周長朋,王東武,許 潔,鄭文鳳,梁曉艷
(迪沙藥業(yè)集團(tuán)國家認(rèn)定企業(yè)技術(shù)中心,山東 威海 264205)
高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜測定替米沙坦中N-甲基鄰苯二胺殘留量
周長朋*,王東武,許 潔,鄭文鳳,梁曉艷
(迪沙藥業(yè)集團(tuán)國家認(rèn)定企業(yè)技術(shù)中心,山東 威海 264205)
建立了高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(HPLC-QTRAP-MS/MS)測定替米沙坦中N-甲基鄰苯二胺殘留量的分析方法。替米沙坦藥物以水-乙腈(80∶20,體積比)溶解后,采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(3.5 μm,2.1 mm×100 mm)進(jìn)行分離,以0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,電噴霧正離子(ESI+)掃描方式下選擇離子監(jiān)測(SRM)模式對樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,N-甲基鄰苯二胺在2.0~50 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.99),檢出限(S/N=3)為0.5 μg/L ,定量下限(S/N=10)為2.0 μg/L。該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好,可用于替米沙坦中N-甲基鄰苯二胺殘留量的測定。
高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀;N-甲基鄰苯二胺;替米沙坦
替米沙坦(Telmisartan)是一種特異性血管緊張素Ⅱ受體(AT1型)拮抗劑,其化學(xué)名為4-{[2-正丙基-4-甲基-6-(1-甲基苯并咪唑-2-基)苯并咪唑-1-基]甲基}聯(lián)苯基-2-羧酸(合成路線見圖1),具有激動(dòng)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)及顯著改善血管內(nèi)皮功能的作用,且能抑制血管平滑肌(VSMC)收縮和增殖,是目前較為常用的抗高血壓藥物[1-3]。
N-甲基鄰苯二胺是替米沙坦合成的起始物料,具有1個(gè)苯胺結(jié)構(gòu),且有一定的致癌毒性,依照歐洲基因毒性雜質(zhì)的指導(dǎo)原則其應(yīng)屬于潛在基因毒性雜質(zhì)[4],必須進(jìn)行嚴(yán)密的控制。參照歐洲EMEA提出的采用“毒理學(xué)關(guān)注閾值”(Threshold of toxicological concern,TTC)作為基因毒性雜質(zhì)可接受限度的計(jì)算方法[5],N-甲基鄰苯二胺的限度為5.0 mg/L,若以替米沙坦的配制濃度為1.0 mg/mL計(jì)算,則實(shí)際檢測濃度應(yīng)為5.0 μg/L,對檢測水平的要求較高。目前針對鄰苯二胺的檢測方法主要有氣相色譜法[6]、液相色譜法[7]、熒光光譜滴定法[8]、化學(xué)發(fā)光法[9]等,上述方法的檢出限均較高。而對于藥物中基因毒雜質(zhì)N-甲基鄰苯二胺的研究相對較少,其中王金朝等[10]利用液相色譜法檢測了替米沙坦中的N-甲基鄰苯二胺殘留,但其檢出限為40 ng/mL,難以滿足當(dāng)前的限度要求。而國外已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測藥物中基因毒雜質(zhì)[11-12],國內(nèi)也有利用氣質(zhì)聯(lián)用儀[13-14]、液質(zhì)聯(lián)用儀[15-16]等監(jiān)控基因毒性雜質(zhì)的方法報(bào)道,但對于N-甲基鄰苯二胺的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法尚未見報(bào)道。
圖1 替米沙坦的合成路線圖Fig.1 Graphical synthetic routes of telmisartan
四極桿-線性離子阱(QTRAP-MS/MS)質(zhì)譜儀是一種混合型串聯(lián)質(zhì)譜,具有與傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜儀相當(dāng)?shù)亩抗δ?,且靈敏度和特異性均較高,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境等領(lǐng)域[17-22]。本文基于高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(HPLC-QTRAP-MS/MS)技術(shù),建立了測定替米沙坦藥物中基因毒性雜質(zhì)N-甲基鄰苯二胺的分析方法。該方法操作簡單、回收率好、靈敏度高,填補(bǔ)了國內(nèi)替米沙坦藥物N-甲基鄰苯二胺定量檢測研究的空白,有利于對替米沙坦藥物合成過程中的質(zhì)量參數(shù)進(jìn)行有效監(jiān)測。
1.1 儀器與試劑
Thermo LTQ-XL型高效液相色譜-四極桿/離子阱質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源;超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器公司);BT-25S精密分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司 );Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司);0.22 μm有機(jī)系濾膜(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。
N-甲基鄰苯二胺鹽酸鹽(純度≥99%,購自Sigma-Aldrich公司);乙腈(色譜純,德國Merck公司);甲酸(優(yōu)級純,天津大茂化學(xué)試劑廠);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(電阻率為18.2 MΩ·m);替米沙坦精品(迪沙藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。
1.2 溶液的制備
對照品溶液:取N-甲基鄰苯二胺鹽酸鹽適量,精密稱定,至10 mL容量瓶中,加少量乙腈超聲溶解,用乙腈定容至刻度,配制成含N-甲基鄰苯二胺1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18 ℃避光保存。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用乙腈配制成10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液,作為對照品溶液,于4 ℃避光保存。上機(jī)前用水-乙腈(體積比80∶20)稀釋成相應(yīng)濃度,過0.22 μm濾膜后注入質(zhì)譜。
供試品溶液:取替米沙坦精品約10 mg,精密稱定,至10 mL容量瓶中,加少量乙腈超聲溶解后,再加入水-乙腈(80∶20)定容至刻度,過0.22 μm濾膜后注入質(zhì)譜。
1.3 色譜條件
Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(3.5 μm,2.1 mm×100 mm);流動(dòng)相:A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液,B為乙腈;流速:0.2 mL/min;梯度洗脫程序:0~ 2.00 min,20% B;2.00~4.00 min,20%~95% B;4.00~9.00 min,95% B;9.01~15.00 min,20% B;柱溫35 ℃;進(jìn)樣體積為10 μL。
1.4 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測方式:選擇離子檢測(SRM);離子源溫度:320 ℃;輔助氣溫度:300 ℃;鞘氣:35 L/min;輔助氣:15 L/min;毛細(xì)管電壓:3 500 V;定量方式:外標(biāo)法定量;定量離子對:m/z123.1/107.6,碰撞能量(CE):35 V。
圖2 N-甲基鄰苯二胺(5.0 μg/L)在不同配制溶液中的降解曲線Fig.2 Degradation curve of N-methyl-o-phenylenediaie(5.0 μg/L)in different solution
2.1 配制溶液的選擇
N-甲基鄰苯二胺含有1個(gè)氨基,溶解后呈弱堿性,在酸性環(huán)境下易發(fā)生降解。因此,本研究考察了不同配制溶液對N-甲基鄰苯二胺降解速度的影響,分別采用初始流動(dòng)相(0.1%甲酸水溶液-乙腈,80∶20)、水、乙腈和水-乙腈(80∶20)配制濃度為5.0 μg/L的N-甲基鄰苯二胺對照品溶液,放置0,0.1,0.2,0.5,1,2,4 h后上機(jī)檢測,發(fā)現(xiàn)N-甲基鄰苯二胺在0.1%甲酸水溶液-乙腈中的降解速度較快,降解幅度較大,而在水、乙腈和水-乙腈(80∶20)中的降解速度較慢,降解幅度較小(見圖2)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),替米沙坦在水中的溶解度非常差,不利于供試品溶液的配制;乙腈對替米沙坦的溶解性雖較好,但配制后N-甲基鄰苯二胺和替米沙坦主峰的峰形均不好,而采用水-乙腈溶液(80∶20)配制后的峰形較好,替米沙坦的溶解度也較好,保證了樣品與對照品配制溶液的一致性,故本文選用水-乙腈溶液(80∶20)作為N-甲基鄰苯二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和替米沙坦供試液的配制溶液。
2.2 色譜條件的選擇
N-甲基鄰苯二胺的極性非常大,出峰時(shí)間較早,而替米沙坦的極性偏小,出峰相對較晚,二者的分離難度不大,且N-甲基鄰苯二胺在主峰之前出峰,基本不受替米沙坦的干擾影響。本文在相近的色譜條件下,考察了Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(3.5 μm,2.1 mm×100 mm)、Thermo Hypersil-C18色譜柱(1.9 μm,2.1 mm×100 mm)和Agilent Extend-C18(1.8 μm,2.1 mm×50 mm) 3種色譜柱的分離情況。結(jié)果顯示,上述3種色譜柱均能實(shí)現(xiàn)替米沙坦主峰和N-甲基鄰苯二胺的有效分離,且N-甲基鄰苯二胺的質(zhì)譜峰形也較好。但考慮到Thermo Hypersil-C18和Agilent Extend-C18色譜柱的柱容量均較小,檢測的進(jìn)樣量為10 μL,多次進(jìn)樣后易殘留替米沙坦,影響檢測結(jié)果。而Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱的內(nèi)徑為3.5 μm,柱容量較大,主峰基本不會殘留,故本文選用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱進(jìn)行分離。
圖3 N-甲基鄰苯二胺標(biāo)準(zhǔn)的SRM色譜圖Fig.3 SRM chromatogram of N-methyl-o-phenylenediamine
2.3 質(zhì)譜條件的選擇
采用電噴霧離子源,在正離子模式下,對1.0 mg/L的N-甲基鄰苯二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描,確定其分子離子[M+H]+峰(m/z123.1);對分子離子峰進(jìn)行碎裂并掃描子離子,得到二級質(zhì)譜圖,篩選響應(yīng)值較高、基線噪音低的離子(m/z107.6)作為監(jiān)測離子。采用選擇反應(yīng)檢測(SRM)模式采集數(shù)據(jù),駐留時(shí)間設(shè)定在100 ms,優(yōu)化各離子的碰撞能,得到最佳質(zhì)譜條件如“1.4”所述。在優(yōu)化條件下,得N-甲基鄰苯二胺標(biāo)準(zhǔn)的SRM色譜圖(圖3)。
2.4 方法的線性范圍、檢出限及定量下限
以水-乙腈(80∶20)配制0.0,2.0,5.0,10,20,50 μg/L的N-甲基鄰苯二胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進(jìn)行測定,以定量離子峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算。結(jié)果表明,N-甲基鄰苯二胺在0.0~50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.99);以質(zhì)譜3倍基線噪音計(jì)算檢出限(S/N=3)為0.50 μg/L,以質(zhì)譜10倍基線噪音計(jì)算定量下限(S/N=10)為2.0 μg/L,完全滿足依照歐盟基因毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則計(jì)算的5.0 μg/L濃度的雜質(zhì)限度。
2.5 回收率實(shí)驗(yàn)
采用不含N-甲基鄰苯二胺的替米沙坦精品為空白基質(zhì),進(jìn)行不同濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),各加標(biāo)濃度下的回收率均較低;且在精密度試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著檢測時(shí)間的延長回收率逐漸降低,可能是N-甲基鄰苯二胺在替米沙坦溶液中發(fā)生了降解。研究發(fā)現(xiàn),替米沙坦具有羧酸結(jié)構(gòu),其樣品溶液呈弱酸性,而N-甲基鄰苯二胺在酸性條件下會發(fā)生降解。進(jìn)一步做降解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),N-甲基鄰苯二胺在替米沙坦溶液中呈明顯的降解趨勢,但降解的速率較慢(見表1),不同濃度的N-甲基鄰苯二胺在1 h內(nèi)的降解率均不超過5%,若能在添加實(shí)驗(yàn)時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)測,基本不會影響回收率效果。本文也嘗試將替米沙坦溶液調(diào)節(jié)pH值至中性,回收率可得到明顯改善,但操作較為繁瑣,且相應(yīng)的對照品溶液也需調(diào)節(jié)pH值,不利于實(shí)際操作。因此,本文采用不含N-甲基鄰苯二胺的替米沙坦精品為空白基質(zhì),添加了80%限度、100%限度、120%限度濃度的N-甲基鄰苯二胺分別做回收率和精密度試驗(yàn),每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行,且所有添加樣品均在溶液配制1 h內(nèi)進(jìn)行檢測,得到平均回收率為85.7%~94.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.9%~2.9%(見表2),表明方法的回收率良好,完全可以滿足檢測要求。
表1 不同添加濃度的N-甲基鄰苯二胺在替米沙坦溶液中的降解率Table 1 Degradation rate of N-methyl-o-phenylenediaine in telmisartan at different spiked levels /%
*degradation rate =(CA-CF)/CA×100%,CA:added of N-methyl-o-phenylenediaine,CF:founded of N-methyl-o-phenyl-enediaine at different time points
表2 替米沙坦中添加N-甲基鄰苯二胺的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and RSDs of N-methyl-o-phenylenediamine in telmisartan
圖4 替米沙坦成品中含N-甲基鄰苯二胺的陽性樣品色譜圖(151104A2Y)Fig.4 Chromatogram of positive samples with N-methyl-o-pheny-lenediamine in telmisartan(151104A2Y)
2.6 實(shí)際應(yīng)用
將所建方法應(yīng)用于檢測合成的藥物小試3批、中試3批及工藝驗(yàn)證3批共27份樣品,所有樣品均在配制1 h內(nèi)檢測,共檢出6批含有N-甲基鄰苯二胺殘留,檢出結(jié)果分別為2.60 mg/kg(151216A2J),3.21 mg/kg(151216B1J),49.42 mg/kg(151216B1Y),12.30 mg/kg(151104A2Y),6.46 mg/kg(151104B2Y),7.73 mg/kg(151104B3Y),其中有4批樣品超過限度要求,其他樣品均未檢出,151104A2Y陽性樣品譜圖見圖4。
本文首次建立了高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜測定替米沙坦藥物中基因毒性雜質(zhì)N-甲基鄰苯二胺殘留量的分析方法。該方法靈敏度高、分離度好,回收率、精密度及定量下限均能滿足基因毒性雜質(zhì)的限度要求,是檢測替米沙坦藥物中N-甲基鄰苯二胺殘留量的有效方法。將所建方法用于檢測合成的替米沙坦藥物樣品,共檢出6批含有N-甲基鄰苯二胺殘留,方法有效地指導(dǎo)了替米沙坦合成反應(yīng)的進(jìn)行,并為項(xiàng)目的研發(fā)過程起到了良好的監(jiān)督作用。
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Determination of N-Methyl-o-phenylenediamine in Telmisartan by HPLC-QTRAP-MS/MS
ZHOU Chang-peng*,WANG Dong-wu,XU Jie,ZHENG Wen-feng,LIANG Xiao-yan
(National Enterprise Technology Center of Disha Pharmaceutical Group,Weihai 264205,China)
A high performance liquid chromatography-quadrupole ion mass spectrometric(HPLC-QTRAP-MS/MS) method was developed for the determination of N-Methyl-o-phenylenediamine residues in telmisartan.After extracted with water-acetonitrile(80∶20,by volume),the telmisartan samples were separated on an Agilent Eclipse XDB-C18column(3.5 μm,2.1 mm×100 mm) with a mobile phase of 0.1% formic acid solution-acetonitrile.The electrospray was operated in the positive mode and the samples were monitored under the select reaction monitoring(SRM) mode.As a result,the calibration curves of N-Methyl-o-phenylenediamine showed a good linearity(r>0.99) in the range of 2.0-50 μg/L.The limits of detection(S/N=3) was 0.5 μg/L ,and the limits of quantitation(S/N=10) was 2.0 μg/L.The method has the advantages of simple operation,high sensitivity,good reproducibility,and could be used for the detection of N-Methyl-o-phenylenediamine residues in telmisartan.
high performance liquid chromatography-quadrupole ion mass spectrometry(HPLC-QTRAP-MS/MS);N-methyl-o-phenylenediamine;telmisartan
2016-09-09;
2016-09-28
10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.019
O657.63;TQ460.726
A
1004-4957(2017)02-0262-05
*通訊作者:周長朋,工程師,研究方向:理化檢測及藥物分析,Tel:0631-3857373,E-mail:20019568@qq.com