陳 晨，孫向明，劉 悅，高佳雪，李文蘭

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076)

吳茱萸致肝毒性后大鼠體內(nèi)樣品的穩(wěn)定性研究

陳 晨1，孫向明2，劉 悅1，高佳雪2，李文蘭1

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076)

為了研究吳茱萸致肝毒性后大鼠血清樣品的穩(wěn)定性，采用HPLC-DAD技術(shù)，分別對-20 ℃冰箱中冷凍保存0、3、5、10、15 d未經(jīng)前處理和經(jīng)除蛋白處理后的含藥血清樣品進(jìn)行色譜分析.通過比較各樣品中共有峰相對峰面積的RSD值考察含藥血清樣品的穩(wěn)定性.結(jié)果表明，經(jīng)過除蛋白處理后的血清樣品的共有峰相對峰面積的RSD值均小于20%；部分未經(jīng)前處理的血清樣品共有色譜峰相對峰面積的RSD值大于30%.含藥血清樣品經(jīng)除蛋白和氮?dú)獯蹈商幚砗螅?20 ℃至少可以穩(wěn)定保存15 d；未經(jīng)前處理的含藥血清樣品在-20 ℃存放存在不穩(wěn)定問題.

血清；穩(wěn)定性；吳茱萸；大鼠

隨著中藥在東西方國家中日益廣泛的應(yīng)用，有關(guān)中藥誘發(fā)藥源性肝損傷(DILI)的報(bào)道也逐漸增多[1-4].吳茱萸是一味臨床常用的傳統(tǒng)中藥，歷代本草中記載吳茱萸“有毒”或“小毒”，2006年曾有因大劑量服用吳茱萸出現(xiàn)胸悶、頭痛、視物不清、劇烈腹痛等癥狀的個(gè)案報(bào)道[5].也有學(xué)者指出，肝臟是吳茱萸的毒性靶器官之一[6].近年來，關(guān)于吳茱萸的化學(xué)成分及藥理作用的研究已深入到具體的單體成分[7-14]，但對其肝毒性部位體內(nèi)作用過程及機(jī)制的研究卻鮮有報(bào)道.為了揭示吳茱萸在體內(nèi)的吸收、代謝等過程，常常要采集給藥后的大鼠的血液樣品，樣品的穩(wěn)定性有待考察；此外，在大規(guī)模代謝組學(xué)研究中通常伴隨批量制樣，有些樣品可能會被存儲一段時(shí)間后再進(jìn)行下一步處理.大批量樣品是否必須在采集當(dāng)天測定，其存儲條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何影響，尚無人考察.為此，本文對吳茱萸致肝毒性后大鼠血清樣品存儲的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步考察，為吳茱萸在大鼠體內(nèi)的相關(guān)代謝研究提供可靠的參考依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Waters-600型液相色譜儀(工作系統(tǒng)包括四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、真空脫氣機(jī)、柱溫箱、DAD檢測器、Empower化學(xué)工作站)；臺式低溫離心機(jī)(Avanti30美國BECKMAN)；渦旋混合器XW-80A(上海宇工機(jī)械有限公司)；分析天平(ALC-110.4上海人和科學(xué)儀器有限公司)AR1140 Electronic Analytical Balance(Ohaus International Ltd., USA)；超聲震蕩儀(H66MC美國奧豪斯科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(DK-80上海一恒科技有限公司).

1.2 試劑

吳茱萸藥材(購自三棵樹藥材市場天然藥材經(jīng)銷部)；甲醇(色譜純，山東禹王)；乙腈(色譜純，山東禹王)；甲酸(色譜純，上?？其J)；純凈水(娃哈哈).

1.3 動物

雄性Wistar 大鼠，體重(300±20) g(由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心購入：批號SCXK-(黑)2006-2010).

2 方法與結(jié)果

2.1 灌胃溶液的制備

吳茱萸藥材粗粉，50%乙醇回流提取，溶劑用量以及提取時(shí)間為8倍量120 min(1次)、7倍量90 min(1次)，合并2次提取液，減壓濃縮，得到浸膏，保存于冰箱備用.給藥前，用蒸餾水溶解成約1.4 g生藥材/mL的灌胃藥液備用.

2.2 含藥血清樣品的采集

選取Wistar雄性大鼠，將大鼠放于代謝籠中適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d.灌胃給藥前稱重，按35 g·kg/d(按生藥計(jì))的劑量給予大鼠灌胃藥液(25 mL/kg)，每天1次，連續(xù)灌胃給藥14 d，灌胃后放回代謝籠中.末次給藥60 min后，以2 mL/kg水合氯醛(10%)腹腔注射麻醉，經(jīng)肝門靜脈取血，放置，充分凝血后，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，上清液即為含藥血清.

2.3 含藥血清樣品的處理

取含藥血清3.0 mL，加入4倍量甲醇，于離心管中充分渦旋混勻1 min，再以4 ℃、14 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，小心吸取上清液，氮?dú)獯蹈桑?20 ℃.用微量移液器精密加入1 mL色譜甲醇充分溶解殘留物.經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，取20 μL進(jìn)行HPLC色譜分析.

2.4 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18(5 μm, 250×4.6 mm)；

保護(hù)柱：Nova-PakC18Guard-PakTM；

柱溫：25 ℃；

進(jìn)樣量：血清20 μL，

流動相：乙腈-0.2%甲酸水溶液；

檢測波長：血清300 nm；

梯度洗脫條件：見表1.

表1 流動相梯度變化程序

t/min0．2%甲酸/%乙腈/%08515406832652080752080808515

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

含藥血清樣品按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰，見圖1.

圖1 精密度實(shí)驗(yàn)色譜圖

含藥血清樣品分別以4號峰為參照物峰，計(jì)算10個(gè)共有色譜峰相對峰面積的RSD值，均小于5%，表明儀器精密度良好.

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取5份含藥血清，每份3.0 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理.5個(gè)平行含藥血清樣品的HPLC色譜圖見圖2.

圖2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)色譜圖

分別計(jì)算含藥血清平行樣品中10個(gè)共有色譜峰相對峰面積的RSD值，均小于10%.從以上的結(jié)果來看，樣品制備方法的重復(fù)性良好，樣品前處理的方法是可靠的.

2.7 穩(wěn)定性的考察

2.7.1 樣品經(jīng)前處理后凍存的穩(wěn)定性考察

該組實(shí)驗(yàn)考察樣品氮?dú)獯蹈珊蟮拇鎯r(shí)間對樣品穩(wěn)定性的影響.樣品前處理步驟如“2.3”項(xiàng)下所示，在氮?dú)獯蹈扇軇┖?，將樣品存放?20 ℃下，在各時(shí)間點(diǎn)(0、3、5、10、15 d)取出，于25 ℃解凍，繼續(xù)后面的處理步驟，樣品共有峰相對峰面積的RSD值見表2.

表2 除蛋白后凍存的血清樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(相對峰面積)

峰號實(shí)驗(yàn)次數(shù)0d3d5d10d15dRSD/%10．31020．30940．37860．38160．40340．1220．29630．30140．32350．33350．43670．1730．10020．15470．12020．11930．12350．16411111050．07370．07530．09320．09560．09870．1460．03050．02740．03690．04210．03360．1770．26450．34350．34780．35570．36140．1280．15410．15030．14190．12130．11470．1390．65750．63570．53530．52640．54160．11100．80210．78570．71350．61680．60240．13

結(jié)果顯示，經(jīng)過處理的含藥血清樣品氮?dú)獯蹈珊蟠娣庞?20 ℃15 d，各時(shí)間點(diǎn)樣本的10個(gè)共有峰相對峰面積的RSD值均小于20%，表明該方法處理的樣本15 d內(nèi)穩(wěn)定性良好[15-16].

2.7.2 樣品未經(jīng)處理凍存的穩(wěn)定性考察

該組實(shí)驗(yàn)考察樣品未經(jīng)處理凍存的存儲時(shí)間對樣品穩(wěn)定性的影響.樣品于采集當(dāng)天存放于-20 ℃下，采集方法如“2.2”項(xiàng)下所示，在各時(shí)間點(diǎn)(0、3、5、10、15 d)取出，于25 ℃解凍后，按 “2.3”項(xiàng)下方法處理，血清樣品共有峰相對峰面積的RSD值見表3.

表3 未經(jīng)處理凍存的含藥血清樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(相對峰面積)

峰號實(shí)驗(yàn)次數(shù)0d3d5d10d15dRSD/%10．17670．16850．17250．19160．04670．3921．38521．38151．02471．66941．36360．1730．37150．35460．34790．33260．31250．07411111050．21460．18160．34350．29820．19780．2860．22350．12560．11260．19890．16420．2970．64340．63680．66120．68350．88460．1580．26250．27590．28150．19590．39150．2590．94350．93680．85340．82240．27240．37100．79350．54680．54120．30350．28460．42

由表3可見，未經(jīng)前處理凍存的含藥血清10個(gè)共有色譜峰中，1、9、10號峰的RSD值均大于30%，表明1、9、10號峰所代表的成分含量具有顯著性差異；5、6、8號峰的RSD值分別為28%、29%、25%，表明該三個(gè)峰所代表的成分含量有差異；其余共有色譜峰的RSD值均小于20%，表明其余峰所代表的成分含量相對穩(wěn)定.結(jié)果表明，將采集的血清樣本不經(jīng)前處理直接凍存15 d，對部分成分的穩(wěn)定性會造成比較明顯的影響.

3 討 論

中藥成分的代謝規(guī)律不明確、代謝產(chǎn)物制備困難等因素都在很大程度上制約了中藥在體內(nèi)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.代謝產(chǎn)物的研究在中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)方面必不可少，有些中藥的代謝產(chǎn)物可能是其發(fā)揮藥效的重要來源.在大規(guī)模代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)中通常伴隨大量樣品的采集和檢測，有些樣品可能會被放置一段時(shí)間后再進(jìn)行下一步處理[16-17].然而，所有影響樣品穩(wěn)定性的因素均有可能對藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響.

目前對吳茱萸的化學(xué)成分及藥理作用研究比較廣泛，而關(guān)于吳茱萸的肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)尚未見詳實(shí)研究報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)已明確吳茱萸致肝毒性的劑量下，連續(xù)給藥14 d后對采集到的大鼠血清樣本進(jìn)行穩(wěn)定性考察.結(jié)果表明：除蛋白后的含藥血清樣品在-20 ℃至少可以穩(wěn)定保存15 d；未經(jīng)前處理，將樣品凍存在-20 ℃會對含藥血清樣品產(chǎn)生顯著影響.鑒于未經(jīng)前處理凍存血清樣品1、9、10號共有色譜峰相對峰面積的RSD值均大于30%，說明其具有顯著性差異，9、10號共有色譜峰的峰面積隨時(shí)間增長而明顯減小，說明其色譜峰所代表的成分含量隨凍存時(shí)間的增加而減小；5、6、8號峰的RSD值均大于20%，表明該三個(gè)峰所代表的成分含量有差異，結(jié)果表明血清樣品未經(jīng)前處理凍存的穩(wěn)定性不好.因此，為了更好的反應(yīng)數(shù)據(jù)的真實(shí)性，在-20 ℃存儲樣品時(shí)，建議將血清樣品除蛋白氮?dú)獯蹈珊筮M(jìn)行冷凍儲存，最好將大批量實(shí)驗(yàn)分成小組進(jìn)行[18].

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Research on stability of serum sample in hepatic injury rats caused by Evodia Rutaecarpa

CHEN Chen1, SUN Xiang-ming2, LIU Yue1, GAO Jia-xue2, LI Wen-lan1

(1.School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2.Research Center on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

To investigate the stability of serum sample in rats with hepatic injury caused by Evodia rutaecarpa, the drug-containing serum samples without pretreatment and that treated with deproteinization method were stored at -20 °C for different time (0 d, 3 d, 5 d, 10 d and 15 d), and then detected by HPLC-DAD, respectively. The stability of the serum sample was evaluated by comparing theRSDvalues of relative peak area of common peaks in each sample. Results indicated that all of theRSDvalues of common peak areas of preprocessed serum samples were less than 20%, and that of untreated samples were partly more than 30%. The serum samples treated with deproteinization method could be stored steadily at -20 °C for 15 d. However, the untreated serum samples are not stable at -20 °C within 15 d.

serum; stability; Evodia rutaecarpa; rat

2015-04-20.

哈爾濱市科技局科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目(2015RQXXJ011)

陳 晨(1992-)，女，碩士，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

李文蘭(1967-)，女，碩士，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

R285

A

1672-0946(2017)01-0004-04