頡曉勇，鐘金香，趙金良

（1.廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州510300；2. 廣東省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣東 廣州，510220；3.上海海洋大學(xué)，上海，201306）

遺傳標(biāo)記在羅非魚良種選育研究中的應(yīng)用與展望

頡曉勇1，鐘金香2，趙金良3

（1.廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州510300；2. 廣東省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣東 廣州，510220；3.上海海洋大學(xué)，上海，201306）

綜述了在近些年中傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記羅非魚良種選育相關(guān)研究中的應(yīng)用情況，探討了多種分子標(biāo)記聯(lián)合分析的必要性，展示了羅非魚選育群體基于SSR/AFLP分別計(jì)算的Nei（1978）相似性系數(shù)比率穩(wěn)定分布于0.942 07～0.963 70之間，而群體間SSR/AFLP遺傳距離比率全都遠(yuǎn)大于1，具有良好的區(qū)分度。綜合多種因素，推薦SSR作為羅非魚良種選育群體遺傳多樣性水平的常規(guī)監(jiān)測(cè)手段。并指出基于DNA序列測(cè)定與生物信息學(xué)技術(shù)開發(fā)的新型分子標(biāo)記類型應(yīng)當(dāng)作為未來羅非魚良種選育研究的重點(diǎn)方向。

羅非魚；遺傳標(biāo)記；良種選育；綜述

羅非魚優(yōu)良品種在育種過程中，群體遺傳性狀不可避免地受到保種規(guī)模、環(huán)境因素等生產(chǎn)條件變遷的影響。對(duì)于育種群體數(shù)量有限的羅非魚選育過程中群體，在傳代過程中極有可能出現(xiàn)管理不當(dāng)、近交衰退、瓶頸效應(yīng)等導(dǎo)致選育良種出現(xiàn)種質(zhì)退化的風(fēng)險(xiǎn)。因此，進(jìn)行不同遺傳多樣性方法對(duì)比，將為選擇適宜的遺傳多樣性評(píng)估方法，展開對(duì)于優(yōu)良品種傳代過程中群體的常規(guī)遺傳多樣性水平監(jiān)測(cè)建立必要的技術(shù)基礎(chǔ)。

羅非魚優(yōu)良品種育種群體的遺傳多樣性是其遺傳信息的總和。遺傳多樣性分析通常采用不同類型遺傳標(biāo)記工具，分析對(duì)象包括一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體或者種內(nèi)不同群體，具體則以群體內(nèi)及群體間的遺傳變異總和來進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)前研究報(bào)道中應(yīng)用較為廣泛的遺傳標(biāo)記主要包括四種類型，分別為形態(tài)學(xué)標(biāo)記（morphological marker）、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytologicalmarker）、生化標(biāo)記（biochemical marker）、和分子標(biāo)記（molecular marker）。形態(tài)標(biāo)記主要是針對(duì)羅非魚的外部形態(tài)特征，通常以肉眼觀測(cè)即可簡(jiǎn)單區(qū)分，或者通過形態(tài)測(cè)量的方法進(jìn)行。細(xì)胞標(biāo)記主要是染色體的核型和帶型，檢測(cè)對(duì)象主要是分裂時(shí)期的染色體。生化標(biāo)記是在蛋白質(zhì)多態(tài)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，主要包括同工酶和貯藏蛋白。這三類標(biāo)記都是生物內(nèi)在遺傳基因表達(dá)的結(jié)果，是對(duì)基因差異的間接反映，而且表達(dá)過程中易受到環(huán)境條件的影響，可以統(tǒng)稱為基因表達(dá)結(jié)果類遺傳標(biāo)記。

1 基因表達(dá)結(jié)果類標(biāo)記

1.1 形態(tài)標(biāo)記

形態(tài)標(biāo)記主要是針對(duì)肉眼可見的或儀器測(cè)量動(dòng)物的外部形態(tài)，以其遺傳待征為標(biāo)記，具有簡(jiǎn)單、方便、易操作性的優(yōu)勢(shì)。這種方法在傳統(tǒng)的遺傳育種過程中仍然得到大量應(yīng)用，育種工作者可以直接根據(jù)羅非魚的體長(zhǎng)、體高、體寬等，以及相對(duì)的生長(zhǎng)速度差異等性狀來進(jìn)行優(yōu)良品種的選擇。郭金濤等[1]通過6個(gè)可數(shù)性狀、10個(gè)可量性狀及24個(gè)框架性狀，比較分析了尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus♀）×薩羅羅非魚（Sarotherodon melanotheron♂）雜交后代F1、F2形態(tài)性狀的遺傳與變異特征，建立了不同群體的可數(shù)性狀、可量與框架性狀的判別公式，其雜交F1形態(tài)遺傳了雙親的形態(tài)特征，且有一定的偏母遺傳。唐瞻楊等[2]以尼羅羅非魚不同月齡個(gè)體為研究對(duì)象進(jìn)行了形態(tài)性狀主成分及其判別分析，基于不同階段生長(zhǎng)指標(biāo)主成份差異，得到了尼羅羅非魚形態(tài)指標(biāo)的增長(zhǎng)規(guī)律，并判定了其最佳生長(zhǎng)季節(jié)體格與月齡的關(guān)系。

1.2 細(xì)胞標(biāo)記

細(xì)胞標(biāo)記是對(duì)經(jīng)過固定、壓片、染色等程處理過的染色體，主要包括染色體相對(duì)長(zhǎng)度、著絲點(diǎn)位置、臂比值、臂指數(shù)等指標(biāo)，分析染色體核型和帶型及缺失、重復(fù)、易位、倒位等。李思發(fā)等[3]對(duì)尼羅羅非魚和薩羅羅非魚正反雜交子代的頭腎細(xì)胞的核型進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)4種遺傳型羅非魚具有相同的染色體二倍數(shù)（2n=44）和總臂數(shù)（NF=50），但各具不同的染色體類型，正反雜交子代表現(xiàn)為介于雙親之間的混合類型。朱華平等[4]采用體腔注射PHA-空氣干燥法對(duì)橙色莫桑比克羅非魚（Oreochromismossambicus）和荷那龍羅非魚（O.hornorum）染色體數(shù)量、形態(tài)和核型進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示兩種羅非魚染色體核型公式均為2n=44，6sm+24st+14t，NF=50，用常規(guī)染色體染色的方法難以區(qū)分，表明這兩種羅非魚的常規(guī)核型差異不顯著，在分類地位上非常接近。

1.3 生化標(biāo)記

生化標(biāo)記主要指血型、血清蛋白及同工酶等，是鑒定外源DNA和研究物種起源及進(jìn)化方面的有效工具。同工酶是生物體內(nèi)催化同一化學(xué)反應(yīng)但具有不同分子結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，同工酶標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，需要的實(shí)驗(yàn)材料少，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果較為穩(wěn)定，目前仍是生物群體遺傳特性研究中應(yīng)用較多的一種分析方法。同工酶作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，是一種可靠的遺傳標(biāo)記。李思發(fā)等[3]采用同工酶電泳方法檢測(cè)了尼羅羅非魚和薩羅羅非魚正反雜交子代的腎、肝、眼、肌肉、心中乳酸脫氫酶等4種同工酶的表型差異，推測(cè)核型和同工酶方面的差異可能是導(dǎo)致這兩種不同屬羅非魚生殖隔離的遺傳原因。楊淞等[5]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳法分析了酯酶（EST）、超氧化物歧化酶（SOD） 和乳酸脫氫酶（LDH） 3種同工酶在荷那龍羅非魚（Oreochromis hornorum）和莫桑比克羅非魚（O.mossambicus）肝臟、心臟、肌肉、腦和腎臟5種器官組織中的表達(dá)情況，表明兩種羅非魚的這3種同工酶均具有明顯的組織特異性，且EST-7和EST-8僅分別存在于莫桑比克羅非魚的心臟和腦器官中，可作為鑒別兩種羅非魚的標(biāo)記。

2 DNA分子標(biāo)記

遺傳多樣性的表現(xiàn)方式多種多樣，通常以遺傳變異程度的高低進(jìn)行衡量。遺傳多樣性的本質(zhì)則是遺傳物質(zhì)DNA分子的多態(tài)性。與基于基因表達(dá)結(jié)果類遺傳標(biāo)記相比，DNA 分子標(biāo)記是對(duì)個(gè)體間核苷酸序列變異的直接分析，是遺傳變異的直接反映，相較而言具有獨(dú)特的遺傳穩(wěn)定性、可靠性和準(zhǔn)確性。

目前羅非魚良種選育研究報(bào)道中應(yīng)用的DNA標(biāo)記技術(shù)已有多種，主要包括針對(duì)核基因?qū)ο蟮南拗菩云伍L(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、源于表達(dá)序列標(biāo)簽 （EST）庫的SSR（EST-SSR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP） 等，以及針對(duì)細(xì)胞器基因（包括片段）序列多態(tài)性等，這些DNA 標(biāo)記技術(shù)各具特色，各有所用。有關(guān)這些技術(shù)的特征詳見另文介紹。

2.1 不同種類DNA標(biāo)記對(duì)比分析

采用不同種類標(biāo)記對(duì)進(jìn)行對(duì)比研究的報(bào)道在植物學(xué)領(lǐng)域相對(duì)較多，而動(dòng)物學(xué)尤其是在魚類方面比較少。如Russell et al[6]采用RFLPs，RAPDs，SSRs，AFLPs四種方法對(duì)大麥進(jìn)行遺傳差異分析，發(fā)現(xiàn)得到的基因多樣性指數(shù)分別為0.322，0.521，0.566，0.937；遺傳相似度估計(jì)值分別為0.843，0.879，0.829，0.924。Patzak 等[7]對(duì)啤酒花（Humulus lupulus L.）遺傳變異采用四種分子標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行了分析；Uptmoor等[8]對(duì)高梁（Sorghum bicolor）采用RAPD、AFLP、SSR三種多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行了研究；Belaj等[9]對(duì)橄欖采用RAPD、AFLP、SSR分析，認(rèn)為分辨能力（discriminating capacity）AFLP為0.99，SSR為0.90，RAPD為0.85；區(qū)分功效（discriminating power）為AFLP＞SSR＞RAPD。

2.2 基于不同標(biāo)記方法的聯(lián)合分析

2.2.1 不同標(biāo)記聯(lián)合分析群體遺傳多樣性 在之前的絕大多數(shù)羅非魚遺傳分析報(bào)道中，通常都是僅采用1種或2種遺傳多樣性分析手段對(duì)同一套育種動(dòng)物群體進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，原因主要可能是由于受到實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)手段等的限制。但是近年來，隨著實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)的改進(jìn)和自動(dòng)化程度的提高，同時(shí)采用表型、等位酶等基因表達(dá)結(jié)果類遺傳標(biāo)記分析方法，以及多種DNA分子標(biāo)記手段，對(duì)同一套試驗(yàn)材料和進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以求獲得對(duì)研究材料更為深入的理解，正在逐漸成為一種發(fā)展趨勢(shì)[10]，而且通過不同類型研究方法得到的結(jié)果有些情況下可能比較吻合，有些卻會(huì)展現(xiàn)出較大差異。因此，如何對(duì)不同方法得到的結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，是遺傳多樣性分析中出現(xiàn)的新課題。

任何遺傳多樣性的研究方法都是從特定的角度進(jìn)行探討，各自有其理論上或者實(shí)際應(yīng)用上的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。但毫無疑問的是任何一種檢測(cè)遺傳多樣性的方法本身都存在一定程度上的局限性，目前來說還找不到一種可以完全替代其他方法的技術(shù)，也即沒有一種方法可以完美解決所有問題。因此，可以說用任何一種遺傳標(biāo)記方法分析得到的遺傳多樣性參數(shù)結(jié)果都具有一定的片面性，無論該分析手段多么先進(jìn)。如果要想更深入、全面、準(zhǔn)確地了解羅非魚良種選育群體的遺傳多樣性狀況，只有盡可能地采取多種遺傳多樣性分析方法進(jìn)行聯(lián)合分析，以實(shí)現(xiàn)不同方法間的相互彌補(bǔ)和綜合從而獲得完整的遺傳多樣性信息。

2.2.2 不同標(biāo)記分析群體遺傳多樣性時(shí)的橫向比較研究 李瑩瑩[11]綜合研究了牡丹遺傳多樣性分析與品種鑒定中分子標(biāo)記的應(yīng)用情況，發(fā)現(xiàn)同時(shí)應(yīng)用兩類不同分子標(biāo)記方法對(duì)牡丹資源進(jìn)行橫向?qū)Ρ鹊膱?bào)道幾乎為空白，新型目的基因分子標(biāo)記研究對(duì)傳統(tǒng)DNA分子標(biāo)記提供了補(bǔ)充，提出應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)不同標(biāo)記技術(shù)在牡丹資源研究中的聯(lián)合應(yīng)用。羅非魚良種選育研究中不同類型分子標(biāo)記間的橫向?qū)Ρ妊芯客瑯咏咏诳瞻譡12-13]。在新吉富羅非魚選育群體mtDNA Cytb和D-loop基因序列特征分析的基礎(chǔ)上，筆者基于學(xué)界對(duì)于兩種技術(shù)所得到的遺傳變異數(shù)據(jù)之間關(guān)系所知無幾的嚴(yán)峻狀況，開展了羅非魚良種選育群體源于Cytb和D-loop基因的序列遺傳變異和遺傳結(jié)構(gòu)對(duì)比分析，以期為針對(duì)不同種類經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物優(yōu)良品種育種對(duì)象，選擇不同的遺傳標(biāo)記分析方法，以及擴(kuò)展研究結(jié)果之間橫向比較提供方法上的參考，使得研究結(jié)果相比較更加逼近客觀事實(shí)，加強(qiáng)研究結(jié)果的應(yīng)用價(jià)值。

以新吉富羅非魚選育群體F0、F6～F9共5代為材料，基于SSR方法和AFLP方法，按SSR/AFLP分別計(jì)算得到的5個(gè)選育群體間Nei（1978）相似性系數(shù)比率及遺傳距離比率結(jié)果如表1所示。

表1 群體間Nei相似性系數(shù)（1978）比率（右上角）及遺傳距離比率（左下角）

從表1中可以看出群體間SSR/AFLP遺傳相似性比率有很好的穩(wěn)定性，群體間SSR/AFLP遺傳距離比率全都遠(yuǎn)大于1，具有良好的區(qū)分度。眾多類似研究也表明SSR具有多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，尤其是適用于其他標(biāo)記類型揭示變異水平低的物種[14]。結(jié)合微衛(wèi)星相比較更加便捷高效的優(yōu)勢(shì)，就建立優(yōu)良品種選育群體的常規(guī)遺傳多樣性水平檢測(cè)工具而言，SSR為更適宜于羅非魚選育群體遺傳多樣性常規(guī)檢測(cè)的分析方法。

2.2.3 不同標(biāo)記聯(lián)合用于建立遺傳連鎖圖譜 聯(lián)合應(yīng)用不同遺傳標(biāo)記，目前已經(jīng)建立一些具有重要經(jīng)濟(jì)性狀養(yǎng)殖品種的遺傳連鎖圖譜。Kocher[15]對(duì)于尼羅羅非魚率先建立遺傳連鎖圖譜，其作圖群體采用的是來自一個(gè)母本的41個(gè)單倍體胚胎組成的家系，由62個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和112個(gè)AFLP標(biāo)記構(gòu)成30個(gè)連鎖群，平均23.5 cM，總圖距為1 000～2 000 cM。Agresti[16]采用三雜交羅非魚（以奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚的雄性雜交子一代作父本，雌性莫桑比克羅非魚作母本）構(gòu)建作圖群體，共得到214個(gè)分離的標(biāo)記（包括60個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，154個(gè)AFLP位點(diǎn)），組成24個(gè)連鎖群。McConnell[17]報(bào)道了采用尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚雜交子代為作圖群體，得到9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)成4個(gè)連鎖群。

3 展 望

各種遺傳標(biāo)記的大量應(yīng)用在羅非魚良種選育實(shí)踐中發(fā)揮了重要作用。然而對(duì)于基因定位和QTL作圖來說，現(xiàn)有文獻(xiàn)中能提供的遺傳連鎖圖譜精細(xì)度需要持續(xù)不斷的大幅度提高，目前已經(jīng)開發(fā)出來的遺傳標(biāo)記數(shù)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足羅非魚遺傳標(biāo)記輔助育種生產(chǎn)實(shí)踐的需求。

隨著基因測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，DNA測(cè)序進(jìn)入個(gè)體特異性測(cè)序新階段。順應(yīng)國(guó)際研究潮流，未來羅非魚育種遺傳標(biāo)記相關(guān)研究主要應(yīng)當(dāng)從以下幾個(gè)方面來考慮。（1）DNA序列多態(tài)性技術(shù)。由于測(cè)序成本的大幅度下降，DNA序列多態(tài)性分析在操作上越來越簡(jiǎn)單易行，未來將成為遺傳多樣性分析的主要工具之一。一些細(xì)胞器如線粒體DNA[18-19]，因其進(jìn)化快速的特征而成為羅非魚良種選育中DNA序列多樣性分析的首選。（2）目前國(guó)際主要的生物信息數(shù)據(jù)庫允許各研究機(jī)構(gòu)隨時(shí)提交各種序列，海量DNA序列信息被累積儲(chǔ)存于各個(gè)大型公共數(shù)據(jù)庫。因此，充分利用公開DNA序列信息開發(fā)新標(biāo)記是相對(duì)而言更為經(jīng)濟(jì)有效的方法。比如與傳統(tǒng)尋找微衛(wèi)星的方法相比，Varshney于2005年指出EST-SSR更為簡(jiǎn)捷快速[20]。2003年開發(fā)的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（TRAP）標(biāo)記技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、高通量的優(yōu)勢(shì)[21]。馬慶男等[22]建立了羅非魚TRAP分子標(biāo)記反應(yīng)體系，豐富了羅非魚遺傳多樣性評(píng)價(jià)、種質(zhì)鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等研究手段。1996年開發(fā)的cDNA-AFLP 技術(shù)[23]，在研究cDNA差異顯示的同時(shí)，還可以揭示基因的功能。2007年Begge提出功能標(biāo)記的概念[24]，即從影響特定遺傳性狀變異的基因功能域開發(fā)分子標(biāo)記，可以預(yù)計(jì)其應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇育種可有效提高選擇效率。這些基于測(cè)序與生物信息學(xué)技術(shù)開發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)必將在羅非魚良種選育研究領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

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（責(zé)任編輯：高國(guó)賦）

Application and Prospect of Genetic Markers in Tilapia Breeding

XIE Xiao-yong1，ZHONG Jin-xiang2，ZHAO Jin-liang3
（1. Key Lab. of Fishery Ecology and Environment, Guangdong Province, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, PRC; 2. Fishery Technical Extension Center of Guangdong, Guangzhou 510220, PRC; 3. Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, PRC）

In this paper, the application of the traditional genetic marker tilapia breeding in recent years was reviewed. The necessity of the combined analysis of several molecular markers was pointed out. The similarity coefficient ratios of Nei (1978) calculated respectively by SSR/AFLP were between 0.942 07 and 0.963 70 in the tilapia breeding population, meanwhile the genetic distances ratios of Nei (1978) calculated by SSR/AFLP among populations were much larger than 1, which revealed the discrimination ability of SSR. Based on several factors, SSR was recommended as a routine monitoring method for genetic diversity of Tilapia breeding. And it was pointed out that the new type of molecular marker based on DNA sequencing and bioinformatics development should be the focus of the future study of tilapia breeding.

tilapia; genetic marker; breeding; riview

Q347

：A

：1006-060X（2017）02-0123-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.002.031

2016-11-03

國(guó)家“十五”攻關(guān)項(xiàng)目（2001BA505B0513）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2007TS04）

頡曉勇（1976-），男，甘肅天水市人，副研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源與養(yǎng)殖技術(shù)研究。