劉 巍,李 東,曾范利，李健明，時 坤，宗 穎，冷 雪，王春鳳，杜 銳,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；3.吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，吉林長春 130118)

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分支桿菌Rv0024誘導(dǎo)生物膜的形成和抗細(xì)胞壁作用研究進(jìn)展

劉 巍1,李 東1,曾范利2，李健明2，時 坤2，宗 穎2，冷 雪2，王春鳳1，杜 銳2,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；3.吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，吉林長春 130118)

多藥耐藥結(jié)核菌和廣泛耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)，使得結(jié)核病成為全球第二大傳染病。而生物膜的形成在幾個人類病原體發(fā)病機(jī)制作用是公認(rèn)的。然而，在結(jié)核分支桿菌感染情況下生物膜的作用和生物膜形成的遺傳因素仍然存在很大程度上的未知。論文通過查閱大量外文文獻(xiàn)闡述了細(xì)胞壁在結(jié)核分支桿菌中的耐藥機(jī)制，并且發(fā)現(xiàn)生物膜中 Rv0024為新的 NlpC/p60蛋白質(zhì)家族的一員，通過結(jié)核分支桿菌 Rv0024異位表達(dá)，編碼一個假定的肽酶，并且隨著抗結(jié)核藥物異煙肼和吡嗪酰胺耐藥性的出現(xiàn),生物膜形成的Rv0024也顯著增加。Rv0024可能在初次感染過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，參與宿主細(xì)胞的耐藥性產(chǎn)生。因此，Rv0024可作為治療肺結(jié)核的一個潛在的藥物靶標(biāo)進(jìn)行深入研究。

分支桿菌；Rv0024；生物膜；耐藥性

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是一種由結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的慢性感染性人獸共患病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的報告，全世界大約有1/3的人口感染了結(jié)核，并且每年約有800萬例新增的肺結(jié)核病例[1]。隨著抗結(jié)核化學(xué)藥物的使用，細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出了幾種耐藥性機(jī)制應(yīng)對大多數(shù)藥物。這些耐藥菌被分為多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)和廣泛耐藥(extensively drug resistantce,XDR)的結(jié)核分支桿菌菌株。多藥耐藥菌株至少耐受異煙肼(isonicotinic acid hydrazide,INH)和利福平(rifampicin,RIF)；廣泛耐藥菌株是對異煙肼和利福平耐藥，此外對任何氟喹諾酮類藥物二線注射藥物至少耐受1種[2]。研究表明，結(jié)核菌耐藥機(jī)制包括富含脂質(zhì)的疏水的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的存在，變異能力的藥物靶位點(diǎn)和細(xì)胞壁中特定的藥物外排泵的大量存在等[3]。許多細(xì)菌能產(chǎn)生生物膜，生物膜是表面附著在氣-液界面形成的膜，是細(xì)菌在不良環(huán)境中生存的保證[4]。生物膜相關(guān)感染是更持久的，能夠?qū)Υ蠖鄶?shù)抗生素耐藥，并產(chǎn)生更頑固的宿主免疫等。例如，銅綠假單胞菌生物膜的生長形成囊性纖維化結(jié)構(gòu)。尿道致病性大腸埃希菌，引起尿路感染，已被證明在小鼠生物膜中形成?；魜y弧菌、葡萄球菌、鏈球菌及其他一些細(xì)菌病原體已經(jīng)形成生物膜[5-6]。鑒于全球抗結(jié)核藥物的耐藥性的驚人上升，新的藥物靶標(biāo)的識別對結(jié)核病未來的控制是至關(guān)重要的。

1 結(jié)核分支桿菌Rv0024基因結(jié)構(gòu)學(xué)分析

Rv0024編碼肽鏈內(nèi)切酶，被發(fā)現(xiàn)是Rvmc4操縱子的一部分(webtb.org數(shù)據(jù)庫)[7-8]。這個操縱子的功能尚不清楚。操縱子存在其他未知的基因，如Rv0024、Rv0025、Rv0026。Rv0025是一個保守的假定蛋白，與Rv0739具有很高的同源性?；赪eb的比較基因組學(xué)工具的功能分析搜索表明，Rv0739編碼一種膜蛋白調(diào)節(jié)生物被膜支持蛋白[9]。進(jìn)一步的分析表明Rv0024域的N末端假定NlpC-p60肽鏈內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的存在。序列同源性分析表明，存在一個保守的序列“195- FDCSGLVQW-203”，這是內(nèi)肽酶家族，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞壁肽聚糖水解酶活性，多序列比對和BLAST結(jié)果顯示70%以上的蛋白質(zhì)序列存在同源性，并且與潰瘍分支桿菌假想蛋白發(fā)揮相同的導(dǎo)致皮膚潰瘍的發(fā)病機(jī)制[10]。

2 Rv0024誘導(dǎo)生物膜的形成及抗結(jié)核藥物作用

分支桿菌屬的恥垢分支桿菌、牛分支桿菌、海分支桿菌及其他物種生物膜形成的有關(guān)方面已被確定。然而，在遺傳條件和分子方向，生物膜的形成在感染結(jié)核分支桿菌中起到的作用沒有得到很好的研究。初步研究表明，在使用異煙肼和利福平治療藥物耐受性結(jié)核分支桿菌7 d后耐藥性比例顯著[11]。此外，在感染豚鼠肉芽腫抗結(jié)核藥物治療后發(fā)現(xiàn)細(xì)菌耐藥性的微團(tuán)聚體。一些研究已經(jīng)表明，結(jié)核分支桿菌細(xì)胞壁的脂質(zhì)主要是負(fù)責(zé)生物膜的形成。在恥垢分支桿菌缺乏突變Msmeg-1529水解酶，lsr2或霉菌酸生物合成缺陷是形成生物膜受損與耐藥性有關(guān)。此外，哺乳動物細(xì)胞組成的分泌/輸出蛋白操縱子對細(xì)菌細(xì)胞表面性質(zhì)起到改變和維護(hù)的作用，從而改變表型性狀如菌落形態(tài)、生物膜的形成[12]?？傊?，結(jié)核分支桿菌參與細(xì)胞壁的生物合成途徑似乎對生物膜的形成是很重要的。它已經(jīng)表明，結(jié)核桿菌可形成生物膜。這些體外生物膜被證明是富有自由分支菌酸同時存在耐藥細(xì)胞[13-18]。

通過其他細(xì)菌的研究表明，在單核細(xì)胞增生李斯特菌、枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌NlpC/p60蛋白家族在細(xì)胞壁動力學(xué)中有廣泛的作用[20]。肽聚糖水解活性蛋白酶編碼家族，幫助細(xì)胞壁重組和細(xì)胞分裂。與結(jié)核分支桿菌基因組的多序列比對表明，有5種蛋白的存在，即Rv0024、Rv1477、Rv1478、Rv1566c及Rv2190。研究表明，刪除Rv2190后體內(nèi)和體外細(xì)菌的生長均受損，脂質(zhì)成分改變，菌落形態(tài)改變及對細(xì)胞壁作用劑如溶菌酶的敏感性下降，表明其在細(xì)胞壁的裝配和生長中發(fā)揮作用[21]。復(fù)蘇促進(jìn)因子相互作用的合作伙伴(RipA)由Rv1477編碼，已被確定為室間隔形成及對細(xì)胞壁作用抗生素的耐藥性產(chǎn)生的一個必要因素。同樣，另一種蛋白屬于同一操縱子Rv1478(RipB)對肽聚糖重塑親和力發(fā)揮作用。有報道發(fā)現(xiàn)，Rv1566c編碼非催化肽聚糖[22]，在Msm中與生物膜的形成，與宿主細(xì)胞的黏附，改變菌落形態(tài)有關(guān)。入侵檢測的情況下，觀察無顯著差異。這些生物膜被認(rèn)為是通過抗細(xì)胞壁作用而發(fā)揮作用的抗結(jié)核藥物。

MsmRv0024的表達(dá)不改變細(xì)胞形態(tài)并且MsmRv0024表達(dá)增加薄膜的形成，psmt3和MsmRv0024菌株在沒有吐溫-80的培養(yǎng)條件下能形成生物膜。MsmRv0024在抗生素存在的情況下有更多生物膜形成。由于細(xì)胞表面疏水性是決定細(xì)胞黏附特性的重要因素，在生物膜形成和抗藥性中起重要作用，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)MsmRv0024的疏水性在抗生素治療后不發(fā)生改變。psmt3和 MsmRv0024在存在及不存在異煙肼和吡嗪酰胺的Sauton液體介質(zhì)中生長5 d[23-25]。然后計(jì)算每個細(xì)胞的聚集指數(shù)計(jì)算聚集細(xì)胞與分散細(xì)胞的比率。通過比較上清與培養(yǎng)前初始值甲苯吸收測定(OD 595 nm)得到疏水性的比率，我們發(fā)現(xiàn)在類似的條件下MsmRv0024 與psmt3相比疏水性指數(shù)有約40倍的增長(P<0.01)，表明MsmRv0024生物膜形成可能是由于表面疏水性增加。

結(jié)核分支桿菌具有抗環(huán)境壓力和抵抗抗菌藥物包括抗生素的能力。耐藥性出現(xiàn)的各種機(jī)制已逐漸被發(fā)現(xiàn)，生物膜的形成便是其中之一。然而，關(guān)于生物膜的形成和導(dǎo)致耐藥性的遺傳因素研究甚少。在體外條件下發(fā)現(xiàn)幾個分支桿菌菌株存在多細(xì)胞群體聚集現(xiàn)象，并且生物膜缺陷的突變體被發(fā)現(xiàn)有受損的侵襲跡象，隨著疾病發(fā)展生物膜被作為藥物耐藥的持久抗藥安全住所[9-10，12]。研究表明結(jié)核分支桿菌的Rv0024含有在結(jié)核分支桿菌中高度保守的NlpC/p60域，參與生物膜的形成，在初步形成感染時有所幫助，是一種重要的毒力因子。結(jié)核分支桿菌CDC1551、牛分支桿菌和海分支桿菌的基因組也包含Rv0024同源基因，但沒有出現(xiàn)同源基因在Msm基因組改變而導(dǎo)致表型變化，這表明重組Msm應(yīng)變會導(dǎo)致的Rv0024異位表達(dá)。

肽聚糖水解酶在細(xì)胞壁代謝和肽聚糖降解過程中發(fā)揮重要作用，在肽聚糖循環(huán)和細(xì)胞分離中有重要的作用[18]。已發(fā)現(xiàn)結(jié)核分支桿菌脂質(zhì)在致病中起重要作用，主要是改變了形態(tài)，如細(xì)胞聚集模式。研究表明Rv0024可能是通過改變分支桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)與細(xì)胞壁組件及細(xì)菌復(fù)制來發(fā)揮作用。以往的研究已經(jīng)表明，刪除結(jié)核分支桿菌的另一個相同的水解酶家族成員Rv2190，導(dǎo)致結(jié)核菌變異，在細(xì)胞分裂中細(xì)胞壁的位移和分隔過程也受影響[20]。此序列已在許多NlpC/p60家族成員包括Rv1566c和Rv2190C中觀察到，但在Rv0024卻未出現(xiàn)[25]。在Rv0024中缺失也可能是MsmRv0024應(yīng)變沒有侵入宿主細(xì)胞的原因，如RGD序列介導(dǎo)的初始結(jié)合到細(xì)胞表面的整合素受體[26]。

研究表明，MsmRv0024能在固體、液體與空氣的界面形成生物膜。脂質(zhì)豐富的細(xì)胞外基質(zhì)包括豐富的分枝菌酸和其他脂肪，通常是在生物膜中的細(xì)菌細(xì)胞壁形成[18]。因此，可以推測為增強(qiáng)生物膜的形成可能增加聚合物分泌物或MsmRv0024細(xì)菌細(xì)胞壁相關(guān)的脂質(zhì)成分改變。如蠟樣芽胞桿菌的CwpFM肽酶，這表明NlpC/p60域編碼蛋白參與生物膜的形成[25]。

細(xì)菌黏附到宿主細(xì)胞是宿主細(xì)胞感染建立的關(guān)鍵步驟。當(dāng)肺上皮細(xì)胞表面感染1 h后MsmRv0024黏附性增加，此數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持其作用是生物膜和細(xì)胞黏附肽的形成。有研究表明，蠟樣芽胞桿菌CwpFM和P60單增李斯特菌分別參與增加HeLa細(xì)胞和腸細(xì)胞的黏附性[26]。然而，MsmRv0024應(yīng)變與對照菌株相比侵襲力增強(qiáng)可能是由于缺乏Rv0024蛋白RGD域。

耐藥性與生物膜的形成是密切相關(guān)的。MsmRv0024生物膜的發(fā)現(xiàn)，即使長期暴露于INH和吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)產(chǎn)生耐藥后，兩細(xì)胞壁的特異性抗結(jié)核藥物對脂肪酸合成酶的作用復(fù)雜。結(jié)核分支桿菌和鏈球菌Rv1477 p60家族蛋白的缺失增加對環(huán)丙沙星、溶菌酶及其他抗生素的敏感性[22-23]。抗生素耐藥性生物膜的作用是依賴于諸如限制滲透等多重因素的影響及增長率下降和耐藥基因的表達(dá)[24]?？股氐哪退幮栽黾?，可能是由于防滲屏障MsmRv0024生物膜的形成，這可能會阻礙滲透抗生素。這樣的MsmRv0024株對INH和PZA長期治療后耐藥可以解釋為由于生物膜的形成，是一種抗藥性種群的避風(fēng)港。inhA基因，可編碼一種載體蛋白還原酶，有阻斷脂肪酸合成酶復(fù)合物的形成抑制分支菌酸合成的作用[25]。inhA基因缺失會導(dǎo)致霉菌酸酯或血脂的變化，這決定了生物膜形成能力[14]。同樣，pncA編碼吡嗪酰胺酶也被稱為抑制脂肪酸合成酶[26]。未來的研究方向，可以從建立生物膜的形成和突變的靶基因與導(dǎo)致抗生素耐藥性之間的關(guān)系入手。

細(xì)胞表面疏水性是決定細(xì)菌黏附到宿主細(xì)胞的關(guān)鍵因素[20]。結(jié)核菌增加表面上的黏附力導(dǎo)致形成生物膜和耐藥性。不像其他的細(xì)菌如銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌抗菌藥物治療的疏水性下降。這種增加表面疏水性可能會導(dǎo)致更多的生物膜形成，細(xì)菌通過表面黏附，從而形成一個不透水層的聚集在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的聚集的細(xì)菌阻遏了抗生素擴(kuò)散通過。這與之前的發(fā)現(xiàn)，增加鏈球菌表面疏水性分離株耐藥性直接相關(guān)?？傊?，Rv0024為結(jié)核分支桿菌NlpC/p60蛋白家族的第5成員主要參與生物膜的形成和耐藥性。

3 展望

結(jié)核病(肺結(jié)核)的發(fā)生對全球經(jīng)濟(jì)和人類健康造成了巨大的威脅，全球估計(jì)每年有1 000萬患者。它也被列為傳染病中第二大死亡因素，每年約有130萬人死亡，對人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著目前一線藥物的使用，結(jié)核病的發(fā)病情況曾一度緩解，但近幾年廣泛耐藥和多藥耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)，結(jié)核病重新又成為了威脅人類健康的重大疾病[18-19]。本文通過查閱和閱讀大量外文文獻(xiàn)及分析相關(guān)試驗(yàn)驗(yàn)數(shù)據(jù)，闡述了細(xì)胞壁對耐藥結(jié)核分支桿菌的作用機(jī)制，對結(jié)核分支桿菌基因組的Rv0024基因結(jié)構(gòu)學(xué)分析推測恥垢分支桿菌Rv0024的表達(dá)可能不改變細(xì)胞形態(tài)。同時，Msm Rv0024表達(dá)增加了薄膜和生物膜的形成，推測生物膜的形成導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生的原因可能是由于膜的疏水性的改變。Rv0024為結(jié)核分支桿菌NlpC/p60蛋白家族的第五成員，推測其主要參與結(jié)核分支桿菌生物膜的形成和耐藥性產(chǎn)生。因此，Rv0024可作為一個新的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究，為抗結(jié)核藥物的研發(fā)和結(jié)核病的治療開辟一個新的方向。

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Progress on Rv0024 Induced Biofilm Formation and Resistance against Cell Wall Acting inMycobacterium

LIU Wei1,LI Dong1,ZENG Fan-li2,LI Jian-ming2,SHI Kun2,ZONG Ying2, LENG Xue2,WANG Chun-feng1,DU rui2,3

(1.CollegeofAnimalScience&Technology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China; 2.CollegeofChineseMedicineMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China; 3.JilinProvinceSikaDeerProductionandApplicationLab,Changchun,Jilin,130118,China)

Along with the emergence of multidrug-resistant tuberculosis and extensively drug-resistant tuberculosis,tuberculosis has become the world's second largest infectious disease.Role of biofilms in the pathogenesis of several human pathogens is well established.However,in case ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) infection,the role of biofilms and the genetic requirements for biofilm formation remains largely unknown.In this paper,we refer to a large number of foreign literature and expound the resistance mechanism of cell wall inMycobacteriumtuberculosis,discovery of Rv0024 as a member of the new NlpC/p60 protein family,the expression of MTB Rv0024,encoding a putative peptidoglycan amidase.Along with the emergence of drug resistance and antituberculosis drug isoniazid and pyrazinamide,the biofilm formation of Rv0024 also increased significantly.Rv0024 may play a critical role in initial infection process,adherence to host cells and drug resistance.Thus,Rv0024 may be considered as a potential drug target for the treatment of tuberculosis.

Mycobacterium;Rv0024; biofilms; antimicrobial resistance

2017-01-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372436)；吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204028NY)；吉林省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20160209006YY)；吉林省科技廳產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟項(xiàng)目(20140309018YY)

劉 巍(1990-)，男，吉林白城人，碩士研究生，主要從事經(jīng)濟(jì)動物疫病研究。*通訊作者

S852.618

A

1007-5038(2017)07-0070-04

文獻(xiàn)綜述