李子英,叢日春,*,楊慶山,周 健

1 中國林業(yè)科學(xué)研究院荒漠化研究所, 北京 100091 2 山東省林業(yè)科學(xué)研究院, 濟南 250014

柳樹為楊柳科柳屬(Salix)植物,其樹干高大通直,生長快,壽命長,材質(zhì)優(yōu),抗性強,既是重要的園林綠化植物,也是用材林和農(nóng)田防護林的常用樹種[17]。目前,關(guān)于柳樹耐鹽性的研究主要以中性鹽NaCl脅迫[18]和堿性鹽Na2CO3、NaHCO3脅迫[19-20]為主,而其對于混合鹽堿脅迫的響應(yīng)研究較少?！胞}柳1號”(Salixpsammophila‘Yanliu NO. 1’)來源于內(nèi)蒙古沙漠地帶的灌木北沙柳,是山東省林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)過十多年的研究和選育,從中選育出的一個喬木品種。本研究將NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3按不同比例混合,模擬出12種鹽度和堿度各不相同的鹽堿條件,對鹽柳1號盆栽幼苗進行處理,研究混合鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗生長和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響,以探索鹽柳1號的耐鹽堿范圍和耐鹽堿生理特性。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

試驗材料為柳樹無性系“鹽柳1號”(山東省林業(yè)科學(xué)研究院提供),取長15 cm、直徑1 cm左右的柳樹當年生插條,于2016年3月份定植于口徑和高均為15 cm的塑料花盆內(nèi),栽培基質(zhì)為洗凈的河沙和適量珍珠巖,并用多菌靈進行消毒。每盆1株,每3盆一組作為3個重復(fù)。扦插定植后,用1/2Hogland營養(yǎng)液進行澆灌并在溫室內(nèi)培養(yǎng),溫室內(nèi)的晝夜溫度為25/18℃。培養(yǎng)45 d后,選取長勢相對一致的柳樹幼苗進行試驗。

1.2 模擬鹽堿設(shè)計

將2種中性鹽NaCl、Na2SO4和2種堿性鹽NaHCO3、Na2CO3按不同比例混合,按堿性鹽比例逐漸增大的順序分成3個處理組(分別用A、B、C表示)。每組內(nèi)設(shè)4個濃度梯度(分別用1、2、3、4表示),其混合鹽總濃度依次為50、100、150、200 mmol/L,其中A1表示A處理組濃度為50 mmol/L的處理,依此類推。共模擬出12個混合鹽堿組合。從表1可以看出,組內(nèi)pH值的變化明顯小于組間,因此分析數(shù)據(jù)時以同組各濃度pH值的平均值作為該組的pH值,所以A、B、C處理組的pH值分別為8.04、8.66、9.47。

“A”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3= 1∶2∶1∶0比例配成混合鹽溶液的處理組；“B”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3=1∶9∶9∶1比例配成混合鹽溶液的處理組；“C”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3= 1∶1∶1∶1比例配成混合鹽溶液的處理組

1.3 鹽堿脅迫

選13組長勢相對一致的柳樹幼苗,1組澆1/2Hogland營養(yǎng)液作為對照,其余12組進行A1—A4、B1—B4、C1—C4的編號,分別用含有相應(yīng)濃度的混合鹽溶液進行脅迫處理,處理間隔為3 d,每次澆100 mL/盆。為避免鹽沖擊現(xiàn)象,脅迫處理時鹽濃度每次增加50 mmol/L,直至達到設(shè)定濃度。處理期間,定期定量補水。脅迫處理14 d后采集柳樹幼苗相應(yīng)部位的功能葉片進行指標測定。

1.4 指標測定

1.4.1 株高生長量的測定

測定脅迫前后各處理組柳樹幼苗的株高H1和H2,株高生長量=脅迫后的株高H2-脅迫前的株高H1。

1.4.2丙二醛(MDA)含量的測定[21]

稱取0.5 g植物樣品,先加10%三氯乙酸(TCA)2 mL,研磨勻漿后再加入3 mL TCA進一步研磨,研磨后所得勻漿在3000 r/min下離心10 min,取所得上清液2 mL于帶塞玻璃試管中,加入0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液2 mL,混合后于沸水浴上反應(yīng)20 min,迅速冷卻后離心,上清液分別于532、600、450 nm波長下測定吸光度值。對照管以2 mL蒸餾水代替提取液。

1.4.3脯氨酸含量的測定[22]

稱取0.5 g植物樣品置帶塞玻璃試管中,加入5 mL 3%磺基水楊酸溶液,在沸水浴中提取10 min(提取過程中要經(jīng)常搖動),冷卻后過濾于干凈的試管中,濾液即為脯氨酸的提取液。吸取2 mL提取液于另一干凈的帶塞玻璃試管中,加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮試劑,在沸水浴中加熱30 min,溶液即呈紅色。冷卻后加入4 mL甲苯,搖蕩30 s,取上層液在3000 r/min下離心5 min。輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色皿中,以甲苯為對照,在520 nm波長處比色,求得吸光度值。

1.4.4可溶性糖含量的測定[22]

稱取0.3 g植物樣品,剪碎,放入帶塞玻璃試管中,加入10 mL蒸餾水,于沸水中提取30 min(提取2次),提取液過濾入25 mL容量瓶中,反復(fù)漂洗試管及殘渣,定容至刻度。吸取樣品提取液0.5 mL于20 mL刻度試管中,加蒸餾水1.5 mL,然后向試管中加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸,充分震蕩,立即將試管放入沸水浴中,逐管均保溫1 min,取出后自然冷卻至室溫,以空白作參比,在630 nm波長下測定吸光度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2016、SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析,采用單因素方差分析對不同鹽濃度和不同pH值下各生理指標的差異性進行顯著性分析,多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫對柳樹幼苗株高生長量的影響

衡量植物耐鹽性最直接的指標就是鹽脅迫后植株的高度,它是體內(nèi)各種代謝反應(yīng)的綜合表現(xiàn)[23]。在混合鹽堿脅迫下,鹽柳1號幼苗的生長受到了不同程度的抑制。如圖1所示,隨著鹽濃度的增大,A、B、C處理組的株高生長量均呈降低趨勢,且均顯著低于CK(P<0.05),并在鹽濃度200 mmol/L時均降至最小值。其中,A處理組的株高生長量相對CK依次降低了27.20%、45.48%、53.18%、61.32%；B處理組的株高生長量與CK相比依次降低了29.65%、46.82%、63.77%、68.67%；C處理組幼苗的株高生長量與CK相比依次降低了31.22%、55.96%、66.33%、73.02%,且在鹽濃度高于150 mmol/L時葉片全部枯黃。在同等鹽濃度條件下,隨著堿性鹽比例(pH值)的增高,鹽柳1號幼苗的株高生長量均呈降低趨勢。在鹽濃度50、100和150 mmol/L時,A、B、C處理組的株高生長量差異均不顯著(P>0.05)。

圖1 混合鹽堿脅迫對柳樹幼苗株高生長量的影響Fig.1 Effect of complex saline-alkali stress on plant height increment of willow seedlings“A”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3 =1∶2∶1∶0比例配成混合鹽溶液的處理組；“B”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3 =1∶9∶9∶1比例配成混合鹽溶液的處理組；“C”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3 =1∶1∶1∶1比例配成混合鹽溶液的處理組;不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

2.2 鹽堿脅迫對柳樹幼苗葉片丙二醛(MDA)含量的影響

鹽堿脅迫下植物體內(nèi)氧自由基代謝失衡,細胞膜受到活性氧攻擊產(chǎn)生膜質(zhì)過氧化,最終細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞。如圖2所示,隨著鹽濃度的增大,A、B、C處理組的MDA含量均呈整體升高趨勢,且均高于或顯著高于CK。其中,A處理組的MDA含量增幅較小,與CK相比差異均不顯著(P>0.05)；B處理組的MDA含量在鹽濃度大于100 mmol/L時開始顯著增加(P<0.05)；C處理組的MDA含量均顯著高于CK(P<0.05)。A、B處理組的MDA含量在鹽濃度200 mmol/L時均達到最大值,分別相對CK增加了23.82%、154.29%；C處理組的MDA含量在鹽濃度100 mmol/L時達到最大值,與CK相比顯著增加了41.83%(P<0.05)。在鹽濃度50 mmol/L時,A、B、C處理組的MDA含量差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 混合鹽堿脅迫對柳樹幼苗葉片丙二醛含量的影響Fig.2 Effect of complex saline-alkali stress on MDA content in leaves of willow seedlings

2.3 鹽堿脅迫對柳樹幼苗葉片脯氨酸含量的影響

游離脯氨酸是一種可溶性蛋白,與水具有極強的吸附性,是參與植物滲透調(diào)節(jié)的主要物質(zhì)之一。如圖3所示,隨著鹽濃度的增大,A、B、C處理組的游離脯氨酸有不同程度的積累。其中,A、C處理組的脯氨酸含量均呈先升高后降低趨勢,且分別在鹽濃度150、50 mmol/L時達到最大值,分別相對CK增加了72.58%、14.66%；B處理組的脯氮酸含量在鹽濃度150 mmol/L時達到最大值,與CK相比顯著增加了158.75%(P<0.05)。從整體來看,A、C處理組的脯氨酸含量增幅較小,與CK相比差異均不顯著(P>0.05)；B處理組的脯氨酸含量在100 mmol/L以下鹽濃度范圍內(nèi)增加緩慢,而在高鹽脅迫下驟然增加。在同等鹽濃度條件下,A、B、C處理組的脯氨酸含量差異均不顯著(P>0.05)。

圖3 混合鹽堿脅迫對柳樹幼苗葉片脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of complex saline-alkali stress on proline content in leaves of willow seedlings

2.4 鹽堿脅迫對柳樹幼苗葉片可溶性糖含量的影響

隨著鹽濃度的增大,A、B、C處理組的葉片可溶性糖含量呈間斷性積累(圖4)。其中,A處理組的葉片可溶性糖含量呈先升高后降低趨勢,與CK相比差異均不顯著(P>0.05),并在鹽濃度100 mmol/L時達到最大值,相對CK增加了35.25%；B處理組的可溶性糖含量在鹽濃度150 mmol/L時開始顯著增加,在鹽濃度200 mmol/L時達到最大值,與CK相比顯著增加了313.99%(P<0.05)；C處理組的葉片可溶性糖含量均顯著高于CK(P<0.05),且在鹽濃度100 mmol/L時達到最大值,與CK相比顯著增加了48.45%(P<0.05)。在鹽濃度50 mmol/L時,A、B、C處理組的可溶性糖含量差異均不顯著(P>0.05)。

圖4 混合鹽堿脅迫對柳樹幼苗葉片可溶性糖含量的影響Fig.4 Effect of complex saline-alkali stress on soluble sugar content in leaves of willow seedlings

2.5 脅變指標與鹽濃度和pH值的方差分析

方差分析表明(表2),不同鹽濃度和鹽組合(pH值)以及兩者間的交互作用對鹽柳1號幼苗的葉片MDA含量和可溶性糖含量的影響均達到極顯著(P<0.01)；不同鹽濃度對株高生長量和脯氨酸含量的影響均達極顯著水平(P<0.01)；不同pH值對株高生長量的影響達到極顯著(P<0.01),對脯氨酸含量的影響不顯著(P>0.05)；交互作用對株高生長量和脯氨酸含量的影響均不顯著(P>0.05)。鹽濃度對各脅變指標的影響明顯大于pH值的影響。

表2 鹽濃度和pH值及其交互作用對柳樹幼苗不同脅變指標的影響

“*”表示差異顯著,P<0.05 (*: significant differenceP<0.05); “**”表示差異極顯著,P<0.01 (**: significant differenceP<0.01);“NS”表示差異不顯著,P>0.05 (NS: not significant)

3 討論與結(jié)論

植物在環(huán)境脅迫下生長會受到抑制,混合鹽堿脅迫對植物生長的影響尤為顯著[24]。本研究中,在混合鹽堿脅迫下,鹽柳1號幼苗的生長受到了不同程度的抑制。A、B、C處理組的株高生長量隨著鹽濃度、pH值的遞增均呈降低趨勢,尤其是在堿性鹽比例較高的C處理組(pH值為9.47),在高鹽脅迫下鹽柳1號幼苗的葉片全部枯黃(C3、C4)。這說明在混合鹽堿脅迫下,鹽柳1號幼苗不僅受到鹽濃度的影響,而且還受到高pH的協(xié)同作用,這與李玉梅在牛疊肚幼苗上的研究結(jié)果類似[25]。

植物遭受逆境脅迫時細胞膜首先會受到傷害,丙二醛(MDA)是植物膜脂過氧化的產(chǎn)物,MDA含量越高,說明植物受傷害的程度越大[26]。閆永慶等[27]研究表明,隨著鹽、堿濃度的加大,白刺葉片質(zhì)膜所受傷害逐漸增大,MDA含量增加。本研究中,在混合鹽堿脅迫下,鹽柳1號幼苗的葉片MDA含量隨著鹽濃度的增大有不同程度的增加,這表明氧自由基已誘發(fā)膜脂過氧化,細胞膜受到不同程度的傷害。其中,A處理組的MDA含量增加幅度不大,說明鹽柳1號幼苗葉片質(zhì)膜受傷害程度不大；B處理組的MDA含量在鹽濃度高于100 mmol/L時驟然增加,說明鹽柳1號幼苗葉片膜質(zhì)過氧化程度加劇,植株受害加重；C處理組幼苗在鹽濃度高于150 mmol/L時葉片全部枯黃,說明鹽柳1號幼苗已失去對鹽堿脅迫的應(yīng)激能力。

鹽脅迫會造成植物滲透脅迫、膨壓喪失[28],植物體通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來增大細胞質(zhì)濃度,以平衡液泡和細胞質(zhì)的水勢,平衡滲透勢,防止液泡從細胞質(zhì)中吸水,避免細胞質(zhì)這個代謝中心受到影響[29-31]。脯氨酸和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),郝鳳等[32]研究發(fā)現(xiàn),隨著鹽堿脅迫濃度的增大,植物體在積累脯氨酸的同時,糖的合成也增加。本研究中,隨著鹽濃度的增大,鹽柳1號幼苗的葉片脯氨酸和可溶性糖含量均有所上升。在低鹽脅迫下(100 mmol/L以下),A、B、C處理組的脯氨酸和可溶性糖含量變化均不明顯；在高鹽脅迫下(150 mmol/L以上),A處理組的脯氨酸和可溶性糖含量增加不顯著,B處理組的脯氨酸和可溶性糖含量驟然增至最大值,C處理組幼苗的葉片全部枯黃。說明鹽柳1號幼苗對混合鹽堿脅迫具有一定的耐受性,當超過耐受范圍時植株大量積累脯氨酸和可溶性糖,以此來緩解鹽堿脅迫帶來的傷害,直至承受不住高鹽高堿的脅迫作用而死。

混合鹽堿脅迫并不是鹽、堿兩種脅迫的簡單疊加,而是有一定協(xié)同效應(yīng)[33]。本研究中,在低鹽度時(50 mmol/L),pH值雖然由7.91增至9.33,但葉片MDA含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量的變化均不明顯,說明單純堿脅迫作用較??；在低堿度時(A組),雖然鹽濃度由50 mmol/L增至200 mmol/L,但葉片MDA含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量的增加幅度不大,說明單純鹽脅迫作用也較小。而當鹽脅迫與堿脅迫共同作用時(C3、C4),鹽柳1號幼苗的葉片全部枯黃,說明鹽與堿的協(xié)同效應(yīng)會對植物造成更大的傷害。

本研究結(jié)果表明,在高鹽低堿或高堿低鹽的條件下鹽柳1號幼苗可以正常生長,鹽濃度低于100 mmol/L的混合鹽堿脅迫對鹽柳1號的生理變化影響不大；鹽濃度高于150 mmol/L,pH > 9.51時會對鹽柳1號造成較大的傷害。

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