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(北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心; 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048)

蛹蟲草纖溶酶研究進(jìn)展

劉英麗,丁立,毛慧佳,王靜*,龔凌霄

(北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心; 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048)

蛹蟲草是我國一種傳統(tǒng)的藥食兩用真菌,其中的纖溶酶是近些年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的纖維蛋白溶解酶。本文就蛹蟲草纖溶酶的產(chǎn)酶條件、分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、生物活性以及在分子生物學(xué)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,為期為以后的研究提供一定的參考及有益借鑒。

蛹蟲草,纖溶酶,研究進(jìn)展

纖維蛋白是人體及動物體內(nèi)形成血栓的主要蛋白成分,纖溶酶是纖維蛋白溶解酶的一個總稱。據(jù)統(tǒng)計,心腦血管疾病是造成人類死亡的主要原因[1],而血栓形成是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要因素,尋找有效治療血栓的藥劑引起了人們的廣泛關(guān)注。目前應(yīng)用于臨床治療血栓的藥劑主要是一些纖溶酶原激活劑和類胞漿素酶,如組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、尿激酶型纖溶酶原激活劑(u-PA)和鏈激酶等[2-3]。通常這些試劑具有一定副作用,如出血和堵塞并發(fā)癥、纖維蛋白降解特異性較低、過敏反應(yīng)及價格昂貴等[3-4]。因此,人們開始把關(guān)注點(diǎn)更多的放在一些天然來源的物質(zhì)以期提取出沒有或者具有較小副作用的、價格低廉的纖溶酶來替代現(xiàn)有的治療血栓的藥物。在過去的幾十年里,已經(jīng)有不少科學(xué)家從不同來源的生物中分離純化出具有較高的纖維蛋白溶解活性并能影響凝血作用的蛋白酶,這些天然物質(zhì)主要包括環(huán)節(jié)動物類、蛇毒液、昆蟲、草本植物、真菌及細(xì)菌等[5-9],分離出的具有纖溶活性的蛋白酶也是性質(zhì)各異,各有優(yōu)缺點(diǎn)。

蛹蟲草,世界性分布,我國主產(chǎn)于云南、吉林和遼寧省,又名北冬蟲夏草,屬于子囊菌門,肉座菌目,蟲草菌科,蟲草屬[10],是一種中國傳統(tǒng)的藥食兩用的大型真菌類物質(zhì),因與冬蟲夏草有類似的結(jié)構(gòu)和功能而備受關(guān)注。其含有的生物活性成分主要有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、甾醇及酶類等[11],具有抗腫瘤[12-13]、抗氧化[14-15]、提高免疫力[16-17]、消炎[18]、抑菌[19]等功能,被認(rèn)為是冬蟲夏草的理想替代品。纖溶酶作為蛹蟲草這一珍貴資源中的另一種天然活性物質(zhì),具有溶栓抗脂等功能,與目前臨床應(yīng)用的治療血栓藥物相比,具有安全可靠,特異性高,價格低廉等優(yōu)勢。自Kim等[20]從蛹蟲草發(fā)酵液中分離純化出一種纖溶酶后,陸續(xù)有研究者從蛹蟲草的發(fā)酵液、菌絲體及子實(shí)體中分離純化出不同性質(zhì)的纖維蛋白溶解酶,開辟了另一提取纖溶酶的綠色資源。本文就蛹蟲草纖溶酶的產(chǎn)酶條件、分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、溶栓抗脂效果以及在分子生物學(xué)研究等方面概述其進(jìn)展,并就研究中存在的問題進(jìn)行總結(jié),為蛹蟲草纖溶酶的深入開發(fā)提供思路。

1 產(chǎn)纖溶酶蛹蟲草菌株的產(chǎn)酶條件

近些年來,不少研究者對蛹蟲草產(chǎn)纖溶酶的水平進(jìn)行了報道。王玉等[21]以大米為主料,通過固體培養(yǎng)的方式得出產(chǎn)纖溶酶的最佳條件為:麩皮和大米以1∶1的比例為主料,培養(yǎng)基加水量75 g/100 mL,無機(jī)鹽CaCl2和(NH4)2SO4的添加量分別為0.1 g/100 mL和2 g/100 mL,培養(yǎng)基初始pH自然,接種量25 g/100 mL,培養(yǎng)時間5 d,固體發(fā)酵物的纖溶酶浸提時間為4 h時纖溶酶活力達(dá)(167±1) U/mL;周伏忠等[22]利用蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵離心得上清液作為粗酶液,發(fā)現(xiàn)通過條件優(yōu)化的菌絲體液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶的適宜碳源為玉米粉(2%)和蔗糖(2%),氮源為豆餅粉(5%)和玉米漿(8%),培養(yǎng)基中適量添加MgSO4(0.05%)、KH2PO4(0.1%)和CaCl2(0.05%)、MnSO4(0.05%)等無機(jī)鹽,發(fā)酵pH4.5～5.5,溫度22～24 ℃,培養(yǎng)時間6～7 d,最高酶活可達(dá)78.5 U/mL;林群英等[23]也是利用液體發(fā)酵得出產(chǎn)纖溶酶的最佳碳源為乳糖,最佳氮源為蠶蛹粉,其培養(yǎng)基含量均為10 g/L,再加入5 g/L的酵母浸膏時,獲得的纖溶酶活性高達(dá)143.26 U/mL;白偉芳等[24]采用液體發(fā)酵的菌株產(chǎn)酶最佳營養(yǎng)條件為2%葡萄糖,2%蛋白胨,碳氮比為1∶1,最佳環(huán)境條件為溫度25 ℃,pH6.0,裝液量 60 mL,發(fā)酵周期 9 d,接種量 2%,轉(zhuǎn)速 150 r/min,在此條件下,發(fā)酵液纖溶酶活力可達(dá)到 111.85 U/mL;陳慧鑫等[25]采用發(fā)酵罐對蛹蟲草進(jìn)行深層擴(kuò)大培養(yǎng),蛹蟲草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的最適培養(yǎng)條件為蔗糖2%、豆餅5%,23 ℃培養(yǎng)5 d,培養(yǎng)基初始pH為自然(6.0左右),10 L發(fā)酵罐在攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min和通風(fēng)量為600 L/h的條件下纖溶酶活力達(dá)286.21 U/mL?？梢?不同發(fā)酵條件和發(fā)酵方式對蛹蟲草纖溶酶的產(chǎn)酶條件影響較大,依據(jù)菌株的性質(zhì)差異,進(jìn)行優(yōu)化處理可以提高酶活。

2 蛹蟲草纖溶酶的分離純化

分離純化是纖溶酶酶學(xué)性質(zhì)分析的前提,獲得純品對于進(jìn)一步研究其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系至關(guān)重要?，F(xiàn)有的分離純化技術(shù)主要是鹽析、疏水相互作用層析、離子交換層析、凝膠過濾色譜等幾種技術(shù)的綜合利用。對于蛹蟲草纖溶酶的分離純化大體也是這幾種技術(shù)的綜合利用。Dubok等[26]通過將新鮮蛹蟲草子實(shí)體與50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)混合磨成勻漿,利用硫酸銨得蛋白沉淀,離心用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶沉淀,過透析袋除鹽,超濾濃縮后過DEAE-Sepharose FF離子交換柱,用0～5 mol/L線性梯度濃度的NaCl溶液洗脫,合并具有酶活收集液后用PD10柱脫鹽后過HiLoad 16/60 Superdex 200柱,用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫,合并酶活收集液后超濾濃縮,接著過HiLoad 16/60 Superdex 75柱,洗脫濃縮后經(jīng)SDS-PAGE檢測其分子質(zhì)量為34 kDa,純化倍數(shù)為86.1倍,回收率為13.7%,比活力為499.6 U/mg;Kim等[20]利用 DEAE Sephadex A-50 離子交換柱,Sephadex G-75凝膠過濾色譜和Superdex 75柱分離純化出蛹蟲草液體發(fā)酵液中的纖溶酶,經(jīng)SDS-PAGE檢測得到一單一條帶,分子量為52 kDa,純化倍數(shù)為191.8倍,回收率12.9%;Cui等[27]只用了兩步-硫酸銨鹽析、過Superdex 75柱就從蛹蟲草液體發(fā)酵液中得到一種達(dá)到電泳純的纖溶酶,其分子量為27.3 kDa,純化倍數(shù)為89倍,回收率為6%,但比活力僅為1.77 U/mg;劉曉蘭[28-29]和張雯舒[30]運(yùn)用同樣的分離純化策略(硫酸銨鹽析、Sephadex G-25 凝膠色譜、Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色譜、CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜和Superdex 75凝膠色譜)分別從蛹蟲草有性和無性深層培養(yǎng)液中各分離出兩種纖溶酶,前者獲得的兩種酶的相對分子質(zhì)量分別為28 kDa和32 kDa,純化倍數(shù)為36.07和41.33,回收率為5.79%和4.00%,其比活力分別為1467.44 U/mg和1681.58 U/mg,后者針對分離出的纖溶酶Ⅱ進(jìn)一步純化,最終產(chǎn)物分子量為32 kDa,純化倍數(shù)為30.07倍,比活力800.46 U/mg。從以上結(jié)果大致可知不同來源纖溶酶活力不同,分子量在30 kDa左右,但是不排除今后發(fā)現(xiàn)的其他來源的纖溶酶表觀分子量有差異。

3 蛹蟲草纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)

酶學(xué)性質(zhì)的分析研究對于酶后續(xù)的生產(chǎn)和應(yīng)用有重要的意義。張鶴[31]從蛹蟲草液體發(fā)酵提純精制了一個分子量28 kDa的纖溶酶,發(fā)現(xiàn)Aprotinine(抑肽酶,絲氨酸蛋白酶抑制劑)和SBTI(胰蛋白酶抑制劑)對其酶活性有抑制作用,推測這種酶可能是絲氨酸蛋白酶,可順次降解人血纖維蛋白的α、β和γ鏈,這與劉曉蘭[29]和張雯舒[30]得出的結(jié)論一致。此外,這個蛋白酶不但能直接降解血纖維蛋白,而且具有激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶的作用;劉曉蘭[29]提純的纖溶酶Ⅱ的分子量為32 kDa,等電點(diǎn)為9.3±0.2,最適pH和溫度為7.4和37 ℃,Ca2+和Cu2+對酶活性有增強(qiáng)作用,Fe3+強(qiáng)烈抑制酶活性,EDTA(乙二胺四乙酸,金屬蛋白酶抑制劑)對其活性影響不大,巰基基團(tuán)反應(yīng)試劑強(qiáng)烈抑制酶的活性,說明該酶活性部位不含金屬離子,巰基是該酶活性表達(dá)的必需基團(tuán);Cui等[18]的研究表明纖溶酶的最適pH和溫度為6.0和25 ℃,Mg2+和Fe2+能增強(qiáng)酶活性,而EDTA和Cu2+則抑制酶活性,N端氨基酸測序表明其與昆蟲體內(nèi)的胰蛋白酶具有很高的相似性,而與其他藥用真菌內(nèi)的纖溶酶序列沒有顯著的同源性;Dubok等[26]的研究結(jié)果顯示蛹蟲草纖溶酶的最適pH和溫度為7.0和40 ℃,酶活性受到PMSF(苯甲基磺酰氟,絲氨酸蛋白酶抑制劑)、TPCK(L-1(對-甲苯磺酰)苯丙胺酰氯甲酮,胰凝乳蛋白酶抑制劑)、1,10-鄰二氮菲、Cu2+和Ba2+的完全抑制,也受到Aprotinine、EDTA和EGTA的顯著抑制,對合成基質(zhì)N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide具有特異性,說明它可能是一個同屬于絲氨酸蛋白酶類和金屬蛋白酶類的蛋白酶;而陳曉飛等[32]的研究也表明,金屬離子Ca2+和Fe2+對蛹蟲草纖溶酶有顯著激活作用,抑制劑中PMSF對酶活性抑制作用較小,而Aprotinine、EDTA和EGTA(乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸,金屬蛋白酶抑制劑)對其纖溶活性均有較顯著的抑制作用,說明該酶可能是一種新的纖維蛋白溶解酶。因此,不同來源的纖溶酶最適溫度和pH略有差異,但是受抑制劑抑制作用的類型各異,可能分屬于不同的蛋白酶家族,除了絲氨酸蛋白酶類,還有可能屬于金屬蛋白酶類,或者兩者兼具,但需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 蛹蟲草纖溶酶的生物活性研究

蛹蟲草纖溶酶作為一種新發(fā)現(xiàn)的來自大型藥用和食用真菌的新型纖溶酶,對于其活性功能研究較多的集中于溶栓抗脂方面,主要實(shí)驗(yàn)包括體外模擬和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外最常用的檢測方法是取血液體外放置自然或促進(jìn)形成血塊,稱取質(zhì)量,加入纖溶酶,共孵育一段時間后再稱取血塊質(zhì)量,計算溶解率。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是建立動物血栓模型或血脂模型,包括外力誘導(dǎo)和化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)等方式[33-35]。劉曉蘭[29]進(jìn)行體外纖溶酶溶解血塊的實(shí)驗(yàn)表明隨著時間的延長,血塊逐漸溶解,6 h內(nèi)大體溶解完全,將纖維蛋白原、凝血酶和纖溶酶按不同方式混合,結(jié)果表明該酶具有很好的溶栓效果,對凝血酶具有一定的裂解作用,可作為抗凝劑使用;崔莉[36]利用提純的纖溶酶進(jìn)行體外毛細(xì)管血凝塊溶解實(shí)驗(yàn)表明:與生理鹽水對照組相比,注入蛹蟲草纖溶酶的毛細(xì)管血凝塊很快溶解,毛細(xì)管阻塞消失。體外血凝塊溶解實(shí)驗(yàn)表明與尿激酶陽性對照組相比,纖溶酶具有很好的血塊溶解效果。利用SD大鼠建立的血小板性動脈血栓和ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板凝集模型證明纖溶酶對其均具有明顯的抑制作用,空白對照組血栓濕重(123.4±25.4) mg,血小板聚集率為29.25%;陽性對照組(尿激酶250 U/kg)血栓濕重(59.3±26.2) mg,血小板聚集率(尿激酶500 U/kg)為10.66%;蛹蟲草纖溶酶給藥低劑量組(8 U/kg)、中劑量組(12 U/kg)、高劑量組(18 U/kg)血栓濕重分別為78.0±41.7,61.3±18.3,(40.2±11.87) mg,血小板聚集率分別為12.53%,9.21%和7.66%,其效果與纖溶酶給藥用量呈量效關(guān)系;叢珊滋[37]利用蛹蟲草深層培養(yǎng)液,通過建立高血脂動物模型,來檢驗(yàn)蛹蟲草纖溶酶的抗脂能力。將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、尿激酶陽性對照組、高脂飼料組以及蛹蟲草含纖溶酶培養(yǎng)液低、高劑量組五組,飼養(yǎng)8 d后,稱質(zhì)量、取血清,通過分析發(fā)現(xiàn),與高血脂組相比,含纖溶酶的蛹蟲草培養(yǎng)液可有效降低具有高血脂傾向動物血液中TC、TG和LDL-C的水平(p<0.01),同時可升高HDL-C水平(p<0.05)。含纖溶酶的蛹蟲草培養(yǎng)液的高、低劑量組與高脂組相比較,可升高心臟、脾臟和腎臟指數(shù),降低肝臟指數(shù),其對心、脾、腎和肝臟具有一定保護(hù)作用。

評價一個新的具有生物活性的蛋白酶的功能特性,不僅要分析其直接的表觀作用,更要綜合評估未來的用藥安全問題。結(jié)合目前對蛹蟲草纖溶酶的生物活性研究,并與其他來源纖溶酶功效研究進(jìn)行對比,今后可增加細(xì)胞毒性及毒理學(xué)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步明確其作為溶栓藥物的可行性。同時,根據(jù)治療血栓藥物的機(jī)理差異,從抗凝方面入手,分析蛹蟲草纖溶酶在抗凝血方面的功能性質(zhì),多方面評估蛹蟲草纖溶酶的生物活性。

5 蛹蟲草纖溶酶基因解析等相關(guān)領(lǐng)域研究

2011年Zheng等[38]發(fā)表了蛹蟲草的全基因組序列,之后國內(nèi)外研究者對蛹蟲草的分子生物學(xué)方面研究才陸續(xù)展開,已有研究者對蛹蟲草細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(cox1)的Ⅰ型內(nèi)含子[39]、蛹蟲草SSU rDNA中Ⅰ型內(nèi)含子[40]、蛹蟲草組氨酸激酶基因(CmHK)[41]、蟲草素代謝相關(guān)基因5′-nucleotidase部分序列[42]等進(jìn)行分析,但對于蛹蟲草纖溶酶的基因序列分析至今沒有進(jìn)展。大多數(shù)研究者僅僅是對純化后的纖溶酶進(jìn)行了部分N端序列分析[20,29],劉曉蘭[43]對部分肽段進(jìn)行了測序,七個肽段測序結(jié)果表明其和蛹蟲草CM01的類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶序列具有100%的同源性,但并沒有發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有的其他來源的具有纖維蛋白溶解活性蛋白酶的基因序列具有同源性。鑒于此,蛹蟲草中纖溶酶的基因克隆、異源表達(dá)及晶體結(jié)構(gòu)解析等研究工作尚留有較多空白,亟待展開進(jìn)一步研究。

6 展望

蛹蟲草作為一種寶貴的藥食兩用的傳統(tǒng)藥材，含有的活性成分具有對人體有益的作用,其含有的纖溶酶可作為一種新型綠色溶栓抗脂藥劑替代品,具有很大的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價值。鑒于其產(chǎn)地分布的局限性,目前國內(nèi)外對蛹蟲草的研究不夠深入,隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展,其研究開發(fā)主要集中在蟲草素、蟲草酸及蟲草多糖的功能性研究,而對蛹蟲草纖溶酶的研究甚少,停留在基本的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究等方面,缺乏深入的挖掘。另外,由于產(chǎn)纖溶酶蛹蟲草菌株種類的多樣性,不同研究者分離純化出的纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)差異較大,對菌株性質(zhì)做系統(tǒng)分類,并構(gòu)建完整的數(shù)據(jù)庫具有重要的意義。同時,現(xiàn)行的通用的測定纖溶酶活性的纖維蛋白平板法以市售尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線,具有直觀簡便的特點(diǎn),但市售尿激酶性質(zhì)及活性存在差別,且存在測定周期長、人為測量誤差大等的特點(diǎn)使得檢測到的酶活精確性較差,尋找一種簡便快速準(zhǔn)確的纖溶酶活性檢測方法也是一個重要研究內(nèi)容。此外,其攜帶的基因信息也尚不明確,還無法從分子水平進(jìn)行更深入的比較分析,如何進(jìn)一步挖掘蛹蟲草纖溶酶的深層信息,深入提升蛹蟲草纖溶酶應(yīng)用潛力具有重要的學(xué)術(shù)價值和現(xiàn)實(shí)意義。

目前就蛹蟲草纖溶酶現(xiàn)有的研究現(xiàn)狀來看,其纖溶活性大小與其他來源的纖溶酶相比優(yōu)勢并不明顯[44-45],但在溶栓抗脂效果方面具有比尿激酶更好的作用特點(diǎn)[29,36]。未來可期望通過分子改造進(jìn)一步提高纖溶酶活性、明確蛹蟲草纖溶酶產(chǎn)生機(jī)理、獲得基因序列并進(jìn)行表達(dá)、尋找特異性底物、增強(qiáng)溶栓抗脂效果及完善動物毒性實(shí)驗(yàn)等方面,研發(fā)出新的價格低廉特異性好的治療血栓的藥物或者開發(fā)預(yù)防高血脂的功能性食品配料及功能食品。

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ResearchprogressoffibrinolyticenzymefromCordycepsmilitaris

LIUYing-li,DINGLi,MAOHui-jia,WANGJing*,GONGLing-xiao

(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Cordycepsmilitarisis a kind of traditional medicine and food fungus in our country,the fibrinolytic enzyme were found in recent years as a new kind of fibrinolytic enzyme. In this paper,the production condition,purification,enzyme properties,bioactivity and molecular biology of the fibrinolytic enzyme fromCordycepsmilitariswere summarized,providing a certain reference basis for future research and the possible research direction.

Cordycepsmilitaris;fibrinolytic enzyme;progress

2017-05-08

劉英麗(1981-)，女，博士，副教授，主要從事功能性食品配料研究，E-mail:liuyingli@th.btbu.edu.cn。

*

王靜(1976-)，女，博士，教授，主要從事功能性食品配料研究，E-mail:wangjing@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31601564,31571940);北京市教委一般項(xiàng)目(SQKM201610011004);科技創(chuàng)新服務(wù)能力建設(shè)-科研水平提高定額-食品特色項(xiàng)目(科研類)(19005757057);北京市教委科研類專項(xiàng)科技創(chuàng)新平臺(19008001226);北京市優(yōu)秀人才培育資助青年拔尖團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目。

TS201.1

A

1002-0306(2017)21-0314-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.061