牛夢旗, 朱家文, 陳 葵, 吳艷陽, 楊生武, 應(yīng)喜平

(1.華東理工大學(xué)化學(xué)工程研究所,上海 200237; 2.呼倫貝爾北方藥業(yè)有限公司,內(nèi)蒙古 牙克石 022150)

必特螺旋霉素的工業(yè)結(jié)晶過程

牛夢旗1, 朱家文1, 陳 葵1, 吳艷陽1, 楊生武2, 應(yīng)喜平2

(1.華東理工大學(xué)化學(xué)工程研究所,上海 200237; 2.呼倫貝爾北方藥業(yè)有限公司,內(nèi)蒙古 牙克石 022150)

以未知雜質(zhì)為考察的著重點,探索了25 ℃下必特螺旋霉素最佳結(jié)晶時的pH以及同一pH下溫度對工業(yè)結(jié)晶的影響。利用高效液相色譜對結(jié)晶產(chǎn)品進(jìn)行檢測,并用外標(biāo)法對必特螺旋霉素中各部分雜質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的分析,通過對比結(jié)晶過程有效組分和總未知雜質(zhì)對螺旋霉素的選擇性系數(shù),在兼顧有效組分含量合格和雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的前提下,確定最優(yōu)結(jié)晶終點pH為7.5～8.0,最優(yōu)結(jié)晶溫度為25～35 ℃。該方法首次以未知雜質(zhì)的含量變化來探索必特螺旋霉素結(jié)晶的規(guī)律,工業(yè)上便于實施,有利于指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)。

必特螺旋霉素; 結(jié)晶pH; 選擇性系數(shù); 雜質(zhì)

必特螺旋霉素(Bitespiramycin,BT)是一種十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,由王以光等[1]采用基因重組技術(shù)研制開發(fā)的一類新藥,為國內(nèi)首例具有自主知識產(chǎn)權(quán)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。BT是多種結(jié)構(gòu)類似組分的混合物,與螺旋霉素在體外有相似的抗菌活性,而在體內(nèi)其藥代動力學(xué)行為明顯優(yōu)于螺旋霉素[2]。

不同于其他抗生素,BT是一種由多組分組成的復(fù)合型抗生素。對BT結(jié)晶過程的研究已有諸多報道[3-5],而以未知雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化作為結(jié)晶過程考察的重點,還鮮有報道。在BT工業(yè)生產(chǎn)中,未知雜質(zhì)的去除是產(chǎn)品合格的難點。本研究將結(jié)晶操作設(shè)置在未知雜質(zhì)析出率較低的pH范圍內(nèi),同時兼顧有效組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和其他雜質(zhì)的分離,進(jìn)而達(dá)到BT純化目標(biāo)。25 ℃下,研究反應(yīng)結(jié)晶終點pH對BT有效組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、總未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及各部分雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響,并比較BT結(jié)晶過程中各組分和未知雜質(zhì)對螺旋霉素的選擇性系數(shù),在確保有效組分合格的前提下,依據(jù)總未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢確定最優(yōu)結(jié)晶pH。同時,本文亦探究了同一pH下溫度對結(jié)晶過程中有效組分和雜質(zhì)的影響。這種以未知雜質(zhì)為切入點來研究BT結(jié)晶的工藝,綜合了由于發(fā)酵差異造成的BT發(fā)酵液組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異對提煉過程的影響,可以有效指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Water E2695高效液相色譜儀(美國Waters公司);TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 材料

乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、硫酸、氫氧化鈉、乙酸銨均為分析純;乙腈為色譜純;BT標(biāo)準(zhǔn)品,異戊酰螺旋霉素Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.1%;乙酰螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品,效價為927 u/mg。BT反萃取液(BT效價為15 221 u/mL,其中異戊酰螺旋霉素Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.05%,異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.26%,總酰化螺旋霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.44%,未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.98%)從溶媒萃取法提取工藝中得到,其初始發(fā)酵液由呼倫貝爾北方藥業(yè)有限公司提供。

1.3 實驗方法

經(jīng)溶媒萃取法獲得含有BT的反萃取液,向反萃取液中持續(xù)鼓入空氣3 h,以去除溶于其中的微量乙酸丁酯,即得結(jié)晶液。滴加堿液中和H+使BT結(jié)晶析出,同一溫度下分別控制不同的結(jié)晶終點pH,以及同一pH下分別控制不同的結(jié)晶溫度。結(jié)晶液經(jīng)抽濾烘干后得BT成品。

采用化學(xué)效價法[6-7]測定結(jié)晶后母液中BT的質(zhì)量分?jǐn)?shù),可由分光光度計測定其吸光值實現(xiàn)。

用高效液相色譜(HPLC)[8-9]對BT結(jié)晶產(chǎn)品進(jìn)行分析,用外標(biāo)法計算組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 BT雜質(zhì)分類

研究發(fā)現(xiàn),BT中含有10余種螺旋霉素類衍生物[10],圖1所示為BT的液相色譜圖,根據(jù)液相色譜出峰原理可知,BT中各組分極性強(qiáng)弱不同,其極性順序為:螺旋霉素Ⅲ>乙酰螺旋霉素Ⅱ>乙酰螺旋霉素Ⅲ>丙酰螺旋霉素Ⅱ>丙酰螺旋霉素Ⅲ>丁酰螺旋霉素Ⅱ>異戊酰螺旋霉素Ⅰ>丁酰螺旋霉素Ⅲ>異戊酰螺旋霉素Ⅱ>異戊酰螺旋霉素Ⅲ。

1—Spiramycin Ⅲ; 2—Acetylspiramycin Ⅱ; 3—Acetylspiramycin Ⅲ; 4—Propionylspiramycin Ⅱ; 5—Propionylspiramycin Ⅲ; 6—Butanoylspiramycin Ⅱ; 7—(iso)Valeryspiramycin Ⅰ; 8—Butanoylspiramycin Ⅲ; 9—(iso)Valeryspiramycin Ⅱ; 10—(iso)Valeryspiramycin Ⅲ

依據(jù)各組分極性強(qiáng)弱的不同,將極性大于乙酰螺旋霉素Ⅱ的雜質(zhì)命名為強(qiáng)極性雜質(zhì),將極性在乙酰螺旋霉素Ⅱ與異戊酰螺旋霉素Ⅲ之間的雜質(zhì)命名為組分間雜質(zhì),將極性小于異戊酰螺旋霉素Ⅲ的雜質(zhì)命名為弱極性雜質(zhì)。工業(yè)生產(chǎn)中BT合格品組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為[11]:異戊酰螺旋霉素Ⅲ,w≥30%;異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,w≥60%;總?；菪顾?w≥80%;螺旋霉素,w≤1%;總未知雜質(zhì),w≤5%。

2.2 BT各組分選擇性系數(shù)與結(jié)晶析出率的關(guān)系

2.2.1 化學(xué)效價 調(diào)節(jié)結(jié)晶液至某一特定pH,BT在結(jié)晶產(chǎn)品和母液中達(dá)到反應(yīng)平衡,反應(yīng)方程式如下:

(1)

為便于研究,結(jié)晶產(chǎn)品中的BT量用化學(xué)效價(Chemical Titer)來表示。將結(jié)晶液過濾,所得濾餅烘干,即得BT產(chǎn)品,總效價Tp可表示如下:

(2)

其中,cp為BT產(chǎn)品的化學(xué)效價,單位為u/mg;m為BT產(chǎn)品的質(zhì)量,單位為mg。

未結(jié)晶水相中BT的總化學(xué)效價Ts可表示如下:

(3)

其中,cs為未結(jié)晶水相BT的化學(xué)效價,單位為u/mL;V為溶液總體積,單位為mL。

以BT中i組分作考察對象,結(jié)晶液經(jīng)過濾后得母液,則i組分在結(jié)晶母液中的總效價可表示為:

(4)

其中Tri為i組分在結(jié)晶母液中的總效價;Tsi為i組分在未結(jié)晶水相中的總效價;Tpi為i組分在結(jié)晶產(chǎn)品中的總效價,單位均為u。

2.2.2 分配系數(shù)i組分在結(jié)晶產(chǎn)品和母液中的分配系數(shù)A可表示如下:

(5)

2.2.3 選擇性系數(shù) 假設(shè)組分1的分配系數(shù)為A1,組分2的分配系數(shù)為A2,則組分2對組分1的選擇性系數(shù)K可表示為:

(6)

式中,Y1為組分1的結(jié)晶收率;Y2為組分2的結(jié)晶收率,可分別表示如下:

(7)

(8)

式中,wp1、ws1分別為組分1在結(jié)晶產(chǎn)品和未結(jié)晶水相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù);wp2、ws2分別為組分2在結(jié)晶產(chǎn)品和未結(jié)晶水相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù),利用HPLC分析成品即可得到各個組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

選擇性系數(shù)K值越大,則結(jié)晶操作對組分2的選擇性越高,對組分1的去除越有利。BT中螺旋霉素的極性大于各有效組分,故以螺旋霉素為基準(zhǔn),在某一pH下,比較各有效組分對螺旋霉素的選擇性系數(shù),可以表征同一pH下各組分結(jié)晶析出率的差異。

如圖2所示,隨著分子極性的降低,各組分對螺旋霉素的選擇性系數(shù)逐漸增大,說明在螺旋霉素結(jié)晶析出率相同的前提下,各組分結(jié)晶析出率的大小順序為:異戊酰螺旋霉素Ⅲ>異戊酰螺旋霉素Ⅱ>丁酰螺旋霉素Ⅲ>異戊酰螺旋霉素Ⅰ>丁酰螺旋霉素Ⅱ>丙酰螺旋霉素Ⅲ>丙酰螺旋霉素Ⅱ>乙酰螺旋霉素Ⅲ>乙酰螺旋霉素Ⅱ,且各組分在該結(jié)晶pH下均有析出,而析出率的不同最終會影響產(chǎn)品的組分分布。

a—Acetylspiramycin Ⅱ; b—Acetylspiramycin Ⅲ; c—Propionylspiramycin Ⅱ; d—Propionylspiramycin Ⅲ; e—Butanoylspiramycin Ⅱ; f—(iso)Valeryspiramycin Ⅰ; g—Butanoylspiramycin Ⅲ; h—(iso)Valeryspiramycin Ⅱ; i—(iso)Valeryspiramycin Ⅲ

2.3 結(jié)晶終點pH對組分分布的影響

2.3.1 結(jié)晶液pH及結(jié)晶收率的變化 當(dāng)溫度為25 ℃時,向效價為15 221 u/mL的70 mL BT結(jié)晶液中滴加1.0 mol/L的NaOH溶液,結(jié)晶液的pH隨NaOH滴加體積的變化如圖3所示,可見在結(jié)晶后期pH的變化較為迅速。

圖3 結(jié)晶pH隨NaOH體積的變化

BT在過堿條件下,苷鍵及酯鍵均易水解使產(chǎn)物降解[12-13],控制合適的終點pH,可以有效避免因pH過高而使BT失效。圖4所示為產(chǎn)品收率與母液效價隨pH的變化情況,隨著結(jié)晶終點pH的提高,母液中BT的量逐漸減少,結(jié)晶產(chǎn)品收率與過濾后的母液效價均趨于穩(wěn)定。當(dāng)pH=8.2時,結(jié)晶收率為88.73%；當(dāng)pH=8.4時,結(jié)晶收率為89.07%,說明結(jié)晶液中絕大部分BT已結(jié)晶析出。綜合考慮BT在堿性條件下的穩(wěn)定性和結(jié)晶收率,將終點pH控制在低于8.5為宜。

圖4 產(chǎn)品收率及母液效價隨pH的變化

2.3.2 選擇性系數(shù)和組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨pH的變化 圖5所示為有效組分和總未知雜質(zhì)對螺旋霉素的選擇性系數(shù)隨終點pH的變化,隨著終點pH的升高,異戊酰螺旋霉素Ⅲ、異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總和、總?；菪顾氐倪x擇性系數(shù)先增加后逐漸降低,在pH為7.5～8.0時達(dá)到最大值,而在此范圍內(nèi),總未知雜質(zhì)的選擇性系數(shù)有一最小值,因此將結(jié)晶終點pH控制在這一范圍內(nèi)是合適的。

圖6所示為BT成品中有效組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨結(jié)晶終點pH的變化。由圖可見,隨著結(jié)晶終點pH的升高,異戊酰螺旋霉素Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)及異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)下降的趨勢,而總?；菪顾刭|(zhì)量分?jǐn)?shù)則趨于平穩(wěn)。當(dāng)pH>8.0時,異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于60%,未達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。由前述可知,有效組分異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ極性均偏弱,在同一結(jié)晶pH下,弱極性組分異戊酰螺旋霉素Ⅲ的結(jié)晶析出率最大,異戊酰螺旋霉素Ⅱ和異戊酰螺旋霉素Ⅰ次之,隨著pH的升高,強(qiáng)極性組分的析出率逐漸增大,使異戊酰螺旋霉素Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)和異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨結(jié)晶pH的升高而降低。有效組分極性在強(qiáng)、弱極性范圍內(nèi)均有分布,故總?；菪顾刭|(zhì)量分?jǐn)?shù)隨pH的增加呈波動狀態(tài)。

圖5 不同終點pH下各組分的選擇性系數(shù)變化

圖6 有效組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨終點pH的變化

圖7所示為總未知雜質(zhì)和各部分雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨結(jié)晶終點pH的變化,由圖可知,總未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)先減小后增大,當(dāng)結(jié)晶終點pH為7.5～8.0,總未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%,達(dá)到了合格的標(biāo)準(zhǔn)。強(qiáng)極性雜質(zhì)、組分間雜質(zhì)以及弱極性雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨pH的變化趨勢有所不同,強(qiáng)極性雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨終點pH的增大而逐漸增大,組分間雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)先減小后增大,而弱極性雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)則逐漸減小。當(dāng)pH=7.2時,未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.07%,此時弱極性雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.54%,組分間雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.13%。然而,過于增大結(jié)晶終點pH,只能使強(qiáng)極性雜質(zhì)大量析出結(jié)晶,亦在一定程度上增加了未知雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),降低產(chǎn)品品質(zhì)。如圖7,當(dāng)pH=8.4時,未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.02%,強(qiáng)極性雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.38%,而此時組分間雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.10%,這說明過高或過低的pH均能使組分間雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變大,合適的結(jié)晶pH能合理均衡雜質(zhì)和有效組分的比例。

圖7 未知雜質(zhì)隨結(jié)晶終點pH的變化

2.4 結(jié)晶溫度對組分分布的影響

向濃度為15 221 u/mL的70 mL BT結(jié)晶液中滴加1.0 mol/L的NaOH溶液,分別在20,30,40,50,60 ℃下進(jìn)行結(jié)晶操作,控制BT結(jié)晶終點pH為7.75。圖8所示為有效組分和總未知雜質(zhì)對螺旋霉素的選擇性系數(shù)隨溫度的變化。隨著結(jié)晶溫度的升高,異戊酰螺旋霉素Ⅲ、異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總和、總?；菪顾氐倪x擇性系數(shù)先增加后降低,而在25～35 ℃范圍內(nèi),總未知雜質(zhì)的選擇性系數(shù)有一最小值。

圖8 不同溫度下各組分的選擇性系數(shù)變化

BT在水溶液中的溶解度具有隨溫度升高而降低的負(fù)溶解特性[3],因此,控制相同的結(jié)晶終點pH,升高溫度可以使更多的BT從水相中結(jié)晶出來。圖9所示為BT成品中有效組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨結(jié)晶溫度的變化,圖10所示為總未知雜質(zhì)和各部分雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨結(jié)晶溫度的變化。可以推測,極性不同的組分其結(jié)晶析出率受溫度影響較大,弱極性組分在低溫下的結(jié)晶析出率較大,隨著溫度的升高,強(qiáng)極性組分析出率逐漸增大,有效組分和雜質(zhì)含量呈現(xiàn)如圖9、10所示的變化趨勢。綜合考慮BT成品中組分分布,將結(jié)晶溫度控制在25～35 ℃。

圖10 未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨溫度的變化

3 優(yōu)化工藝與傳統(tǒng)工藝對比分析

傳統(tǒng)工藝以效價和結(jié)晶回收率決定結(jié)晶終點pH,pH控制在8.2～8.5。優(yōu)化工藝基于BT組分分布特點決定結(jié)晶終點pH,pH控制在7.5～8.0。

為進(jìn)一步說明優(yōu)化工藝可行,進(jìn)行3批驗證實驗。25 ℃下,分別控制結(jié)晶終點pH為8.2～8.5和7.5～8.0,將結(jié)晶抽濾烘干,用HPLC法分析BT成品中有效組分、螺旋霉素以及未知雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)并列于表1。由表可見,與傳統(tǒng)工藝相比,優(yōu)化工藝將結(jié)晶終點pH控制在7.5～8.0,異戊酰螺旋霉素Ⅲ、異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯提高,螺旋霉素、未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低,優(yōu)化工藝中的第2批和第3批的BT成品均達(dá)到了合格的標(biāo)準(zhǔn),表明將結(jié)晶終點pH控制在7.5～8.0可有效提高BT成品的合格率。

表1 優(yōu)化工藝與傳統(tǒng)工藝結(jié)果比較

4 結(jié) 論

結(jié)晶過程是工業(yè)生產(chǎn)中分離純化BT很重要的一部分,雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是決定產(chǎn)品能否合格的關(guān)鍵因素。利用高效液相色譜對成品進(jìn)行梯度洗脫,在保證有效組分合格和未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)盡可能低的前提下,確定最優(yōu)結(jié)晶終點pH。本研究結(jié)果表明,當(dāng)結(jié)晶終點pH控制在7.5～8.0,結(jié)晶溫度為25～35 ℃時,可以使雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最小,從而優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量,指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)。驗證實驗表明,25 ℃下,將pH控制在7.5～8.0可有效提高異戊酰螺旋霉素Ⅲ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的總質(zhì)量分?jǐn)?shù),降低螺旋霉素和總未知雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),提高BT成品的合格率。

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Crystallization Process of Bitespiramycin

NIU Meng-qi1, ZHU Jia-wen1, CHEN Kui1, WU Yan-yang1, YANG Sheng-wu2, YING Xi-ping2

(1.Chemical Engineering Research Center,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237,China; 2.Hulun Buir North Pharmaceutical Co. Ltd,Yakeshi 022150, Inner Mongolia,China)

Taking unknown impurities as the focal point,the optimum crystallization pH value was investigated at 25 ℃.The effect of temperature on crystallization process was explored at a certain pH value.Gradient elution was utilized to analyze components and impurities in product.Selectivity coefficients of effective components and total unknown impurities to spiramycin were compared with each other.In view of qualified effective compositions and lower impurities contents,the most suitable terminal pH value of crystallization operation was 7.5-8.0,temperature was 25-35 ℃.The variation of unknown impurities contents was first adopted to explore bitespiramycin crystallization in the existing studies,which would have a profound guiding significance for the practical production.

bitespiramycin; crystallization pH value; selectivity coefficient; impurities

1006-3080(2017)01-0023-06

10.14135/j.cnki.1006-3080.2017.01.004

2016-05-18

上海市科委生物醫(yī)藥科技重點項目(10431901500)

牛夢旗(1989-),女,山東菏澤人,碩士生,主要從事抗生素分離純化的研究。E-mail:niu1259900193@163.com

陳 葵,E-mail:chenkui@ecust.edu.cn

TQ460.6+3

A