魏連會(huì)，宋淑敏，董 艷，劉宇峰

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319)

雙酶法水解漢麻粕蛋白工藝的研究

魏連會(huì)，宋淑敏，董 艷，劉宇峰

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319)

采用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)合水解漢麻粕蛋白，以水解度為指標(biāo)，研究雙酶水解漢麻粕蛋白的最佳工藝條件。首先加入堿性蛋白酶，在溫度55℃、pH11、加酶量為3%、料液比為1∶5、時(shí)間為2 h的條件下，進(jìn)行第一次酶解，達(dá)到酶解時(shí)間，高溫滅酶，冷卻后調(diào)節(jié)pH值為5；然后加入木瓜蛋白酶，在溫度70℃，加酶量0.4%，進(jìn)行第二次酶解，1 h后，高溫滅酶,冷卻，離心,上清液為漢麻粕蛋白酶解液，水解度為26.42%。

木瓜蛋白酶；堿性蛋白酶；漢麻粕蛋白;水解；多肽

漢麻粕含有較高的蛋白質(zhì)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)40%以上)，其中，麻仁蛋白占65%，白蛋白占35%。麻仁蛋白具有促消化作用，白蛋白含有人體所需要的各種氨基酸[1-2]。對漢麻粕蛋白進(jìn)行氨基酸組成分析，發(fā)現(xiàn)其含有豐富的必需氨基酸。不僅含有豐富的精氨酸和谷氨酸，同時(shí)含有天冬氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸。特別是精氨酸和組氨酸對兒童的生長發(fā)育有著重要的作用[3]。

目前，漢麻粕作為漢麻籽油脂加工的下腳料，主要利用途徑是作為動(dòng)物的飼料使用，綜合利用價(jià)值較低。通過酶法水解漢麻粕蛋白，得到具有生物活性的多肽，不僅能夠豐富植物蛋白多肽的種類，更為漢麻粕綜合利用開發(fā)出一種新型模式。研究表明，人體對蛋白質(zhì)的消化吸收，并非主要以氨基酸的形式，而是以生物多肽的形式吸收[4]。生物多肽不僅能夠提供人體生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，而且具有抗氧化、降血壓、降血糖等多種生理功能[5-7]。因此，將漢麻粕酶解制備多肽，不僅可以提高漢麻粕的利用價(jià)值，增加其產(chǎn)品的附加值，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益，而且對開發(fā)功能保健食品、促進(jìn)人類健康具有積極的拖動(dòng)作用。

堿性蛋白酶是一種絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶，可水解肽鏈為芳香族氨基酸，可使芳香族氨基酸暴露，為得到芳香族氨基酸奠定基礎(chǔ)；木瓜蛋白酶兼具內(nèi)切肽酶和外切肽酶的活性，在一定的條件下可斷裂芳香族氨基酸，使芳香族氨基酸釋放出來。兩者復(fù)合使用可制備功能活性更強(qiáng)的高F值寡肽。

本研究采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶復(fù)合酶法制備漢麻籽多肽，確定最佳的酶解工藝條件，為漢麻多肽在功能食品和醫(yī)藥領(lǐng)域利用，提高漢麻粕精深加工產(chǎn)品的附加值，促進(jìn)漢麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

木瓜蛋白酶，堿性蛋白酶，漢麻粕蛋白。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 漢麻粕基本成分的測定

漢麻粕粗蛋白的測定采用GB 5009.5—2010,漢麻粕粗脂肪的測定采用GB/T 5009.6—2003,漢麻粕中灰分的測定采用GB 5009.4—2010,漢麻粕中水分的測定采用GB 5009.3—2010。

1.2.2 測定指標(biāo)

漢麻粕的水解度測定采用福林酚比色法[8]，蛋白質(zhì)水解度用DH表示。

DH=(N2-N1)/(N0-N1) ×100%，

式中，N0為不同濃度漢麻蛋白溶液氮含量，mg/ml；N1為蛋白酶水解前可溶性氮含量，mg/ml；N2為蛋白酶水解后可溶性氮含量，mg/ml。

1.2.3 工藝路線

漢麻籽粕→調(diào)整料液比→調(diào)整pH值和溫度→加蛋白酶→酶解→滅酶→過濾→離心→提取上清液→真空干燥→多肽粉。

1.2.4 堿性蛋白酶酶解單因素試驗(yàn)

溫度對酶解效果的影響：稱取脫脂漢麻粕5 g, 溶于50 ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為10，加入2%的堿性蛋白酶，置于水浴鍋中，分別調(diào)節(jié)40、45、50、55、60℃這5個(gè)不同的溫度，進(jìn)行酶解2 h,酶解后測定水解度。

pH值對酶解效果的影響：稱取脫脂漢麻粕5 g, 溶于50 ml蒸餾水中，分別調(diào)節(jié)pH值為8、9、10、11、12，加入2%的堿性蛋白酶，置于水浴鍋中調(diào)節(jié)溫度為60℃進(jìn)行酶解，酶解2 h，測定不同條件下的水解度。

加酶量對酶解效果的影響：稱取脫脂漢麻粕5 g, 溶于50 ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為10，分別加入1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的堿性蛋白酶，置于水浴鍋中調(diào)節(jié)溫度為60℃進(jìn)行酶解，酶解2 h，測定不同條件下的水解度。

酶解時(shí)間對酶解效果的影響：稱取脫脂漢麻粕5 g, 溶于50 ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為10，加入2%的堿性蛋白酶，置于水浴鍋中調(diào)節(jié)溫度為60℃進(jìn)行酶解，分別酶解1、2、3、4、5 h，測定不同條件下的水解度。

料液比對酶解效果的影響：稱取脫脂漢麻粕, 分別按照1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30料液比溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為10，加入2%的堿性蛋白酶，置于水浴鍋中調(diào)節(jié)溫度為60℃進(jìn)行酶解，酶解2 h,測定不同條件下的水解度。

1.2.5 堿性蛋白酶酶解正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定酶解時(shí)間為2 h, 對影響酶解效果的其他因素進(jìn)一步設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定堿性蛋白酶的最佳酶解條件。堿性蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平見表1。

1.2.6 木瓜蛋白酶酶解單因素試驗(yàn)

溫度對酶解效果的影響：稱取脫脂漢麻粕5 g, 溶于50 ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH7，加入0.2%的木瓜蛋白酶，置于水浴鍋中調(diào)節(jié)55、60、65、70、75℃這5個(gè)不同的溫度進(jìn)行酶解2 h，酶解后測定水解度。

pH值對酶解效果的影響：稱取脫脂漢麻粕5 g, 溶于50 ml蒸餾水中，分別調(diào)節(jié)pH值為3、5、7、9、11，加入0.2%的木瓜蛋白酶，置于水浴鍋中調(diào)節(jié)溫度為60℃進(jìn)行酶解2 h，測定不同條件下的水解度。

加酶量對酶解效果的影響：稱取脫脂漢麻粕5 g, 溶于50 ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH7，加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的木瓜蛋白酶，置于水浴鍋中調(diào)節(jié)溫度為60℃進(jìn)行酶解2 h，測定不同條件下的水解度。

酶解時(shí)間對酶解效果的影響：稱取脫脂漢麻粕5 g, 溶于50 ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH7，加入0.2%的木瓜蛋白酶，置于水浴鍋中調(diào)節(jié)溫度為60℃進(jìn)行酶解，分別酶解1、2、3、4、5 h,測定不同條件下的水解度。

料液比對酶解效果的影響：稱取脫脂漢麻粕5 g，按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25料液比溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH7，加入0.2%的木瓜蛋白酶，置于水浴鍋中調(diào)節(jié)溫度為60℃進(jìn)行酶解2 h，測定不同條件下的水解度。

1.2.7 木瓜蛋白酶酶解正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定酶解時(shí)間1 h，對影響酶解效果的其他因素進(jìn)一步設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定木瓜蛋白酶的最佳酶解工藝條件。木瓜蛋白酶的正交試驗(yàn)因素水平見表2。

1.2.8 雙酶酶解試驗(yàn)

為了進(jìn)一步提高酶解效果，采用兩種酶復(fù)合水解，先用一種酶水解，達(dá)到酶解時(shí)間，滅酶后，再用第二種酶酶解。

表2 木瓜蛋白酶酶解正交設(shè)計(jì)表

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

單因素采用Excel 處理，正交試驗(yàn)采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 漢麻粕基本成分

漢麻品種的不同以及漢麻籽油提取工藝的不同，都會(huì)影響漢麻粕的基本成分。對試驗(yàn)所用的漢麻粕采用國標(biāo)法進(jìn)行檢測，基本成分見表3。

表3 漢麻粕基本成分

2.2 單因素及正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 堿性蛋白酶酶解單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 溫度對堿性蛋白酶酶解效果的影響

溫度對堿性蛋白酶酶解效果的影響見圖1。在試驗(yàn)所選的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，水解度呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)，水解度不再顯著變化，表明已達(dá)到酶解的最適宜溫度。因此，選擇55℃作為最佳的酶解溫度。

圖1 溫度對漢麻粕蛋白水解度的影響

2.2.1.2 pH值對堿性蛋白酶酶解效果的影響

pH值對堿性蛋白酶酶解效果的影響見圖2。

圖2 pH值對蛋白水解度的影響

當(dāng)反應(yīng)的pH值在8～10內(nèi)，隨著pH值的升高，水解度增大，當(dāng)pH值大于10時(shí)，水解度呈現(xiàn)下降的趨勢。這是由于pH值的變化能夠引起酶活性中心的分子構(gòu)象的改變，從而影響酶與底物的結(jié)合，影響酶的活性[9]。因此,選擇最佳的酶解pH值為10。

2.2.1.3 酶解時(shí)間對堿性蛋白酶酶解效果的影響

酶解時(shí)間對堿性蛋白酶酶解效果的影響見圖3。隨著酶解時(shí)間的延長，水解度先增大，后來趨于平緩，試驗(yàn)選取2 h為最佳酶解時(shí)間。

圖3 酶解時(shí)間對漢麻粕蛋白水解度的影響

2.2.1.4 加酶量對堿性蛋白酶酶解效果的影響

加酶量對堿性蛋白酶酶解效果的影響見圖4。隨著堿性蛋白酶的添加量增大，水解度隨之增大，當(dāng)添加量達(dá)到2.5%時(shí)，再增大加酶量，水解度趨于平緩，考慮生產(chǎn)成本，確定2.5%作為堿性蛋白酶酶解的添加量。

圖4 加酶量對漢麻粕蛋白水解度的影響

2.2.1.5 料液比對堿性蛋白酶酶解效果的影響 料液比對堿性蛋白酶酶解效果的影響見圖5。料液比影響底物的濃度，底物濃度過高，酶與底物無法在水中充分分散，酶與底物結(jié)合的難度大，影響酶解效果。底物濃度過低，酶分子不能完全與底物蛋白結(jié)合，影響酶效，試驗(yàn)選取1∶15作為最佳的料液比。

圖5 料液比對蛋白酶水解度的影響

2.2.2 堿性蛋白酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，影響堿性蛋白酶酶解的各個(gè)因素主次關(guān)系依次為：溫度、料液比、pH值、加酶量，得出堿性蛋白酶酶解的最佳工藝條件為A2D1B3C3，即酶解溫度為55℃，pH11，料液比為1∶10，加酶量為3%，在此最佳的理論值基礎(chǔ)上進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，得到DH為12.97%。

表4 堿性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.3 木瓜蛋白酶酶解單因素試驗(yàn)

2.2.3.1 溫度對木瓜蛋白酶酶解效果的影響

溫度對木瓜蛋白酶酶解效果的影響見圖6。隨著溫度升高，水解度在55～60℃變化不明顯，60～75℃時(shí)，先增大后降低。酶作為生物催化劑有最適宜的溫度，所以當(dāng)溫度升高時(shí)，酶解作用加強(qiáng)，但溫度過高會(huì)失活變性，所以在一定溫度內(nèi)，酶的催化活力呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢。試驗(yàn)選取70℃作為最佳的酶解溫度。

圖6 溫度對漢麻粕蛋白水解度的影響

2.2.3.2 pH值對木瓜蛋白酶酶解效果的影響

pH值對木瓜蛋白酶酶解效果的影響見圖7。

圖7 pH值對漢麻粕蛋白水解度的影響

pH值能夠影響酶活性中心的構(gòu)象，從而影響酶的活性。試驗(yàn)所選pH值范圍內(nèi)，木瓜蛋白酶酶解，水解度先增大后降低。由圖7可知，pH5為木瓜蛋白酶的最佳酶解pH值。

2.2.3.3 酶解時(shí)間對木瓜蛋白酶酶解效果的影響

酶解時(shí)間對木瓜蛋白酶酶解效果影響見圖8。由圖8可知，隨著酶解時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)的水解度幾乎沒有變化，可見當(dāng)酶解1 h，漢麻粕蛋白已經(jīng)被水解完全。因此,選擇1 h作為最佳的酶解時(shí)間。

圖8 時(shí)間對漢麻粕蛋白水解度的影響

2.2.3.4 加酶量對木瓜蛋白酶酶解效果的影響

酶的添加量對木瓜蛋白酶酶解效果的影響見圖9。隨著木瓜蛋白酶的添加量增大，水解度隨之增大，當(dāng)添加量達(dá)到0.4%時(shí)，再增大加酶量，水解度趨于平緩，考慮生產(chǎn)成本，確定0.4%作為酶最適的添加量。

圖9 加酶量對漢麻粕蛋白水解度的影響

2.2.3.5 料液比對木瓜蛋白酶酶解效果的影響

料液比對木瓜蛋白酶酶解效果的影響見圖10。在試驗(yàn)所選料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，漢麻粕蛋白水解度先增大后降低，在1∶10時(shí)水解度最高。因此，選取1∶10作為最佳的稀釋料液比。

圖10 料液比對漢麻粕水解度的影響

2.2.4 木瓜蛋白酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，影響木瓜蛋白酶酶解的各個(gè)因素主次關(guān)系依次為：pH值、料液比、加酶量、溫度，得出木瓜蛋白酶酶解的最佳工藝條件為B2D1C2A2，即酶解溫度為70℃，pH5，料液比為1∶5，加酶量為0.4%，在此最佳的理論值基礎(chǔ)上進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，得到DH為21.03%。

2.3 雙酶酶解試驗(yàn)

由于單一的酶種水解能力有限，嘗試采用兩種酶復(fù)合水解，以期進(jìn)一步提高漢麻粕蛋白的水解度。首先采用一種酶進(jìn)行酶解，酶解完全后，進(jìn)行滅酶處理，再按照第二種酶的酶解條件繼續(xù)酶解?？紤]到生產(chǎn)操作方便，將料液比按照1∶5、1∶10、先按照1∶5再調(diào)整到1∶10三種條件進(jìn)行試驗(yàn)，其他條件則按照堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶各自酶解最優(yōu)條件進(jìn)行。

由表6可知，先采用堿性蛋白酶酶解再用木瓜蛋白酶解，其水解效果優(yōu)于先木瓜蛋白酶后堿性蛋白酶酶解，分析原因可能是在堿性的條件下，能夠使更多的蛋白質(zhì)從漢麻粕中溶出，增加其與酶的接觸機(jī)會(huì)，故水解效果好，水解度高。通過調(diào)整不同的料液比，發(fā)現(xiàn)采用木瓜蛋白酶在料液比1∶5的條件下，水解效果最佳。

表5 木瓜蛋白酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表6 兩種酶不同酶解順序?qū)h麻水解度的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶對漢麻粕的酶解條件進(jìn)行研究，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了單一酶酶解的條件，并在此基礎(chǔ)上嘗試用兩種酶復(fù)合水解漢麻粕，確定了復(fù)合酶解的工藝條件：調(diào)整料液比1∶5，先采用堿性蛋白酶酶解：溫度55℃、時(shí)間2 h、pH11、加酶量3%，達(dá)到酶解時(shí)間后再高溫滅酶；之后加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，溫度70℃，時(shí)間1 h，料液比1∶5，pH5，加酶量0.4%。通過兩種酶復(fù)合水解，水解度達(dá)到26.42%，極大的提高了水解的效果。

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(責(zé)任編輯：趙琳琳)

Hydrolysis technology ofCannabissativalprotein by bi-enzyme hydrolysis

WEI Lian-hui, SONG Shu-min, DONG Yan,LIU Yu-feng

(Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing 163319,China)

Papain and alkalesceny protease were chosen to hydrolyze the protein ofCannabissatival.By analyzing the degree of hydrolysis ofCannabissativalprotein,the optimum conditions of the enzymolysis were studied.First,it was found the optimum enzymolysis conditions of alkalescency were as liguid-solid ratio of 1∶5,amount of protease 3%,pH11,temperature 55℃ and hydrolysis time of 2 h.After that, papain protease was used to hydrolyze theCannabissativalprotein again.And the optimum conditions were as amount of protase 0.4%,pH5, temperature 70℃ and hydrolyzing time of 1 h. The final degree of hydrolysis was 26.42%.

papain protease;alkalesceny protease;cannabis satival protein； hydrolysis;peptide

2016-09-08；

2017-01-11

黑龍江省財(cái)政廳、黑龍江省科學(xué)院資助項(xiàng)目(20160101)。

魏連會(huì)(1983-)，男，碩士，研究實(shí)習(xí)員，從事功能性食品研究。

宋淑敏(1968-)，女，研究員級高級農(nóng)藝師，主要從事植物生物技術(shù)研究。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.02.005

TS229;TS201.2+5

A

1003-6202(2017)02-0020-05