戴青，于麗娜，張璐，韓寧寧，徐嫄，趙暉(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

硫酸安普霉素可溶性粉中非法添加乙酰甲喹的HPLC-PDA檢測(cè)方法的建立

戴青，于麗娜，張璐，韓寧寧，徐嫄，趙暉*
(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為檢測(cè)硫酸安普霉素可溶性粉中非法添加的乙酰甲喹，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉3.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺0.5 mL，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0)-甲醇為流動(dòng)相，二極管陣列檢測(cè)器(PDA)，建立了HPLC-PDA檢測(cè)方法，并采用峰純度檢查和光譜相似度檢查輔助對(duì)照品比對(duì)方法，對(duì)非法添加藥物進(jìn)行確證。在此液相色譜條件下，乙酰甲喹與其他物質(zhì)峰分離良好。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，乙酰甲喹的平均回收率為98.1%，RSD為0.3%。該檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于測(cè)定硫酸安普霉素可溶性粉中非法添加的乙酰甲喹。

硫酸安普霉素可溶性粉；乙酰甲喹；峰純度檢查；光譜相似度檢查

硫酸安普霉素是一種氨基糖苷類抗生素，其抗菌譜廣，獸醫(yī)臨床上廣泛用于治療畜禽大腸桿菌和沙門(mén)氏菌引起的腹瀉。近年來(lái)，有些不法廠家為使獸藥達(dá)到迅速起效等目的，在獸藥產(chǎn)品中非法添加化學(xué)藥物，從而提高銷量來(lái)獲取更大利潤(rùn)，這種行為不僅擾亂了獸藥市場(chǎng)，也為動(dòng)物源性食品安全埋下隱患[1-2]。乙酰甲喹是我國(guó)最早合成的一種喹噁啉類藥物，可改變動(dòng)物腸道菌群，增加動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，具有廣譜抗菌活性，主要用于密螺旋體所致的豬痢疾和細(xì)菌性腸炎[3]。近年來(lái)，由于乙酰甲喹的不合理使用，中毒事件時(shí)有發(fā)生[4]。在監(jiān)督抽檢中，通過(guò)篩查發(fā)現(xiàn)有廠家在硫酸安普霉素可溶性粉中非法添加了乙酰甲喹，但目前尚沒(méi)有現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)可用于該項(xiàng)檢測(cè)。因此，本研究參考已建立的相關(guān)檢測(cè)方法[5]，選擇乙酰甲喹為測(cè)試藥物，硫酸安普霉素可溶性粉為目標(biāo)制劑，建立了硫酸安普霉素可溶性粉中非法添加乙酰甲喹的HPLC-PDA檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Waters 2695)；PDA(Waters 996)；分析天平(梅特勒AX 205，十萬(wàn)分之一)；三乙胺、甲醇為色譜純。

1.2 試藥 乙酰甲喹對(duì)照品(批號(hào)：H0111505，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，99.6%)；供試品空白：經(jīng)檢測(cè)合格的某市售硫酸安普霉素可溶性粉；供試品：某企業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)初篩含有乙酰甲喹非法添加的硫酸安普霉素可溶性粉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉3.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺0.5 mL，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0)-甲醇(70∶30)為流動(dòng)相；PDA；采集波長(zhǎng)范圍為200～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄376 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。乙酰甲喹色譜峰與相鄰色譜峰分離度應(yīng)符合要求。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液和對(duì)照品溶液 取供試品1.0 g，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，超聲5 min，靜置，濾過(guò)；取續(xù)濾液5.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取乙酰甲喹對(duì)照品10 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液 取乙酰甲喹對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成含乙酰甲喹0.1 mg/mL的溶液，按2.1項(xiàng)方法測(cè)定。系統(tǒng)適用性色譜光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性色譜光譜圖

2.2.3 硫酸安普霉素可溶性粉空白溶液 取供試品空白1.0 g，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，超聲5 min，靜置，濾過(guò)；取續(xù)濾液5.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備成供試品空白溶液。按2.1項(xiàng)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2，表明供試品基質(zhì)對(duì)待測(cè)物乙酰甲喹沒(méi)有干擾。

圖2 供試品空白溶液色譜圖

2.2.4 建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液 以乙酰甲喹對(duì)照品溶液作為建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液。

2.3 峰純度檢查 取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。對(duì)供試品溶液色譜圖中乙酰甲喹色譜峰進(jìn)行峰純度檢查，結(jié)果見(jiàn)圖3和表1。結(jié)果顯示，乙酰甲喹峰的純度角度小于純度閾值，表明在此液相色譜條件下，乙酰甲喹的出峰處無(wú)其他干擾峰，為單一物質(zhì)峰，方法可行。

2.4 光譜相似度檢查 對(duì)供試品溶液中乙酰甲喹的光譜圖與對(duì)照品溶液進(jìn)行匹配，結(jié)果見(jiàn)表1與圖3～圖4。數(shù)據(jù)顯示，供試品溶液中保留時(shí)間9.084 min的色譜圖與乙酰甲喹對(duì)照品保留時(shí)間一致，且與對(duì)照品的光譜圖及最大吸收波長(zhǎng)一致，匹配角度小于匹配閾值。表明供試品溶液中相應(yīng)色譜峰的色譜、光譜與乙酰甲喹對(duì)照品的色譜、光譜一致，為同一物質(zhì)。

圖3 供試品溶液色譜光譜圖

圖4 乙酰甲喹對(duì)照品色譜光譜圖

表1 供試品峰純度及光譜相似度檢查結(jié)果

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性 通過(guò)供試品空白試驗(yàn)排除樣品基質(zhì)對(duì)乙酰甲喹的干擾，同時(shí)，峰純度檢查結(jié)果也顯示在此色譜條件下乙酰甲喹的出峰為單一物質(zhì)峰。

2.5.2 耐用性 從柱溫、流動(dòng)相pH值、色譜柱三個(gè)方面考察方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫分別為20℃、25 ℃、30 ℃，結(jié)果顯示：隨柱溫升高，乙酰甲喹保留時(shí)間略提前；調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值為6.8、7.0、7.2，結(jié)果顯示：隨流動(dòng)相pH值的增大，乙酰甲喹保留時(shí)間基本不變；選擇3款不同品牌色譜柱，以系統(tǒng)適用性溶液作為供試溶液，考察不同色譜柱對(duì)測(cè)定的影響，結(jié)果如表2所示：3種品牌色譜柱均可用于該檢查，方法耐用性較好。

表2 3種色譜柱耐用性考察結(jié)果

2.5.3 檢出限 檢出限溶液配制：取乙酰甲喹對(duì)照品適量，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，取供試品空白1.0 g，置100 mL

量瓶中，加甲醇適量，超聲5 min，冷卻至室溫，精密加入1 mg/mL的儲(chǔ)備液適量(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL)，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢出限，乙酰甲喹檢出限為0.6 g/kg。2.5.4 線性與范圍 取乙酰甲喹對(duì)照品適量，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，分別量取0.5、1、2、4、8、10 mL于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，測(cè)定。以峰面積y對(duì)濃度x進(jìn)行線性回歸(圖5)，乙酰甲喹的回歸方程分別為：y=33512x+658.4，r2=1。結(jié)果表明，乙酰甲喹在5～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.5 準(zhǔn)確度 以供試品空白加被測(cè)物對(duì)照品做回收率試驗(yàn)來(lái)考察方法的準(zhǔn)確度?；厥章试囼?yàn)溶液配制：分別稱取供試品空白1.0 g，乙酰甲喹對(duì)照品5 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，超聲5 min，靜置，濾過(guò)；取續(xù)濾液5.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制6份，結(jié)果見(jiàn)表3。乙酰甲喹回收率為98.1%，RSD為0.3%。

圖5 乙酰甲喹線性圖

3 討論與小結(jié)

農(nóng)業(yè)部2333號(hào)公告硫酸黏菌素預(yù)混劑中非法添加乙酰甲喹檢查方法中檢測(cè)波長(zhǎng)為376 nm，本試驗(yàn)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)乙酰甲喹對(duì)照品進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示乙酰甲喹在376 nm處有較強(qiáng)吸收，因此本試驗(yàn)采用該波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，乙酰甲喹色譜峰與相鄰色譜峰分離度好，響應(yīng)值高，能夠很好滿足試驗(yàn)要求。此外，向流動(dòng)相中添加三乙胺，不僅可以調(diào)節(jié)pH值，增強(qiáng)乙酰甲喹的保留，避免其過(guò)快洗脫，還可以改善峰形，減少拖尾。

表3 回收率結(jié)果

采用本檢測(cè)方法用于其他獸藥制劑中非法添加乙酰甲喹的檢查時(shí)，需進(jìn)行空白試驗(yàn)和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，確保供試品溶液中乙酰甲喹色譜峰與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)符合要求，從而確定目標(biāo)分析物以外的成分不會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾，必要時(shí)可調(diào)整供試品溶液或?qū)φ掌啡芤旱臐舛?，使二者目?biāo)分析物的峰面積盡量接近，以便于檢測(cè)和確認(rèn)。

目前國(guó)外主要采用LC-MS/MS法對(duì)乙酰甲喹代謝產(chǎn)物[6]進(jìn)行研究，國(guó)內(nèi)主要是對(duì)獸藥制劑和飼料中非法添加乙酰甲喹進(jìn)行測(cè)定，多采用HPLC法[7]。本方法采用高效液相色譜法結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜條件等進(jìn)行考察，在本檢測(cè)方法色譜系統(tǒng)中，硫酸安普霉素?zé)o紫外吸收，對(duì)檢出無(wú)干擾，因此可通過(guò)供試品峰與對(duì)照品峰的保留時(shí)間、峰純度及光譜特征的對(duì)比來(lái)確定硫酸安普霉素可溶性粉中是否添加了乙酰甲喹，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，為有效遏制獸藥非法添加行為提供了一定技術(shù)支持。

[1] 董玲玲，范強(qiáng)，楊星，等. 氟苯尼考粉中非法添加煙酰胺和氨茶堿的HPLC-PDA檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2014，48(5)：47-50.

[2] 龔旭昊，王靜文，董玲玲，等. 魚(yú)腥草注射液中非法添加水楊酸和氧氟沙星HPLC-PDA檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2016，50(2)：37-40.

[3] 李璐璐，駱延波，劉玉慶，等. 乙酰甲喹和喹烯酮藥動(dòng)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)抗生素雜志，2016，41(2)：98-103.

[4] 劉迎春，高懷濤. 乙酰甲喹的合理應(yīng)用[J]. 養(yǎng)禽與禽病防治，2009，(3)：42-43.

[5] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部．公告第2333號(hào)[S].

[6] Yanshen Li，Kaili Liu，Rose C Beier. Simultaneous determination of mequindox, quinocetone, and their major metabolites in chicken and pork by UPLC-MS/MS[J]. Food Chemistry，2014，160(10)：171-179.

[7] 吳寧鵬，王麗景，李慧素，等. 五種獸藥中非法添加喹乙醇和乙酰甲喹的HPLC-PDA檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2014，48(12)：43-49.

(編輯：侯向輝)

A method for the determination of mequindox in the apramycin sulfate soluble powder was developed by the high performance liquid chromatography with photo-diode array detector (HPLC-PDA). It was tested with C18 column, using phosphate buffer solution (taking the sodium dihydrogen phosphate 3.0 g, add 1000 mL water to dissolve, and add 0.5 mL triethylamine, adjusting pH to 7.0 by sodium hydroxide saturated solution) and methanol as the mobile phase. Peak purity test and spectrum similar test were helped to identify the mequindox. The mean recovery of mequindox was 98.1%, andRSDwas 0.3%, respectively. In conclusion, the method is simple, accurate and reliable for the determination of mequindox in apramycin sulfate soluble powder.

apramycin sulfate soluble powder; mequindox; peak purity test; spectrum similar test

戴青，碩士，從事抗生素檢驗(yàn)檢測(cè)工作。

趙暉。E-mail: 171977364@qq.com

2016-09-04

A

1002-1280 (2017) 02-0019-05

S859.83

Determination of Mequindox in Apramycin Sulfate Soluble Powder by HPLC-PDA

DAI Qing，YU Li-na，ZHANG Lu，HAN Ning-ning，XU Yuan，ZHAO Hui*
(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl，Beijing100081，China)