陳錫龍(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽(yáng) 550003)

高效液相色譜法測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶的含量

陳錫龍
(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽(yáng) 550003)

建立了獸藥磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中磺胺間甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測(cè)定法。以C18為固定相，0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量?；前烽g甲氧嘧啶的線性范圍為5.0～100.0 μg/mL，回歸方程為Area=40.333×Amt-18.843 (n=5)，相關(guān)系數(shù)大于0.999。從高(120%)、中(100%)和低(80%)三個(gè)添加水平的檢測(cè)結(jié)果可以看出，磺胺間甲氧嘧啶的回收率為96.27%～98.30%。該方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，精密度好，回收率高，可以用于測(cè)量磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中磺胺間甲氧嘧啶的含量。

磺胺間甲氧嘧啶；含量；高效液相色譜法

目前，獸用藥品磺胺間甲氧嘧啶(C11H12N4O3)(鈉)的含量測(cè)定采用永停滴定法[1-2],相對(duì)于高效液相色譜法，永停滴定法較繁瑣、耗時(shí)，且不利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)藥品中的其他非法添加成分。采用高效液相色譜法測(cè)定獸藥含量是檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的未來(lái)趨勢(shì)，也是提高檢測(cè)效率的必然要求。本研究建立了磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中磺胺間甲氧嘧啶鈉(以磺胺間甲氧嘧啶計(jì))含量的高效液相色譜測(cè)定法，并根據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》對(duì)新建立方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、精密度、專屬性、耐用性及線性等進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 儀器和試藥 Agilent 1260 infinity 高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器)；BP211D型電子分析天平(德國(guó)塞多利斯公司)；超聲波清洗器(KQ-300DE,昆山市超聲儀器廠)；磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,批號(hào)：C0031007，含量：99.4%)；磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液分別由四川維爾康動(dòng)物藥業(yè)有限公司、成都博大金點(diǎn)生物技術(shù)有限公司和四川好益多動(dòng)物保健品有限公司提供(批號(hào)分別為：20150601，20151218，20160201；標(biāo)示含量為：10 mL:1 g、10 mL:1 g和10mL：0.5g)；乙腈為色譜純；水為高純水；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB C18(5 μm， 4.6 mm×250 mm)；柱溫為40 ℃；流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣體積10 μL。在此色譜條件下，對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品溶液色譜圖(100 μg/mL)

圖2 磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液供試樣品溶液色譜圖(100 μg/mL)

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品50 mg，置50 mL量瓶中，加鹽酸1 mL溶解后，再加水稀釋至刻度，混勻，即得濃度為1.0 mg/mL的磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品貯備液。精密量取1.0 mg/mL的磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品貯備液10 mL置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得100 μg/mL的磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液適量，置于100 mL容量瓶中，加2 mL鹽酸溶解后，再加水稀釋至刻度，混勻。然后，按標(biāo)示量稀釋制成100 μg/mL的溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍 精密量取1.0 mg/mL的磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品貯備液0.5、1、2、5、10 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，得含磺胺間甲氧嘧啶濃度分別為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL的對(duì)照溶液系列。精密吸取各對(duì)照溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，分別進(jìn)樣兩針?；前烽g甲氧嘧啶濃度在5.0～100.0 μg/mL范圍內(nèi)，色譜峰有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Area=40.333×Amt-18.843，相關(guān)系數(shù)大于0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表

2.2 精密度 取C公司提供的批號(hào)為20151218的磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液，精密量取1000 μL,置100 mL容量瓶中，按1.2.3項(xiàng)制備成供試品溶液，分別作6個(gè)平行，每個(gè)樣品進(jìn)樣1針，進(jìn)行含量測(cè)定。以測(cè)定結(jié)果峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示試驗(yàn)的精密度，精密度RSD為1.10%，表明方法的精密度良好(表2)。

表2 精密度及含量測(cè)量結(jié)果

2.3 準(zhǔn)確度 精密量取批號(hào)為20150601的磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液500 μL，按高(120%)、中(100%)和低(80%)三個(gè)濃度水平分別添加磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，制得向已知含量制劑中添加已知測(cè)定物的添加樣品，每個(gè)濃度水平的添加樣品分別制備3份供試樣。按1.2.3項(xiàng)制成供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定。以磺胺間甲氧嘧啶的實(shí)際測(cè)定含量和理論含量(制劑中磺胺間甲氧嘧啶的已有量+添加量)的比值計(jì)算磺胺間甲氧嘧啶的回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，三個(gè)不同添加水平的磺胺間甲氧嘧啶的回收率均在96.27%～98.30%之間，方法符合《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》。

表3 準(zhǔn)確度測(cè)量結(jié)果

回收率R(%)=實(shí)測(cè)平均含量/理論含量×100%

2.4 耐用性 取按準(zhǔn)確度測(cè)定項(xiàng)下制得的樣品，保持流動(dòng)相比例和流速不變，在Shimadzu LC2010及Agilent 1260 infinity 色譜儀上分別使用Phenomenex Luna C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)和Zorbax SB C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)色譜柱于40 ℃條件下進(jìn)行測(cè)試，考察方法的耐用性，結(jié)果表明,使用不同的儀器和色譜柱在相同的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得的含量的相對(duì)偏差不大于0.5%，耐用性良好。

2.5 專屬性 在磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液樣品測(cè)試色譜圖中，標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間附近均未發(fā)現(xiàn)明顯的干擾峰，可見(jiàn)方法的專屬性良好。

2.6 穩(wěn)定性 取100 μg/mL的磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品溶液分別于約0、24、48 h測(cè)定含量，以峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，磺胺間甲氧嘧啶的RSD為0.38%，說(shuō)明磺胺間甲氧嘧啶溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 含量測(cè)定 取批號(hào)為20150601、20151228和20160201的三批企業(yè)樣品，分別測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶鈉的含量，按以上方法測(cè)定計(jì)算，結(jié)果表明該3批樣品的平均含量分別為標(biāo)示含量的101.6%、96.3%和101.8%，而使用現(xiàn)行獸藥典方法測(cè)得的結(jié)果分別為102.4%、97.8%和103.4%。

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)量磺胺類藥物的高效液相色譜法所使用的流動(dòng)相系統(tǒng)有0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18)[1]、乙腈-甲醇-水-乙酸(2+2+9+0.2)[3]、0.017 mol/L磷酸-乙腈(80+20)[4]、磷酸鹽溶液-甲醇(65+35)[5]等，柱溫主要有30 ℃、40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)多為270 nm[6-7]、230 nm[1, 8]。在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，磺胺間甲氧嘧啶最大吸收峰為295、250、230 nm，在285、270、215 nm處均有較強(qiáng)吸收峰。為盡量保持磺胺類藥物液相色譜檢測(cè)方法的一致性，同時(shí)也能夠獲得較好的分離效果，選擇270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，40 ℃作為色譜柱柱溫，0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)作為流動(dòng)相。使用此色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，磺胺間甲氧嘧啶的出峰時(shí)間適當(dāng)，峰形良好。

3.2 樣品提取方法的優(yōu)化 在進(jìn)行樣品處理的過(guò)程中，分別采用1 mL、3 mL鹽酸，1 mL、3 mL 20 g/L NaOH溶液，少量乙腈等溶解樣品，然后再加水定容。發(fā)現(xiàn)采用1 mL鹽酸溶解處理樣品后峰形最佳且測(cè)量的偏差最小，故選擇使用1 mL的鹽酸溶解處理樣品后再加水定容?；前烽g甲氧嘧啶鈉注射液加入鹽酸處理時(shí)首先會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，鹽酸過(guò)量后白色沉淀會(huì)重新溶解。

本研究建立了磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中磺胺間甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測(cè)定法是可行的，各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)均比較理想，可以作為磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中磺胺間甲氧嘧啶質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 中國(guó)獸藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)[M]．二O一O年版. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.[2] 農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心,獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編——獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(第一冊(cè))[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.2010：87-90

[3] 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸藥殘留檢驗(yàn)操作規(guī)程CJCZ020[Z]．

[4] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.農(nóng)牧發(fā)[2001]38號(hào)文件[S].

[5] 耿士偉，曲斌，姜加華，等．QuEChERS-UPLC-MS/MS快速測(cè)定雞肝中七種磺胺類藥物殘留[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2011, 45(10) : 16-19.

[6] 查玉兵，陳美，王曉芳，等．高效液相色譜法測(cè)定豬肉中五種磺胺類藥物殘留量[J]. 分析儀器，2008，(4): 44-45.

[7] 陳錫龍. HPLC法測(cè)定復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量[J].中國(guó)獸藥雜志, 2014, 48(7):30-33.

[8] 楊武寧，崔艷莉. HPLC法測(cè)定復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶鈉可溶性粉含量[J].中國(guó)動(dòng)物保健, 2013, 15(8): 30-32.

(編輯：侯向輝)

Determination of Sulfamonomethoxine by HPLC

CHEN Xi-long
(GuizhouProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrugandFeeds,Guiyang550003,China)

An HPLC method has been developed to determine the content of sulfamonomethoxine in sulfamonomethoxine sodium injection, using C18 column as stationary phase, with a mobile phase of 0.1% phosphoric solution-acetonitrile (80∶20) and wavelength of 270 nm. It was quantified by external standard method and the linear range of sulfamonomethoxine was between 5.0 and 100.0 μg/mL. And the regression equation wasArea=40.333×Amt-18.843 (n=5) with the correlation to be more than 0.999. The average recoveries at three different levels of 120%, 100% and 80% of the sample ranged between 96.27% and 98.30%. This method was simple and accurate, and had a good precision and high recoveries as well, could be used for determination of sulfamonomethoxine in sulfamonomethoxine sodium injection.

sulfamonomethoxine; content; HPLC

陳錫龍, 高級(jí)獸醫(yī)師，從事獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)及相關(guān)研究。E-mail: cxlofyjs@163.com

2016-10-08

A

1002-1280 (2017) 02-0016-04

S859.2