陳德波 ，洪成業(yè)， 王青蘭， 洪志鵬， 施涼潘， 池 畔

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，全世界每年大約有100萬(wàn)的新發(fā)、50萬(wàn)的死亡病例[1]。在我國(guó)，CRC位居消化道惡性腫瘤的第3位，且隨著國(guó)民生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，發(fā)病率還有逐年升高的趨勢(shì)。目前對(duì)CRC的診斷尚無(wú)敏感性和特異性均較高的血清學(xué)指標(biāo)[2]。尋找與CRC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的新的腫瘤標(biāo)志物，將有助于CRC的早期診斷和預(yù)后判斷，并為開(kāi)發(fā)藥物治療的新靶點(diǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 收集2008年5-7月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院結(jié)直腸外科行手術(shù)治療的CRC患者12例，男性7例，女性5例；年齡中位數(shù)67歲(47～85歲)。CRC組織及與其配對(duì)的正常黏膜組織均取自CRC患者手術(shù)切除的新鮮樣本，正常黏膜組織為距癌組織>10 cm的腸黏膜，離體30 min內(nèi)取材，立即置-80 ℃液氮保存。所有標(biāo)本均經(jīng)病理確診，患者術(shù)前均未行新輔助放化療。

另外收集2000年1月-2004年6月接受手術(shù)治療的CRC患者187例的蠟塊標(biāo)本，男性115例，女性72例；年齡(58.81±12.90)歲(24～81歲)；AJCC/UICC分期均為Ⅰ～Ⅲ期?；颊咝g(shù)前均未接受任何有關(guān)CRC的治療。收集同期手術(shù)切除和門(mén)診腸鏡檢查室活檢的腺瘤患者62例的標(biāo)本，男性46例，女性16例；年齡(56.35±14.13)歲(13～81歲)。取187例癌組織及其中150例癌旁組織、62例腺瘤組織構(gòu)建組織芯片。所有病例以手術(shù)日為隨訪起點(diǎn)，截止日期為2009年6月。

1.1.2試劑 IPG干膠條pH 4～7，24 cm(17-6002-46)、2-D Quant定量試劑盒(80-6483-56)及考馬斯亮藍(lán)R-350(17-0518-01)(瑞典Amersham Bioscience公司)；脯氨酰-4-羥化酶(prolyl 4-hydroxylase subunit beta，P4HB)兔抗人多克隆抗體(ab137110，英國(guó)Abcam公司)；二抗——辣根過(guò)氧化物酶(AP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(sc-2004)及內(nèi)參照β-tublin抗體(sc-33749)(美國(guó)Santa Cruz公司)；羊抗兔二抗(ZDR-5118，北京中杉金橋公司)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑(RPN2132，美國(guó)GE公司)。

1.1.3儀器 等電聚焦電泳系統(tǒng)Ettan IPGphor II(GE-057_TY5740)、大型垂直電泳系統(tǒng)Ettan DALTsix(GE-060_TY6368)、凝膠及圖像掃描儀(GE-081_TY0338)(美國(guó)GE公司)；Imaging Master 2D 5.0凝膠圖像分析軟件(瑞典Amersham Bioscience公司)；4700串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀及質(zhì)譜分析軟件(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1蛋白質(zhì)組學(xué)分析 組織蛋白提取、雙向凝膠電泳、掃描分析、選取差異的蛋白點(diǎn)、挖點(diǎn)、圖像采集與分析、質(zhì)譜圖的獲取、質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析方法及結(jié)果采用GPS(美國(guó)Applied Biosystems公司)-MASCOT(英國(guó)Matrix Science公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白鑒定，具體見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。

1.2.2Western-blot驗(yàn)證 對(duì)12例CRC組織及對(duì)應(yīng)的正常黏膜組織進(jìn)行驗(yàn)證。CRC組織及其癌旁組織各取50 mg，在液氮下碾磨成粉。加入裂解液(7 mol/L尿素、4% Chaps、2 mol/L硫脲、40 mmol/L DTT)，4 ℃下離心60 min(40 000 r/min)，收集上清液即為提取的總蛋白。取25 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離。110 V電轉(zhuǎn) 90 min，使蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，1% BSA室溫下封閉1 h。一抗(兔抗人P4HB抗體，稀釋濃度為1∶1 000)室溫孵育30 min后4 ℃冰箱過(guò)夜，TBST洗膜10 min×3次；AP標(biāo)記的羊抗兔二抗體中(稀釋濃度為1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜15 min×4次；ECL發(fā)光、曝光。以β-tubulin表達(dá)作為內(nèi)參對(duì)照。膠片由Image scanner掃描儀掃描分析。

1.2.3組織芯片與免疫組織化學(xué)染色 組織芯片的構(gòu)建源自Ⅰ～Ⅲ期的187例癌組織、150例正常黏膜組織及62例腺瘤蠟塊標(biāo)本。利用組織陣列儀在蠟塊組織芯取材(直徑1 mm)，每例癌標(biāo)本取2個(gè)組織芯，正常黏膜組織芯列于癌組織芯旁作為對(duì)照。每例腺瘤標(biāo)本取1個(gè)組織芯。采用En Vision二步法檢測(cè)P4HB蛋白在CRC組織、腺瘤組織及正常黏膜組織的表達(dá)。一抗?jié)舛葹?∶100，4 ℃孵育過(guò)夜。DAB顯色約10 min，蘇木精復(fù)染和鹽酸乙醇分化后脫水、封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。由2名病理醫(yī)生鏡檢讀片，評(píng)價(jià)表達(dá)情況，包括染色強(qiáng)度、細(xì)胞定位及陽(yáng)性率。

結(jié)果判讀：P4HB陽(yáng)性信號(hào)均定位于癌細(xì)胞的胞質(zhì)，胞質(zhì)中可見(jiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。具體判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞在全部癌細(xì)胞中所占比例以及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果；每張芯片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野(5×40)，根據(jù)視野的細(xì)胞著色強(qiáng)度分別記分，不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。然后隨機(jī)取5個(gè)視野對(duì)染色細(xì)胞分布進(jìn)行記分，總?cè)旧?xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分。將細(xì)胞染色強(qiáng)度記分與染色細(xì)胞數(shù)記分的乘積作為每個(gè)標(biāo)本的最后積分，<3為陰性，≥3為陽(yáng)性(過(guò)表達(dá))。

2 結(jié) 果

2.1CRC組織與正常黏膜組織雙向電泳差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定 通過(guò)比對(duì)獲取的高分辨率和高清晰度的12例24塊蛋白電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)40個(gè)表達(dá)量相差≥2倍的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析后，通過(guò)SEQUEST搜索和SWISS PROT數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與比對(duì)分析，共鑒定出35個(gè)蛋白質(zhì)，其中17個(gè)在癌組織中上調(diào)，18個(gè)下調(diào)。圖1為差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)P4HB經(jīng)質(zhì)譜鑒定獲得的肽質(zhì)量指紋譜。其中，CRC組織表達(dá)上調(diào)的P4HB平均豐度為正常黏膜2.01倍(P<0.05)，作為候選蛋白，故以Western-blot和免疫組織化學(xué)法對(duì)其在CRC組織中的表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證和分析。

2.2Western-blot檢測(cè)P4HB蛋白在CRC中的表達(dá) 以β-tubulin的表達(dá)作為內(nèi)對(duì)照，12個(gè)癌組織P4HB/β-tubulin灰度比為(1.36±0.54)，正常黏膜為(0.74±0.35)，二者間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)P4HB蛋白在CRC中的表達(dá) 構(gòu)建了3張組織芯片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分析，結(jié)果顯示，P4HB蛋白主要表達(dá)于在癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，在正常組織中亦可見(jiàn)少許表達(dá)(圖3)。在150例正常黏膜組織中，P4HB表達(dá)陽(yáng)性率為12.67%(19/150)，而在187例CRC樣本中，有43.85%(82/187)癌組織細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，62例腺瘤組織中有19.35%(12/62)P4HB表達(dá)呈陽(yáng)性(表1)。兩兩比較結(jié)果顯示，P4HB在正常組織、腺瘤與CRC組織中差別均具有顯著性(P<0.001)。

A：P4HB的肽質(zhì)量指紋譜，肽片段信號(hào)與P4HB相符的用星號(hào)表示；B：MALDI-TOF MS鑒定的峰值為910.55的肽段序列為SVTEQGAELSNEER，質(zhì)譜鑒定出的該蛋白質(zhì)為P4HB的肽片段之一.圖1 正常腸黏膜組織和結(jié)直腸癌組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)(P4HB)的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜結(jié)果(肽質(zhì)量指紋譜)Fig 1 MALDI-TOF-MS (peptide mass fingerprint) of protein spots (P4HB) expressed in normal intestinal mucosa and colorectal cancer tissues

β-tubulin作為內(nèi)參照；T：癌組織；N：正常黏膜組織.圖2 Western-blot方法測(cè)定P4HB蛋白在結(jié)直腸組織中的表達(dá)Fig 2 The expression of P4HB protein in colorectal tissues was detected by Western-blot

表1P4HB在結(jié)直腸癌組織、腺瘤和正常腸黏膜中免疫組織化學(xué)表達(dá)

Tab1PDI immunoreactivity in normal tissue, adenoma, and CRC tissue respectively

分 組nn陰性n陽(yáng)性陽(yáng)性率/%正常組織1501311912.67腺瘤62501219.35癌組織1871058243.85

χ2=45.730，P<0.001.

2.4P4HB蛋白表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系 P4HB在中低分化、腫瘤直徑>4 cm及Ⅲ期CRC組織中明顯高表達(dá)，差別均具有顯著性(P<0.05)，而未發(fā)現(xiàn)不同性別、年齡、病變部位等因素與P4HB蛋白的表達(dá)有關(guān)(P>0.05,表2)。

2.5P4HB蛋白表達(dá)與CRC患者的預(yù)后分析 采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。隨訪時(shí)間最長(zhǎng)為112月，隨訪期內(nèi)共有98例死亡，89例存活。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在CRC患者中，P4HB表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組的生存時(shí)間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖4)。

3 討 論

CRC是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一。30%～40%患者出現(xiàn)癥狀時(shí)已屬于局部進(jìn)展期或已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無(wú)法通過(guò)單純的手術(shù)治療取得痊愈[5]。因此，尋找CRC的早期篩查、診斷以及療效判定的腫瘤分子標(biāo)志物已引起了各國(guó)科學(xué)家的廣泛關(guān)注。

蛋白質(zhì)組學(xué)可以從整體的角度分析機(jī)體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平及修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用和聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與生命活動(dòng)的規(guī)律。雙向凝膠電泳與質(zhì)譜相結(jié)合技術(shù)是目前研究復(fù)雜蛋白質(zhì)表達(dá)水平改變最直接、有效的方法。本研究中筆者結(jié)合MALDI-TOF-MS對(duì)篩選出來(lái)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，最終從40個(gè)蛋白中鑒定出35個(gè)差異蛋白質(zhì)。

CRC(A-a)、腺瘤(B-b)、正常腸黏膜(C-c)；左側(cè)放大倍數(shù)×100，右側(cè)放大倍數(shù)×200.圖3 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)組織芯片中結(jié)直腸癌組織、腺瘤和正常腸黏膜P4HB蛋白的表達(dá)Fig 3 The expression of P4HB in different tissues using immunohistochemically analysis

Tab2Relationship between the expression of P4HB protein and clinicopathologic features of CRC

臨床病理特征nP4HB蛋白表達(dá)(-)(+)性別 男11463(55.3)51(44.7) 女7342(57.5)31(42.5)年齡/歲 >609249(53.3)43(46.7) ≤609556(58.9)39(41.1)d腫瘤/cm☆ >411543(37.4)72(62.6) ≤47262(86.1)10(13.9)分化☆ 高分化5136(70.6)15(29.4) 中低分化13669(50.7)67(49.3)位置 結(jié)腸7244(61.1)28(38.9) 直腸11561(53.0)54(47.0)TNM分期☆ Ⅰ+Ⅱ10670(66.0)36(34.0) Ⅲ8135(43.2)46(56.8)

表中數(shù)據(jù)為n(%). 同指標(biāo)內(nèi)比較，☆：P<0.05.

與陰性組的生存時(shí)間無(wú)顯著性差異，P=0.110.圖4 不同P4HB表達(dá)狀態(tài)的結(jié)直腸患者生存曲線Fig 4 Validationof the expression of P4HB in different tissues using immunohistochemically analysis

P4HB也稱為蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulphide isomerase，PDI)，由人類染色體17q25上的P4HB基因編碼，是一個(gè)關(guān)鍵的翻譯后修飾的膠原合成酶，參與抗氧化和解毒反應(yīng)[6-7]。既往多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的P4HB與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。Chen等研究顯示，P4HB異構(gòu)體在肺腺癌過(guò)度表達(dá)，可協(xié)助清除因腫瘤代謝增加而產(chǎn)生的有毒物質(zhì)[8]；Goplen等發(fā)現(xiàn)，P4HB的水平在惡性膠質(zhì)瘤中上調(diào)，轉(zhuǎn)移灶的P4HB表達(dá)強(qiáng)度較原發(fā)灶升高[9]；Bartkowiak等發(fā)現(xiàn)，P4HB在乳腺癌腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高[10]；Colas等發(fā)現(xiàn)，P4HB在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)倍數(shù)高于配對(duì)的正常組織[11]；Kallen等研究發(fā)現(xiàn)，P4HB高表達(dá)可導(dǎo)致多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)替莫唑胺的耐藥，且在復(fù)發(fā)的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表達(dá)較高[12]；Yang等發(fā)現(xiàn)，P4HB在肺癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁正常肺組織，并且其表達(dá)水平與肺癌的分化程度及臨床分期密切相關(guān)，分化程度越低、臨床分期越高，表達(dá)水平越高[13]；Xia等發(fā)現(xiàn)，P4HB在肝癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，并且高表達(dá)的P4HB水平與更晚期的疾病和較差的生存率相關(guān)[14]。Tomonaga等利用瓊脂糖雙向電泳研究發(fā)現(xiàn)，P4HB在結(jié)直腸腫瘤中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步免疫印跡驗(yàn)證分析顯示，在大部分腫瘤組織樣本中只有一個(gè)快遷移條帶高表達(dá)，可能為一個(gè)裂解的P4HB片段，而不是異構(gòu)體；認(rèn)為針對(duì)這種P4HB蛋白質(zhì)的裂解片段的檢測(cè)可能有助于大腸癌的早期診斷[15]。

總之，根據(jù)雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定出P4HB在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，且P4HB表達(dá)的上調(diào)與CRC更晚的分期、低分化及較大的腫瘤相關(guān)，而與CRC的預(yù)后無(wú)關(guān)，說(shuō)明P4HB在CRC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起一定作用。P4HB蛋白有可能為研究CRC癌變過(guò)程中的生物學(xué)行為提供新的分子標(biāo)記物。

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