鄭煒煒 宋 革 吳 崢 劉善文 祝曉麗 譚玉梅

廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（廣州，510060）

調(diào)查顯示目前我國育齡夫婦中不孕不育夫婦比例約為10%～15%［1］，其中男性因素約30%～40%，而無精子癥約占男性不育的7%～14%［2］。對(duì)于不可逆的無精子癥患者合并女方不孕因素在經(jīng)供精人工授精（AID）治療無效后轉(zhuǎn)診行常規(guī)體外受精－胚胎移植（IVF－ET）的不在少數(shù)。已有大量文獻(xiàn)研究了供精人工授精的精液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但供精精液用于常規(guī)體外授精的研究較少。授精時(shí)的精子濃度不僅影響受精率還可能影響胚胎的發(fā)育及妊娠的結(jié)局。本文旨在通過分析不同精子濃度和授精方式對(duì)受精、胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響，探討供精I(xiàn)VFET過程中授精時(shí)濃度適宜，為供精助孕受精方式的選擇提供臨床依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2013年1月－2016年6月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心行供精常規(guī)體外授精治療的542周期和25個(gè)供精卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）周期。供精I(xiàn)VF的適應(yīng)證包括：①女方具有IVF指征同時(shí)其男性配偶為非梗阻性無精子癥或男方染色體異?；蛴羞z傳性疾病者；②≥4次供精人工授精失敗者。所有患者都有自發(fā)規(guī)律的月經(jīng)周期（25～37d），體重指數(shù)（BMI）為18～25kg／m2，術(shù)前各常規(guī)檢查結(jié)果均無異常；無染色體異常，無未治愈的子宮內(nèi)膜疾病，排除子宮內(nèi)膜異位癥、內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)以及其它全身性疾病。取卵周期獲卵數(shù)≥5枚，卵子成熟度≥50%。

1.2 方法

1.2.1 控制性超排卵采用本中心常規(guī)短針長(zhǎng)方案，用藥包括：促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa，曲普瑞林，ERRING GmbH，德國）、卵泡刺激素（FSH，果納芬，Merck Serono，瑞士／普麗康，Merck Sharp ＆DohmeLimited，英國）、人絨毛膜促性腺激素（hCG，艾澤，Merck Serono，瑞士）。陰道B超和激素測(cè)定監(jiān)測(cè)卵泡生長(zhǎng)，當(dāng)1個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm或2個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡≥17mm時(shí)肌注hCG 250μg，36h后陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。

1.2.2 精液來源及處理供精I(xiàn)VF（D－IVF）精液來源于廣東省人類精子庫、浙江省人類精子庫及江西省人類精子庫。冷凍精液37℃水浴復(fù)溫5min，采用密度梯度離心加上游法獲得活動(dòng)精子，授精前計(jì)數(shù)精子密度、活動(dòng)率等。

1.2.3 分組授精液用 Makler精子計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。將患者按精子授精濃度不同分為A、B、C 3組。A組IVF時(shí)授精濃度為（1.0～＜2.0）×106／ml；B組精子授精濃度為（2.0～＜4.0）×106／ml；C組精子授精濃度為（4.0～8.0）×106／ml。

1.2.4 授精I(xiàn)VF：采用短時(shí)授精法，于hCG日后39～40h授精，精卵共同孵育2h后挑出卵母細(xì)胞，受精后16～18h脫顆粒細(xì)胞，觀察受精情況。ICSI：取卵后3～4h將卵冠丘復(fù)合物置于80U／ml透明質(zhì)酸酶溶液中消化吹打，去除卵丘顆粒細(xì)胞，選擇已排出第一極體的成熟卵子待用，ICSI時(shí)間為hCG日后40～42h。

1.2.5 受精、胚胎評(píng)分采用Vitrolife G Plus系列序慣培養(yǎng)液，受精后16～18h觀察原核形成，正常受精為2PN，D3［受精后（68±1）h］對(duì)胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，包括胚胎細(xì)胞數(shù)目、大小、形狀、胞漿形態(tài)、碎片和透明帶的厚度及完整性等。胚胎分級(jí)［1］，1級(jí)：細(xì)胞大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)均清晰，無顆?，F(xiàn)象，碎片＜5%。2級(jí)：細(xì)胞大小略不均勻，形狀略不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，碎片6%～20%。3級(jí)：細(xì)胞大小明顯不均，可有明顯的形狀不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片21%～50%。4級(jí)：細(xì)胞大小嚴(yán)重不均，胞質(zhì)可有嚴(yán)重的顆粒現(xiàn)象，碎片＞50%。胚胎分級(jí)為1～2級(jí)的6～10細(xì)胞2PN來源胚胎視為優(yōu)質(zhì)胚胎，選擇2枚用于移植或冷凍。

1.2.6 計(jì)算公式IVF受精率＝［1PN卵數(shù)＋2PN卵數(shù)＋（≥3PN卵數(shù)）＋晚期卵裂數(shù)］／獲卵數(shù)×100%；ICSI 2PN受精率＝（2PN卵數(shù)／注射MII卵數(shù)）×100%；IVF多精受精率＝（≥3PN卵數(shù)／獲卵數(shù)）×100%；卵裂率＝［1PN卵裂數(shù)＋2PN卵裂數(shù)＋（≥3PN卵裂數(shù)）＋晚期卵裂數(shù)］／［1PN受精數(shù)＋2PN受精數(shù)＋（≥3PN受精數(shù)）＋晚期卵裂數(shù)］×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率＝（優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)／2PN卵裂胚胎數(shù)×100%）；種植率＝（孕囊數(shù)／移植胚胎數(shù)）×100%；臨床妊娠率＝（臨床妊娠周期數(shù)／移植周期數(shù)）×100%。

1.2.7 臨床妊娠結(jié)局觀察胚胎移植后第14天尿、血hCG陽性者為生化妊娠；移植后4～6周B超見妊娠囊為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以珚x±s表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般臨床資料

A、B、C 3組間女方年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH值、BMI、獲卵數(shù)、平均移植胚胎數(shù)及供精精液參數(shù)包括精子密度、精子活動(dòng)率等比較均無差異（P＞0.05），見表1。

表1 3組一般臨床資料比較（珚x±s）

2.2 3組IVF－ET周期的結(jié)局比較

各組間受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但B組和C組的多精受精率高于A組（P＜0.05），見表2。

2.3 供精I(xiàn)VF和供精I(xiàn)CSI臨床結(jié)局比較

將接受優(yōu)化處理后供精精子濃度達(dá)1.0×106／ml助孕的患者分別行IVF和ICSI助孕。結(jié)果兩種方式患者年齡、成熟卵子數(shù)、卵裂率、平均移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。ICSI組的2PN受精率高于IVF組（P＜0.05），但兩組的優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表3。

表2 3組IVF－ET結(jié)局比較

表3 不同授精方式對(duì)臨床結(jié)局的影響（珚x±s）

3 討論

人類輔助生殖技術(shù)中冷凍技術(shù)的迅猛發(fā)展，為男性不育患者帶來了希望，尤其為無精子癥或染色體異?；颊咛峁┝斯┚础］o助生殖技術(shù)管理規(guī)定無精子癥患者的助孕治療必須使用由國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的人類精子庫提供的冷凍精液。雖然人類精子庫采集的是經(jīng)過嚴(yán)格篩查后合格人員的精液，但是經(jīng)過低溫冷凍保存后，仍會(huì)導(dǎo)致精子超微結(jié)構(gòu)和頂體完整性發(fā)生變化。研究表明冷凍復(fù)蘇過程影響精子DNA的完整性，導(dǎo)致解凍后精子活動(dòng)率和精子洗滌處理后活動(dòng)率的下降。冷凍解凍程序也對(duì)精子造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，損害表現(xiàn)為精子體外授精能力降低［3－5］。關(guān)于供精精子在IVF中應(yīng)用的研究較少，供精精子在IVF中合適的授精濃度少有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)［6－8］，卵母細(xì)胞與高密度的精子長(zhǎng)時(shí)間作用，精子代謝產(chǎn)生的多種有害物質(zhì)如活性氧成分（ROS）、氧自由基等代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)卵子、胚胎乃至妊娠結(jié)局產(chǎn)生較大影響。目前有關(guān)人卵體外受精中最適精子濃度的研究報(bào)道較少，尚無統(tǒng)一規(guī)范，常規(guī)新鮮精液IVF授精時(shí)，精液濃度范圍較廣［（0.1～10）×106／ml］［9］，供精精液受精濃度更少有報(bào)道。本研究探討供精精子授精時(shí)，是否能在更少的精子濃度下獲得更多的優(yōu)質(zhì)胚胎，降低多精受精率，提高臨床妊娠率。本研究隨機(jī)將患者分為3組，比較不同授精濃度的受精率、多精受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率及流產(chǎn)率的差異，并與同期供精I(xiàn)CSI周期進(jìn)行比較，結(jié)果顯示低精子濃度組多精受精率明顯低于高精子濃度的兩組，3組間受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、流產(chǎn)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，低精子濃度組臨床妊娠率較高精子濃度兩組雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有升高趨，這與大部分研究提示高濃度精子授精增加多精授精率，降低臨床妊娠結(jié)局一致［8－9］。決定授精效果的因素很多，包括精子的濃度和精卵作用時(shí)間等，本研究采用短時(shí)授精的方法，即精卵共同孵育2h后，將卵母細(xì)胞從受精滴中挑出，減少了高濃度精子產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)胚胎發(fā)育的影響，所以在優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和流產(chǎn)率上未見顯著差異。

多精受精常見于IVF過程，授精精子數(shù)量的增多可導(dǎo)致卵細(xì)胞皮質(zhì)顆粒釋放延遲，導(dǎo)致較高頻率的多精子受精，正常多精受精的比例約為1%～3%［10］，在本研究中授精濃度控制在（1.0～＜2.0）×106／ml時(shí)可獲得正常的多精受精比例，在與高濃度精子授精組比較時(shí)顯示并不降低受精率和胚胎質(zhì)量，臨床妊娠率也有提高，提示供精I(xiàn)VF過程中，精子授精濃度為（1.0～＜2.0）×106／ml是理想授精濃度。本研究比較了優(yōu)化處理后精子濃度達(dá)1.0×106／ml的精液分別行常規(guī)IVF和ICSI授精的結(jié)局，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一般資料無差異的情況下，ICSI可提高2PN受精率，但并不提高胚胎質(zhì)量、可利用胚胎率及臨床妊娠率。從安全性的角度考慮筆者認(rèn)為能夠選擇IVF授精就不必選擇ICSI授精。

綜上所述，供精I(xiàn)VF授精精子濃度為（1.0～＜2.0）×106／ml時(shí)其胚胎培養(yǎng)結(jié)果較為理想，受精率、多精受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率均在正常范圍內(nèi)，可作為供精授精時(shí)的加精濃度；在精液濃度可選擇行IVF受精時(shí)，行ICSI助孕并不提高優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率。本研究是在本院生殖中心實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)供精I(xiàn)VF授精濃度及授精方式選擇進(jìn)行的初步探索，由于各生殖中心的實(shí)驗(yàn)條件和供精質(zhì)量各異，其結(jié)論可能有別于先前部分研究者的觀點(diǎn)。同時(shí)，本研究為回顧性研究，下一步需要大樣本的前瞻性研究證實(shí)本結(jié)論。

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床診療指南／輔助生殖技術(shù)與精子庫分冊(cè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：33－34.

［2］ 宋革，鄭煒煒，鐘小英，等.供精人工授精結(jié)局分析及臨床應(yīng)用價(jià)值［J］.生殖與避孕，2014，34（5）：410－414.

［3］ SM Di，N Tarozzi，Nadalini M，et al.human sperm cryopreservation：update on techniques，effect on DNAintegrity，and Implications for ART［J］.Adv Urol，2012，（5）：854－837.

［4］ Fortunato A，Leo R，Liguori F.Effects of cryostorage on human sperm chromatin integrity［J］.Zygote，2013，21（4）：330－336.

［5］ Said TM，Gaglani A，Agarwal A.Implication of apoptosis in sperm cryoinjury［J］.Reprod Biomed Online，2010，21（4）：456－462.

［6］ Bungum M，Bungum L，Humaidan P.A prospective study，using sibling oocytes，examining the effect of 30seconds versus90minutes gamete co－incubation in IVF［J］.Hum Reprod，2006，21（3）：518－523.

［7］ Agarwal A，Bedaiwy MA.Role of reactiveoxygen species in the pathophysiology of human reproduction［J］.Fertil Steril，2003，79（4）：829－843.

［8］ Dirnfeld M，Bider D，Koifman M，et al.Shortened exposure of oocytes to spermatozoa improves in－vitro fertilization outcome：aprospective，randomized，controlled study［J］.Hum Reprod，1999 ，14（10）：2562－2564.

［9］ 楊大磊，潘伯臣，何麗霞，等.體外受精—胚胎移植中不同授精濃度對(duì)胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局的影響［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，43（1）：67－70.

［10］ Rosenbusch BE.Mechanisms giving rise to triploid zygotes during assisted reproduction［J］.Fertil Steril，2008，90：49－55.