)育及形成的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為溫室栽培4個月、株高約1.5 m的毛果楊幼樹，取其頂端到基部第1、2、3、4、5和6莖節(jié)以及木質部、形成層和韌皮部、幼葉、老葉、葉柄、頂芽、根的組織，進行基因轉錄表達分析。以Columbia野生型擬南芥為植物表達載體進行PtrGARP1基因啟動子的遺傳轉化研究。

植物總RNA采用pBIOZOL Reagent（Bioflux公司）提取。cDNA第一鏈采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNAeraser（Takara公司）合成。高保真DNA聚合酶為KOD-Plus（Toyobo公司）。膠內DNA采用Silica Bead DNA Gel Extrction Kit （Thermo Scientific公司）回收。質粒采用E.A.N.A Plasmid Mini Kit I（Omega公司）提取。GUS染液：0.1 mol/L Na3PO4（pH值為7.0），10 mmol/L EDTA，2 mmol/L K3[Fe（CN）6], 2 mmol/L K4[Fe（CN）6]，1 mmol/L X-Gluc, 0.1% （v/v） Triton X-100?；蛞锖铣梢约癉NA測序工作由Invitrogen公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 PtrGARP1氨基酸序列分析 毛果楊PtrGARP1基因信息在植物基因組數據庫中查找并獲取，其他物種的氨基酸序列在NCBI中查找獲取，然后運用BioEdit生物學軟件對這些同源基因的氨基酸序列進行比對分析。

1.2.2 植物總RNA、基因組DNA提取和cDNA第一鏈合成 擬南芥總RNA的提取與cDNA第一鏈合成參照各試劑盒產品說明書。擬南芥基因組DNA提取采用CTAB法[20]。

1.2.3 RT-PCR和啟動子DNA片段擴增 以毛果楊各組織cDNA為模板進行PCR擴增，ACT2為內參基因，基因引物如下：ACT2，5′-CCCAGTGTTGTTGGTAGG CCAAGAC-3′和5′-CATAGCGGGAGAGTTAAAGG TCTC-3′；PtrGARP1，5′-TCTCCAGAGGAAGTAC CTGC-3′和5′-GAACTCAGCGTACGTACTCG-3′；啟動子引物：5′-CACCCTTCAACTCCCACAAGACA-3′和5′-TGGAACTGAAAGGAAAATAAAGCAA-3′。擴增體系（20 μL）：13.5 μL ddH2O，2 μL dNTPs （2 mmol/L），2 μL 10×Taq Buffer，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板或基因組DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL。PCR擴增程序：預變性，94℃ 3 min；循環(huán)擴增，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s或2 min；后延伸，72℃ 7 min。ACT2基因擴增24個循環(huán)，PtrGARP1基因擴增25個循環(huán)，PtrGARP1啟動子片段擴增32個循環(huán)。

1.2.4 植物表達載體構建 植物表達載體構建采用Gateway系統(tǒng)。擴增的PtrGARP1啟動子片段從膠內回收后，連接插入Gateway入門載體pENTR/SD/ D-TOPO vector。連接體系（2.5 μL）：0.5 μL TOPO Vector，0.5 μL Salt Solution，1 μL DNA片段（40 ng），0.5 μL ddH2O。將經DNA測序確認含目的片段的入門載體與pGWB3植物表達載體進行LR交換反應。LR反應體系（3 μL）：1 μL含基因片段的TOPO質粒（40 ng），0.5 μL pGWB載體（120 ng）, 0.5 μL LR Enzyme Mix II，1 μL ddH2O。LR反應條件為22℃、2 h。將交換連接含目的片段的pGWB3重組質粒轉入GV3101農桿菌中進行遺傳轉化實驗。

1.2.5 擬南芥栽培與遺傳轉化 消毒后的擬南芥種子于4℃春化2 d，播種在含1%蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)、生長7 d后，幼苗移栽到土中，置于長日照環(huán)境（16 h光照/8 h黑暗）培養(yǎng)，環(huán)境溫度20～23℃，光強80～100 μmol/(m2·s)。栽培約8周，采用浸花法[21]進行遺傳轉化。

1.2.6 GUS組織化學染色 將植物組織浸沒在GUS染液中抽真空，負壓脫氣5 min再回復正常氣壓，這一操作重復3～5次，然后置于37℃水浴8～10 h。染色結束后加入70%乙醇于37℃下脫色12～16 h，觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 PtrGARP1氨基酸序列分析

據推測，PtrGARP1蛋白有172個氨基酸，其中谷氨酸有57個，約占氨基酸總數的1/3。用該序列同源性檢索顯示，毛果楊基因組存在1個高度同源的編碼基因（Potri.002G223100）。此外，在NCBI（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行Blast同源性檢索顯示，胡楊、可可、葡萄、赤楊、雷蒙德氏棉、陸地棉、荷花及甜橙物種均存在PtrGARP1同源蛋白質。對這些氨基酸序列進行一致性比對（圖1）顯示，這類蛋白質保守氨基酸位點幾乎均為谷氨酸，暗示谷氨酸殘基是這類蛋白質結構或功能行使的關鍵。

2.2 PtrGARP1組織轉錄表達特性

PCR擴增結果顯示：PtrGARP1在毛果楊的木質部、形成層和葉柄組織內高豐度轉錄，其次是老葉和韌皮部，而在幼葉、葉柄、頂芽和根中幾乎檢測不到（圖2b）；在第1至6逐漸木質化生長的莖節(jié)中，PtrGARP1轉錄水平逐步升高，且在已木質化的第5和6莖節(jié)內高豐度轉錄（圖2a）。這表明，PtrGARP1僅在木質化的組織內高豐度表達，暗示著該基因很有可能與次生細胞壁形成相關，參與了楊樹木材發(fā)育及形成過程。

2.3 ProPtrGARP1::GUS植物表達載體構建

用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/） 分析PtrGARP1基因啟動子區(qū)域，長度為3 182 bp。以毛果楊基因組DNA為模板，PCR擴增得到相應片段，插入到pENTR/SD/D-TOPO載體中。由圖3b可知，PtrGARP1啟動子DNA片段成功連接到pENTR/SD/D-TOPO載體。通過LR重組反應將pENTR/SD/D-TOPO載體上ProPtrGARP1片段重組到植物表達載體pGWB3上，以重組質粒為模板使用ProPtrGARP1引物進行PCR擴增鑒定，得到的特異DNA片段長度與目標DNA片段大小相符（圖3 d）。這一結果顯示ProPtrGARP1::GUS植物表達載體已構建成功，將其轉入GV3101農桿菌中用于轉化野生型擬南芥。

2.4 轉基因植株分子鑒定

圖1 PtrGARP1及其同源蛋白推測氨基酸序列比對

圖2 PtrGARP1在不同組織內的轉錄表達分析

圖3 PtrGARP1基因啟動子的pGWB3植物表達載體構建

采用浸花法對野生型擬南芥進行遺傳轉化，通過卡那霉素抗性篩選獲得ProPtrGARP1::GUS抗性植株5棵，分別提取各轉基因植株的基因組DNA，用上游引物和GUS基因下游引物對基因組DNA 進行PCR擴增。從圖4中可以看出，野生型擬南芥無擴增帶而ProPtrGARP1::GUS轉基因各株系中均可見特異帶，表明ProPtrGARP1::GUS融合基因已成功轉入野生型擬南芥基因組中。

圖4 ProPtrGARP1::GUS轉基因植株鑒定

2.5 轉基因植株GUS組織化學染色

對ProPtrGARP1::GUS轉基因材料的幼苗以及生長至開花期的成熟植株進行GUS組織化學染色。由圖5可知，藍色信號主要出現于幼苗葉脈、葉柄、上胚軸和根中柱區(qū)域；在成熟植株的莖和花器官中均被觀察到強烈的GUS活性；進一步分析顯示，在莖組織的維管發(fā)達區(qū)域的維管束、木質部和束纖維內GUS活性較高。這些數據表明PtrGARP1基因的啟動子活性主要存在于維管系統(tǒng)發(fā)達的組織內，這暗示PtrGARP1與楊樹木質化生長相關，可能參與木材形成。

圖5 ProPtrGARP1::GUS轉基因植株GUS組織化學染色

3 討 論

富含谷氨酸蛋白（GARPs）是一類新奇的蛋白質，由于按富含Glu歸類則不同源的GARPs功能是不同的。一些非植物GARPs功能被報道，如柱狀感光蛋白、人屬纖維蛋白原類似蛋白等[22-23]。然而，植物GARPs的文獻較少，僅有的幾篇文獻描述幾個不同源GARPs基因克隆、表達或推測性功能[24-26]。目前，還沒有植物GARP功能被證實。PtrGARP1同源性檢索顯示（圖1），擬南芥和玉米中不存在GARP1同源基因，而赤楊（A. glutinosa）、木薯（M. esculenta）和葡萄（V. vinifera）等植株中存在GARP1同源基因。

木薯中PtrGARP1同源基因被命名Pt2L4，主要表達在次生維管組織區(qū)域[27-28]。前期研究表明，PtrGAPR1蛋白豐度隨幼莖木質化生長而劇烈增加[19]。而從RT-PCR分析可知，PtrGAPR1轉錄水平也隨幼莖木質化生長而同步增加（圖2），進一步研究表明（圖5），PtrGARP1基因啟動子活性主要集中在轉基因植株的維管組織區(qū)域。這些結果均暗示著PtrGARP1與楊樹木質化生長相關，可能參與了木材形成過程。植物Tubulin微管蛋白的氨基酸序列中含有多個谷氨酸[17]，且可通過微管組織參與細胞壁纖維素微纖絲沉積、介入細胞壁增厚等生理過程[15-16]。由此推測，PtrGARP1很可能與楊樹微管組織相關，進而參與次生壁合成（木質化）過程。然而，PtrGARP1的準確功能有待通過其突變體材料鑒定。

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（責任編輯：成 平）

Characterization of the PtrGARP1 Promoter from Populus trichocarpa

E Wen，XIA De-an
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, PRC）

Reverse transcriptional (RT)-PCR analysis showed that the PtrGARP1 gene was highly expressed in the lignified tissues of Populus trichocarpa and the transcriptional expression levels were significantly increased with the lignification of young stems. DNA fragment of PtrGARP1 promoter was constructed into plant expression vector (ProPtrGARP1::GUS) by fusing GUS reporter gene using Gateway technology. Five transgenic lines were obtained after the transformation of Arabidopsis. Analysis of GUS activity staining showed that the activity existed in the developing vascular tissues of transgenic plants. The result suggests that PtrGARP1 gene function is associated with the lignification of Populus trichocarpa and may be involved in wood development and formation.

Populus trichocarpa; glutamic acid rich protein; PtrGARP1; promoter

Q789

：A

：1006-060X（2017）02-0001-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.002.001

2016-12-14

國家863計劃課題（2013AA102702）

鄂 文（1991-），女，黑龍江雞西市人，碩士研究生，研究方向為林木遺傳育種。

夏德安