申樹林

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院男性科，南寧市 530021)

·綜 述·

人精子相互作用蛋白的研究進(jìn)展▲

申樹林

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院男性科，南寧市 530021)

生物體內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)不是單獨(dú)發(fā)揮作用，而是以復(fù)合體(蛋白質(zhì)相互作用)形式發(fā)揮某種生物學(xué)功能，人精子蛋白質(zhì)也不例外。近年來(lái)，一些研究者在人精子發(fā)生的蛋白質(zhì)相互作用、精子運(yùn)動(dòng)蛋白質(zhì)相互作用和受精相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用研究方面進(jìn)行了卓有成效的探索，并取得了令人振奮的成果。這些成果對(duì)男性不育的病因、發(fā)病機(jī)制和男性避孕等研究有重要意義。

精子；蛋白質(zhì)；相互作用

隨著精子蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)大多數(shù)是以復(fù)合體(蛋白質(zhì)相互作用)形式發(fā)揮某種生物學(xué)功能，只有對(duì)復(fù)合體組分進(jìn)行深入研究，才能清楚各個(gè)蛋白質(zhì)的功能。近年來(lái)，一些學(xué)者在人精子蛋白相互作用方面進(jìn)行了卓有成效的探索，并取得了令人振奮的成果，本文將對(duì)這些研究綜述如下。

1 精子發(fā)生的相互作用蛋白研究

精子的發(fā)生要經(jīng)過(guò)三個(gè)階段才能成為成熟的精子細(xì)胞，即精原干細(xì)胞增殖分化、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成。這些階段均是在許多基因和蛋白質(zhì)的調(diào)控下進(jìn)行的，當(dāng)然，蛋白質(zhì)復(fù)合體(即相互作用蛋白)起到至關(guān)重要的作用。若此過(guò)程受到干擾，就會(huì)使精子生成障礙而導(dǎo)致無(wú)精子癥、少精癥、弱精癥、畸形精子癥等，引起男性不育。

精子形成首先是精原干細(xì)胞進(jìn)行增殖分化和有絲分裂，有學(xué)者在此方面進(jìn)行了研究。其方法是運(yùn)用CytoTrap?XR酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人睪丸HSD-4的cDNA文庫(kù)和蛋白質(zhì)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HSD-4蛋白與MAFB蛋白質(zhì)有相互作用。MAFB主要分布于細(xì)胞核，在許多細(xì)胞分化和組織形成過(guò)程中起著重要作用[1]，表明HSD-4可能在精原細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)人類睪丸特異性表達(dá)新基因-HMGB4，該基因在小鼠粗線期精母細(xì)胞開始表達(dá)并增加直至圓形精子細(xì)胞形成，在成熟的附睪精子中并沒(méi)有表達(dá)。免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜方法篩選和鑒定出丙酮酸脫氫Ela亞單位(PDHAI)與HMGB4蛋白結(jié)合。PDHAI屬于丙酮酸脫氫酶系中的成員，催化丙酮酸脫羧反應(yīng)。HMGB4可能是一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄抑制子[2]，HMGB4和PDHAI蛋白相互作用可能在精原細(xì)胞的分化和分裂中發(fā)揮某種作用。生精細(xì)胞的凋亡在保持精子生成數(shù)量方面扮演重要作用。PIAS(protein inhibitor of activated，STAT)蛋白家族有四個(gè)成員:PIASI、PIAS2、PIAS3和PIASy，其中PIAS2又有兩個(gè)亞型PIASxa和PIAS2，均在人睪丸組織中特異表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)RACK1與PIAS2有相互作用，相互作用的關(guān)鍵區(qū)域?yàn)镽ACK1的WD5-WD7結(jié)構(gòu)域，二者共定位于細(xì)胞中，說(shuō)明RACK1蛋白是一個(gè)新的相互作用蛋白。敲除PIAS2基因后睪丸生成精子數(shù)量減少，細(xì)胞凋亡增加，表明PIAS2與RACK1復(fù)合體可能通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑影響精子的形成[3]。

減數(shù)分裂是精子細(xì)胞形成中的特有現(xiàn)象，如果出現(xiàn)異常就會(huì)導(dǎo)致睪丸生精功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)MLH1缺失導(dǎo)致精母細(xì)胞粗線期停滯，表明MLH1在精子發(fā)生中具有重要作用。殷毅等[4]采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了可能與 MLH1有相互作用的蛋白R(shí)HNO1，然后采用免疫共沉淀和GST pull-down技術(shù)驗(yàn)證二者有相互作用，由此表明MLH1與RHNO1復(fù)合體蛋白參與了精子形成中的減數(shù)分裂和同源重組。GGNl在生殖細(xì)胞發(fā)育的減數(shù)分裂前后表達(dá)，通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀技術(shù)證實(shí)GGNBP2與GGNl有相互作用。GGNBP2在睪丸、初級(jí)精母細(xì)胞和減數(shù)分裂時(shí)期[5]均有表達(dá)，但在圓形精細(xì)胞中無(wú)表達(dá)。GGNl和GGNBP2為相互作用蛋白，并且在減數(shù)分裂階段都有表達(dá)，提示他們?cè)跍p數(shù)分裂中起重要作用。

精子形成是指精子細(xì)胞由圓形變成如同蝌蚪樣的成熟精子。RSB66是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因，該基因編碼含168個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。采用酵母雙雜交系統(tǒng)和Western Blot等方法研究發(fā)現(xiàn)RSB66與HSD45有相互作用，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均得到確證蛋白激酶CK2屬于信使非依賴性絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于真核細(xì)胞中，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖和分化等方面發(fā)揮重要作用。敲除實(shí)驗(yàn)小鼠CK2基因，引起精子生成減少和圓頭精子，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠不育，此現(xiàn)象與人圓頭精子相似。利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選和驗(yàn)證轉(zhuǎn)換蛋白1(TPI) 與CK2有相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)研究人圓頭精子的發(fā)生有重要意義[7]。

精子形成也是在一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的調(diào)控下實(shí)現(xiàn)的，F(xiàn)AM3A(family with sequence similarity)是細(xì)胞因子FAM3家族成員之一。研究者運(yùn)用酵母雙雜交等技術(shù)和方法，篩選并驗(yàn)證了蘇氨酸激酶(TSSK4)與FAM3有相互作用。TSSK4與FAM3在睪丸圓形精子表達(dá)，而TSSK4是一種磷酸化激酶，可能通過(guò)蛋白質(zhì)磷酸化在精子形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[8]。

2 與精子運(yùn)動(dòng)有關(guān)的相互作用蛋白研究

精子的運(yùn)動(dòng)能力對(duì)于自然受精至關(guān)重要，眾多的研究已經(jīng)證明精子的運(yùn)動(dòng)能力是在附睪獲得的。Eppin基因特異性在睪丸和附睪表達(dá)，Eppin蛋白通過(guò)調(diào)控精液的凝固和液化過(guò)程，影響精子的獲能和運(yùn)動(dòng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，精囊分泌的纖維連接蛋白Fibronectin與Eppin特異性結(jié)合，可能的機(jī)制是在射精過(guò)程中，附睪精子通過(guò)射精管時(shí)與精囊分泌液中的Fibronectin發(fā)生相互作用[9]。另有研究將重組Eppin (rEppin)和重組精囊凝固蛋白Semenogelin (rSg)共同孵育，免疫共沉淀和Western驗(yàn)證rEppin與rSg有相互作用。Eppin與Sg發(fā)生特異性結(jié)合，是通過(guò)Sg分子結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸殘基Cys-239結(jié)合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的，如果Cys-239還原及羧甲基化將阻礙rEppin與rSg的結(jié)合[10]。還有研究者運(yùn)用質(zhì)譜、免疫沉淀和Western blots技術(shù)從人精液Eppin蛋白復(fù)合體中鑒定出了lactotransferrin、clusterin、 semenogelin三個(gè)蛋白，三者共定位于精子尾部[11]。有研究鑒定EPPIN復(fù)合體中相互作用蛋白EPPIN′s的氨基酸序列，EPPIN′s序列C102-P133包含與semenogelin結(jié)合的主要位點(diǎn)。在相同區(qū)域序列F117-P133結(jié)合EPPIN復(fù)合體相關(guān)蛋白lactotransferrin (LTF)，表明在EPPIN C-terminus的Cys102、Tyr107、Phe117對(duì)于SEMG1結(jié)合是必需的[12]。蛋白質(zhì)相互作用的鑒定對(duì)于完全理解生物學(xué)過(guò)程和相關(guān)生化通路蛋白的功能是至關(guān)重要的。Tomar等[13]運(yùn)用免疫共沉淀、SDS-PAGE和質(zhì)譜法對(duì)人精漿泌乳素誘導(dǎo)蛋白(PIP)相互作用蛋白進(jìn)行研究，三個(gè)相互作用蛋白被鑒定，分別是人類血清白蛋白，zinc-α-2糖蛋白和semenogelin I，這是第一次報(bào)告人類精漿中的PIP和semenogelin之間有相互作用，這對(duì)精子的獲得運(yùn)動(dòng)能力的研究有幫助。

精子的能量代謝對(duì)其運(yùn)動(dòng)同樣重要，研究發(fā)現(xiàn)DNAJBl3在人類睪丸組織中高表達(dá)，定位于成熟精子尾部鞭毛中段放射軸、外側(cè)微管、外周致密纖維以及線粒體，提示其功能與精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)。突變篩查研究結(jié)果提示其功能與人類特發(fā)性弱精癥相關(guān)。采用免疫共沉淀方法聯(lián)合質(zhì)譜分析篩查DNAJBl3在人成熟精子中相互作用的蛋白，提示其作用機(jī)制可能是通過(guò)與HKI和LDHC的相互作用，參與成熟精子的糖代謝過(guò)程從而影響精子的運(yùn)動(dòng)[14]。

精子膜蛋白既是精子的重要組成成分，又是許多受體與相應(yīng)的配體特異性結(jié)合調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)的作用靶點(diǎn)，酵母雙雜交和pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證YWK-II蛋白與MIS有相互作用。研究表明人精子單跨膜蛋白YWK-II可能是MIS的作用受體，二者的結(jié)合可能對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)及生存力起重要作用[15]。另一方面精子膜通透性和一些鈣調(diào)蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)鉀、鈣等離子的濃度而調(diào)控精子的運(yùn)動(dòng)，如睪丸特異性鈣結(jié)合蛋白CBP 86-IV和Tecktin 4。申樹林等[16]采用蛋白質(zhì)組技術(shù)在研究特發(fā)性弱精子癥患者精子蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的蛋白質(zhì)，為了研究這兩種蛋白的功能，我們用免疫共沉淀技術(shù)，以Tektin 4抗體為誘餌從人精子總蛋白中釣取Tektin 4復(fù)合體，并對(duì)復(fù)合體進(jìn)行質(zhì)譜鑒定， 發(fā)現(xiàn)了semenogelin I、semenogelin-1 preproprotein和semenogelin II三個(gè)蛋白。由此表明Tektin 4和semenogelin蛋白復(fù)合體(也稱為相互作用蛋白)在精子運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用。另外用克隆技術(shù)獲得睪丸特異性鈣結(jié)合蛋白CBP86-IV的編碼基因，構(gòu)建融合基因表達(dá)載體并進(jìn)行重組蛋白表達(dá)，采用串聯(lián)親和純化技術(shù)和免疫共沉淀法分離出TS-CBP86-IV蛋白復(fù)合體，再用質(zhì)譜鑒定出可能與其相互作用的蛋白質(zhì)12個(gè)，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)部分蛋白參與精子運(yùn)動(dòng)調(diào)控[17]。

3 受精相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用蛋白研究

精卵融合，也稱為受精，整個(gè)受精過(guò)程包括精子與卵子識(shí)別、精子穿透透明帶、卵子激活和精卵核融合。從分子水平上闡明精卵相互作用在有性生殖領(lǐng)域是一個(gè)尚未解決的問(wèn)題。研究者利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)方法揭示精卵融合可能的蛋白質(zhì)相互作用和相關(guān)的分子功能。構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)顯示新的相互作用：包括人卵細(xì)胞CD151、CD9與人精子CD49相互作用；精子的CD49、ITGA4、CD63分別于卵細(xì)胞的CD63和 CD81相互作用，也與卵子CD9發(fā)生相互作用[18]。通過(guò)分析網(wǎng)絡(luò)，確定精-卵相互作用的主要分子功能，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。Ezrin作為一種連接蛋白，將細(xì)胞膜和膜蛋白以及骨架蛋白等連接起來(lái)，從而形成或維持微絨毛和細(xì)胞膜突起等特殊結(jié)構(gòu)。相反，如果抑制ezrin功能，將會(huì)影響細(xì)胞的這些結(jié)構(gòu)。ezrin在細(xì)胞內(nèi)的主要作用是調(diào)控細(xì)胞形態(tài)或者介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附等。研究發(fā)現(xiàn)ezrin分別與F-actin、RhoGDll、cd44有相互作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及結(jié)合相關(guān)研究，王蕾[19]推測(cè)人精子獲能過(guò)程中ezrin、RhoGDll、actin、RhoA及膜蛋白相互作用形成一個(gè)蛋白網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)獲能過(guò)程中精子質(zhì)膜重組和重新分布，從而影響精卵融合的復(fù)雜受精過(guò)程。受精過(guò)程也需要分子伴侶協(xié)同作用，分子伴侶HSPA2( molecular chaperone Heat Shock Protein A2，HSPA2)是透明帶受體復(fù)合體組裝中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，精子不能與缺乏HSPA2蛋白表達(dá)的卵子透明帶發(fā)生相互作用。BAG6(BCL2-associated athanogene 6，BAG6)定位于非獲能精子的赤道區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)BAG6與HSPA2共定位在人睪丸生殖細(xì)胞和附睪精子，蛋白質(zhì)相互作用分析顯示BAG6與HSPA2在成熟精子中保持穩(wěn)定的相互作用。研究還發(fā)現(xiàn)不育男性精子透明帶缺乏HSPA2以及BAG6表達(dá)。在人類生殖細(xì)胞，BAG6可能是HSPA2穩(wěn)定/功能的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，表明BAG6可能是進(jìn)一步研究男性特發(fā)性不育癥的一個(gè)重要的候選蛋白[20]。

綜上所述，研究精子相互作用蛋白不僅對(duì)揭示精子的發(fā)生、運(yùn)動(dòng)及受精過(guò)程的分子機(jī)制有重要意義，而且可為男性不育癥的診斷、治療和男性避孕等研究奠定重要基礎(chǔ)。

[1] 范明明.用CytoTrapXR酵母雙雜交系統(tǒng)篩選兩種人精子蛋白結(jié)合物的初步研究[D].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2003:1-90.

[2] 王 成,趙曉蒙,帥 勇,等.免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析篩選HMGB4相互作用蛋白[J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(2)：71-75.

[3] 張露萍.PIAS2及其相互作用蛋白R(shí)ACK1參與精子發(fā)生的機(jī)制[D]. 江蘇：揚(yáng)州大學(xué),2012.

[4] 殷 毅,平 萍.減數(shù)分裂重組關(guān)鍵蛋白MLH1結(jié)合蛋白的酵母雙雜交篩選和鑒定[J].中國(guó)男科學(xué)雜志,2016，30(1)：16-20，29.

[5] 曹志國(guó).睪丸特異性蛋白GGNl與GGNBP2的相互作用研究[D].北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2005.

[6] 胡廷徽.RSB66和HSD13編碼蛋白質(zhì)的功能研究[D].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2005.

[7] 陳 碧.用酵母雙雜交系統(tǒng)從人睪丸cDNA文庫(kù)中篩選與蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的研究[D].廣州：廣東醫(yī)學(xué)院,2005.

[8] 陳 說(shuō),肖海鵬,李延兵,等.FAM3A相互作用蛋白的檢測(cè)[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2008,29(5)：521-525.

[9] 王增軍,賈躍軍,牛曉兵,等.附睪蛋白酶抑制劑Eppin與精囊Fibronectin相互作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2010,27(9)：1356-1356.

[10]王增軍,吳宏飛,錢立新,等.人類精子表面附睪蛋白激酶抑制劑 Eppin和精囊凝固蛋白 Semenogelin的相互作用研究[J]. 中華男科學(xué)雜志,2006,12(5):428-431，434.

[11]Wang Z, Widgren EE, Richardson RT, et al. Characterization of an eppin protein complex from human semen and spermatozoa. Biol Reprod, 2007,77(3):476-484.

[12]Silva EJ,Hamil KG, Richardson RT,et al. Characterization of EPPIN′S semenogelin I binding site: a contraceptive drug target[J]. Biol Reprod，2012,87(3)：56.

[13]Tomar AK, Sooch BS, Raj I , et al. Interaction analysis identifies semenogelin I fragments as new binding partners of PIP in human seminal plasma[J]. Int J Biol Macromol，2013,52:296-299.

[14]朱 莉.人類生精相關(guān)基因DNAJBl3在精子運(yùn)動(dòng)中的功能和機(jī)制研究[D].湖南：中南大學(xué)，2014.

[15]田新勇.人精子膜蛋白YWK-Ⅱ的功能研究[D].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2001.

[16]申樹林,梁季鴻,朱春暉,等.免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜法篩選和鑒定Tecktin4相互作用蛋白[C].第十次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合男科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編,2015,376-377.

[17]申樹林,梁季鴻,朱春暉,等.免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜法篩選和鑒定TS-CBP86-IV相互作用蛋白[J].中國(guó)男科學(xué)雜志,2014,28(10)：7-9，14.

[18]Sabetian S,Shamsir MS, Abu Naser M. Functional features and protein network of human sperm-egg interaction[J].Syst Biol Reprod Med,2014,60(6):329-337.

[19]王 蕾. Ezrin相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)在人精子獲能過(guò)程中的功能研究[D].南京：南京醫(yī)科大學(xué),2008.

[20]Bromfield E, Aitken RJ, Nixon B. Novel characterization of the HSPA2-stabilizing protein BAG6 in human spermatozoa[J]. Mol Hum Reprod,2015,21(10):755-769.

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81260123)

Q 954.43+4

A

1673-6575(2017)04-0508-03

10.11864/j.issn.1673.2017.04.18

2016-12-28

2017-02-26)