孫 綱，韓大躍△，關(guān)宏偉，隋 欣，付大鵬

1.解放軍第210醫(yī)院 (大連 116021)；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(大連 116011)

Wnt/β-catenin及p38MAPK信號通路在人胃癌組織中的表達(dá)情況與化學(xué)治療預(yù)后及多藥耐藥相關(guān)性研究

孫 綱1，韓大躍1△，關(guān)宏偉2，隋 欣1，付大鵬1

1.解放軍第210醫(yī)院 (大連 116021)；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(大連 116011)

目的 研究Wnt/β-catenin及p38MAPK信號通路在人胃癌組織中的表達(dá)規(guī)律及其與患者病理情況、化療后預(yù)后生存期情況、相關(guān)多藥耐藥因子之間相關(guān)性。方法 選取2007年11月至2013年7月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃癌根治術(shù)后病例共91例，應(yīng)用免疫組化法，對已行胃癌根治術(shù)、相同化療、隨訪的91名病例的病理標(biāo)本進(jìn)行檢測，收集Wnt/β-catenin及p38MAPK表達(dá)情況和患者一般及病理情況、多藥耐藥因子ToPoⅡ和GST-π表達(dá)情況、預(yù)后生存期情況，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 Wnt/β-catenin及p38MAPK陽性表達(dá)率與年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤分期無相關(guān)性；相同化療后，中位生存時間Wnt/β-catenin陰性表達(dá)患者(26.5個月)比陽性表達(dá)患者(14.9個月)延長(P<0.05)， p38MAPK陽性表達(dá)患者(29.1個月)比陰性表達(dá)患者(9.2個月)延長(P<0.05)，經(jīng)Log-Rank分析,Wnt/β-catenin陽性表達(dá)率與患者預(yù)后生存期呈負(fù)相關(guān)，p38MAPK陽性表達(dá)率與患者預(yù)后生存期呈正相關(guān)(P<0.05)；p38MAPK陽性表達(dá)率分別與ToPoⅡ及GST-π陽性表達(dá)率呈正相關(guān)及負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，而Wnt/β-catenin陽性表達(dá)率與二者均無相關(guān)性(P>0.05)；Wnt/β-catenin與p38MAPK陽性表達(dá)率之間無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 Wnt/β-catenin及p38MAPK陽性表達(dá)率與年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤分期無關(guān)；Wnt/β-catenin陽性低表達(dá)及p38MAPK陽性高表達(dá)與胃癌化療預(yù)后生存期成正相關(guān)，可能降低了化療藥物的多藥耐藥性。

Wnt/β-catenin信號通路；p38MAPK信號通路；人胃癌； 多藥耐藥

盡管規(guī)范化的胃癌根治性手術(shù)及術(shù)后化學(xué)治療方案已在臨床廣泛推廣及應(yīng)用，但療效仍不樂觀。排除手術(shù)操作的局限性和不可預(yù)知性，腫瘤細(xì)胞本身對化學(xué)藥物的多藥耐藥特性也是嚴(yán)重影響預(yù)后的主要因素，多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞先天或后天具有對某種抗腫瘤藥物的耐藥特性，而且可能對其他結(jié)構(gòu)特征、干擾機(jī)制、靶目標(biāo)不盡相同的其他類型抗腫瘤藥物具有耐藥特性。鑒于多藥耐藥的發(fā)生是多因素共同作用結(jié)果，可能存在各種信號通路及蛋白異常。選取近年來腫瘤多藥耐藥的研究熱點(diǎn)，既具備調(diào)節(jié)消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲作用,又參與調(diào)控腫瘤對化學(xué)藥物的多藥耐藥反應(yīng)的Wnt/β-catenin及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號通路，采用免疫組化的實(shí)驗(yàn)方法,研究人胃癌患者組織中上述兩種信號通路的表達(dá)情況與患者的病理情況、經(jīng)過相同化學(xué)治療方案治療后的預(yù)后情況和已知的多藥耐藥因子拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(ToPoⅡ)(多藥耐藥不利因素)及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-π(GST-π)(多藥耐藥有利因素)[1]表達(dá)情況之間的相關(guān)性,以探討人胃癌組織中Wnt/β-catenin和p38MAPK信號通路與化學(xué)治療預(yù)后及多藥耐藥之間的相關(guān)性，為今后通過單獨(dú)或聯(lián)合調(diào)控Wnt/β-catenin和p38MAPK信號通路，以便為影響腫瘤多藥耐藥的作用機(jī)制提供理論研究基礎(chǔ)。

1 資料及方法

1.1 臨床資料

隨機(jī)選取2007年11月至2013年7月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃癌根治術(shù)后病例，手術(shù)前及手術(shù)中無明顯遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)，其臨床、病理資料完整；手術(shù)后均按奧沙利鉑、亞葉酸鈣、5-Fu聯(lián)合方案行化學(xué)治療4療程；具備規(guī)范、系統(tǒng)的隨訪；排除非癌性死亡病例。最終入選病例數(shù)為91例，其中，男59例，女32例；年齡38～85歲，平均年齡52歲,中位年齡68歲，其中，>60歲42例，50～60歲33例，<50歲16例。定期隨訪數(shù)據(jù)完整。入選病例病理石蠟標(biāo)本切片備用。

1.2 方法及主要試劑

將入選病例病理石蠟標(biāo)本切片逐步常規(guī)處理后，采用MaxVision/HRP 免疫組化染色并進(jìn)行檢測。主要試劑分別采用北京普利萊基因技術(shù)有限責(zé)任公司濃縮型鼠抗人β-catenin單克隆抗體、上海酶聯(lián)生物研究所p38鼠抗人單克隆抗體、上海億欣生物科技有限公司ToPoⅡ鼠抗人單克隆抗體、上海滬震實(shí)業(yè)有限公司GST-π鼠抗人單克隆抗體、北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司HRP 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，已知陽性平片作對照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

Wnt/β-catenin主要表達(dá)于胞漿和細(xì)胞膜；p38MAPK主要表達(dá)于胞漿；ToPoⅡ主要表達(dá)于細(xì)胞核；GST-π主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。以上染色成棕黃色顆粒狀且腫瘤間質(zhì)不染色，定為陽性，其中，陽性細(xì)胞占75%～100%標(biāo)記為(+++)；陽性細(xì)胞占25%～74%標(biāo)記為(++)；陽性細(xì)胞占5%～24%標(biāo)記為(+)；陽性細(xì)胞占0%～4%標(biāo)記為(-)[2](圖1)。

1.4 數(shù)據(jù)收集

收集各病例Wnt/β-catenin、p38MAPK、ToPoⅡ、GST-π的表達(dá)情況，并根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；收集患者年齡、性別、入選病例腫瘤組織學(xué)分級及臨床分期(AJCC第7版分期)的分布情況；收集化學(xué)治療后患者生存期(中位生存時間)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人胃癌組織中Wnt/β-catenin、p38MAPK的陽性表達(dá)情況以及與患者一般情況及病理情況之間的相關(guān)性

從入選病例Wnt/β-catenin陽性表達(dá)情況可發(fā)現(xiàn),Wnt/β-catenin總陽性表達(dá)率為74.7%(68/91)，但經(jīng)秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin陽性率的分布與患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)分級、腫瘤臨床分期無相關(guān)性(P>0.05)。從入選病例p38MAPK陽性表達(dá)情況可發(fā)現(xiàn)，p38MAPK總陽性表達(dá)率為80.2%(73/91)，但經(jīng)秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，p38MAPK陽性率的分布與患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)分級、腫瘤臨床分期無相關(guān)性(P>0.05)(表1)。

圖1 Wnt/β-catenin 、p38MAPK、ToPoⅡ、GST-π表達(dá)情況

注：A. Wnt/β-catenin表達(dá)陽性(×400)；B.p38MAPK表達(dá)陽性(×400)；C.ToPoⅡ表達(dá)陽性(×400)；D.GST-π表達(dá)陽性(×400)

表1 Wnt/β-catenin、 p38MARK在人胃癌組織中的表達(dá)與各病理因素的關(guān)系[n(%)]

2.2 人胃癌組織中Wnt/β-catenin、p38MAPK陽性表達(dá)情況與預(yù)后生存期之間的關(guān)系

Wnt/β-catenin陰性表達(dá)患者中位生存期(26.5個月)高于Wnt/β-catenin陽性表達(dá)(包括+、++、+++)患者中位生存期(14.9個月)(P<0.05)， p38MAPK陽性表達(dá)(包括+、++、+++)患者中位生存期(29.1個月)高于p38MAPK陰性表達(dá)患者中位生存期(9.2個月)(P<0.05)；同時,經(jīng)Log-Rank單因素相關(guān)性分析，Wnt/β-catenin陽性低表達(dá)及p38MAPK陽性高表達(dá)均可能是對腫瘤化學(xué)治療預(yù)后生存期的有利因素，可能是對腫瘤化學(xué)治療藥物多藥耐藥的不利因素(P<0.05)(表2)。

表2 胃癌患者(Wnt/β-catenin)/(p38MAPK)表達(dá)情況與經(jīng)化學(xué)治療后生存期單因素相關(guān)性分析

2.3 人胃癌組織中Wnt/β-catenin、p38MAPK陽性表達(dá)情況與已知多藥耐藥因子ToPoⅡ、GST-π陽性表達(dá)情況之間的相關(guān)性本研究中，ToPoⅡ總陽性表達(dá)率為49.5%(45/91)，其中，10例為(+++)，11例為(++)，24例為(+)，46例為(-)； GST-π陽性表達(dá)率76.9%(70/91)，其中，30例為(+++)，27例為(++)，13例為(+)，21例為(-)。

人胃癌中Wnt/β-catenin陽性表達(dá)率與ToPoⅡ及GST-π陽性表達(dá)率之間無相關(guān)性(P>0.05)；人胃癌中p38MAPK陽性表達(dá)率與ToPoⅡ陽性表達(dá)率呈正相關(guān)性(r=0.227，P=0.003)，而與GST-π陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.254 ，P=0.005)；Wnt/β-catenin陽性表達(dá)率與p38MAPK陽性表達(dá)率之間無相關(guān)性(P>0.05)。

鑒于ToPoⅡ和GST-π為已知的影響多藥耐藥因素，且ToPoⅡ?yàn)椴焕蛩?，GST-π為有利因素,由此得出，p38MAPK高表達(dá)可能是對腫瘤化學(xué)治療藥物耐藥的不利因素。

3 討論

胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，位居我國城市居民惡性腫瘤死因第3位，且發(fā)病率有升高趨勢[3]。因胃癌發(fā)病初期臨床特異性癥狀不明顯，患者投入關(guān)注力不足，易于漏診及誤診。目前，確診后多采用以根治性手術(shù)及化學(xué)治療為主要手段的綜合治療，并制定了如NCCN的治療指南。盡管近年來，臨床及基礎(chǔ)研究已取得了十足發(fā)展，大量新興手術(shù)技術(shù)、治療方法及更有效的抗腫瘤藥物[4]逐步出現(xiàn)并應(yīng)用，但胃癌的綜合預(yù)后仍不理想，轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和死亡率很高。而化學(xué)治療作為胃癌治療中的關(guān)鍵一環(huán)，多用于化學(xué)治療初期，療效明顯，敏感性較高，治療后期卻出現(xiàn)平臺期，甚至藥物敏感性明顯降低，即使更換治療方案也效果甚微。這種情況多歸因于惡性腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥效應(yīng)。多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，已知可能的原因?yàn)椋?)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)引起的藥物分子細(xì)胞內(nèi)外分布失調(diào)，導(dǎo)致藥物分子外泄；2)調(diào)節(jié)細(xì)胞器靶點(diǎn)分布，從而隱藏藥物靶點(diǎn)；3)LRP的類膜泵效應(yīng)胞吐藥物分子；4)細(xì)胞的自我修復(fù)過表達(dá)；5)細(xì)胞的藥物靶點(diǎn)突變，降低其對藥物敏感性；6)PKC 過表達(dá)，促進(jìn)相關(guān)蛋白磷酸活化；7)凋亡基因的影響等[5-6]。同時，多種信號通道及蛋白參與其中，并起到了絕對作用，如ToPoⅡ可導(dǎo)致核酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)的破壞，對核酸代謝起到重要作用，影響基因重組、轉(zhuǎn)錄等，引起多藥耐藥；GST-π是一種具有滅毒與結(jié)合蛋白功能的同工酶，它不僅可以與親脂性細(xì)胞毒藥物結(jié)合增強(qiáng)其水溶性，還可以促進(jìn)細(xì)胞的自我修復(fù)，引起多藥耐藥。

Wnt/β-catenin信號通路是基于胞外Wnt蛋白、胞內(nèi)β-catenin蛋白及其下游因子以及胞膜上的受體共同組成的信號通路。β-catenin是一種多功能、可溶性糖蛋白，是細(xì)胞內(nèi)糖蛋白家族成員之一，具有激活Wnt作用，當(dāng)非磷酸化的β-catenin可由胞漿聚集后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)后，順序激活下游因子，影響腫瘤細(xì)胞的生理過程、轉(zhuǎn)錄順序、耐藥靶點(diǎn)變異、拮抗經(jīng)典途徑和細(xì)胞骨架重排等[7-8]，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞多藥耐藥發(fā)生。與此同時，活化后的Wnt基因可保護(hù)非磷酸化β-catenin 不被降解，加速上述影響發(fā)生。根據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道，Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、耐藥等方面起著重要作用。

p38MAPK信號通路是組成MAPK 信號通路的重要一環(huán)，其本質(zhì)是真核細(xì)胞內(nèi)的一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能被多種信號特別是絲裂原刺激激活，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)生理、病理的多種信號雙向傳導(dǎo)，影響細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等，其在腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和多藥耐藥過程中均起到重要作用。同時，活化的p38MAPK可通過干擾腫瘤細(xì)胞MDR及其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)、干擾凋亡以及干擾膜轉(zhuǎn)移來進(jìn)一步影響多藥耐藥程度。根據(jù)文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道，p38MAPK信號通路活性與腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性呈正相關(guān)。

從本研究可以得出，Wnt/β-catenin陽性表達(dá)率與患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤分化程度、腫瘤分期無關(guān)，雖與已知選定的多藥耐藥因子無相關(guān)性，但Wnt/β-catenin陽性表達(dá)率與胃癌化學(xué)治療預(yù)后生存期呈負(fù)相關(guān)，可能降低了化學(xué)治療藥物的多藥耐藥性；p38MAPK陽性表達(dá)情況在人胃癌組織中普遍存在，其陽性表達(dá)率與患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤分化程度、腫瘤分期無關(guān)，與已知多藥耐藥因子存在相關(guān)性，并與胃癌化學(xué)治療預(yù)后生存期呈正相關(guān)，可能降低了化學(xué)治療藥物的多藥耐藥性；但Wnt/β-catenin和p38MAPK表達(dá)率之間無相關(guān)性。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號通路及p38MAPK信號通路陽性表達(dá)是人胃癌組織中普遍存在的情況，盡管二者之間無相關(guān)性，但Wnt/β-catenin信號通路低表達(dá)及p38MAPK信號通路高表達(dá)仍是胃癌化學(xué)治療預(yù)后的有利因素，也可認(rèn)為是腫瘤多藥耐藥的不利因素。同時，需要注意的是，盡管目前對上述信號通道研究較為廣泛，但受困于無多中心橫向及腫瘤各階段縱向比較，仍不能完全闡明上述信號通路與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥各環(huán)節(jié)的普遍規(guī)律，特別是相關(guān)通路在腫瘤多藥耐藥過程中的干預(yù)機(jī)制值得進(jìn)一步探討，從而減弱甚至抵消腫瘤的多藥耐藥特性，提高腫瘤診治的綜合療效。

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The Correlation of the Expressions of the Wnt/β-catenin and P38MAPK Pathways with the Prognosis of Survival and Multidrug Resistance in Human Gastric Carcinoma

SunGang1,HanDayue1△,GuanHongwei2,SuiXin1,FuDapeng1.

1.The210thHospitalofChinesePeople′sLiberationArmy,Dalian116021,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China

Objective To evaluate the expression of the Wnt/β-catenin and p38MAPK in gastric carcinoma and investigate their relationship with the pathological condition, survival time after thermotherapy, and the related factors of multidrug resistance. Methods 91 patients with gastric carcinoma treated with radical surgery from November of 2007 to July of 2013 in The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University were selected as the research objects. The immunohistochemical method was used to assay the pathological specimen of the 91 patients with the same chemical treatment and the follow-ups. The data including the expressions of β-catenin, p38MAPK, ToPoⅡ and GST-π, the general and pathological condition of patients, and the survival prognosis were collected and analyzed. Results The positive expression rate of β-catenin and p38MAPK was not significantly correlated with age, gender, degree of tumor differentiation, and TNM staging respectively. After the same thermotherapy, the median survival time of the patients with the negative expression of β-catenin (26.5 months) was significantly longer than that of those with the positive expression (14.9 months) (P<0.05), while the median survival time of the patients with the positive expression of p38MAPK was significantly longer than that of those with the negative expression (P<0.05). According to the results of Log-rank analysis, the patients′ survival time after prognosis was negatively correlated with the positive expression rate of β-catenin (P<0.05) and positively correlated with the positive expression rate of p38MAPK (P<0.05); The positive expression rate of p38MAPK was positively correlated with that of GST-π and negatively correlated with that of ToPoⅡ, while the positive expression rate of β-catenin was not correlated with the positive expression rates of p38MAPK and ToPoⅡ respectively; and there were no correlation in the positive expression rate between β-catenin and p38MAPK. Conclusion The positive expression rates of β-catenin and p38MAPK are not correlated with age, gender, degree of tumor differentiation, and TNM staging respectively. The low positive expression of β-catenin and the high positive expression of p38MAPK are positively correlated with the survival time after prognosis and they may reduce the degree of multidrug resistance.

Wnt/β-catenin pathway; p38MAPK pathway; Human gastric carcinoma; Multidrug resistance

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170116.1701.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.007

R735.2

A

△通信作者：韓大躍，E-mail:handayue210@yeah.net