吳連連，袁紅花，朱孝榮

（徐州醫(yī)科大學(xué) 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，2.神經(jīng)生物研究中心，江蘇 徐州 221004）

外源性胰島素樣生長因子-1對老年小鼠認(rèn)知功能的影響*

吳連連1，袁紅花2，朱孝榮1

（徐州醫(yī)科大學(xué) 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，2.神經(jīng)生物研究中心，江蘇 徐州 221004）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.005

目的探討胰島素樣生長因子-1（IG F-1）對老年小鼠認(rèn)知功能的影響機(jī)制。方法給予老年C 57/BL6小鼠側(cè)腦室注射IG F-1，W es t ern bl ot檢測胰島素樣生長因子-1受體（IG F-1R）蛋白的表達(dá)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）熒光染色標(biāo)記海馬齒狀回增殖的細(xì)胞，尼氏染色標(biāo)記海馬齒狀回神經(jīng)元，用M orri s水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)評定老年小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果W es t ern bl ot檢測顯示，IG F-1組老年小鼠海馬中IG F-1R表達(dá)與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。BrdU染色結(jié)果顯示，IG F-1組海馬BrdU陽性細(xì)胞數(shù)與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。尼氏染色結(jié)果顯示，IG F-1組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過訓(xùn)練后，IG F-1組老年小鼠的逃避潛伏期短于對照組，穿過平臺(tái)的次數(shù)與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，IG F-1組老年小鼠的基礎(chǔ)錯(cuò)誤次數(shù)減少，而潛伏期延長（P＜0.05）。結(jié)論老年小鼠注射IG F-1后，其認(rèn)知功能有一定改善，IG F-1可以提高老年小鼠認(rèn)知功能。

胰島素樣生長因子-1；老年鼠；5-溴脫氧尿嘧啶核苷；水迷宮；認(rèn)知功能

衰老是動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的一個(gè)自然的生物學(xué)過程。隨著年齡的增長，大腦功能也呈現(xiàn)衰退的現(xiàn)象。老年人常表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知能力的下降，這與腦老化、神經(jīng)系統(tǒng)退變有關(guān)。海馬是大腦中與學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系最密切的一個(gè)腦區(qū)結(jié)構(gòu)[1]，腦老化及神經(jīng)系統(tǒng)退變都與海馬結(jié)構(gòu)的變化有著密切的關(guān)系。

胰島素樣生長因子-1（i nsul i n-l i ke growt h f act ors-1，IGF-1）是一種細(xì)胞分裂素，在神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞成活中起重要作用[2-3]。隨著年齡的增長及神經(jīng)系統(tǒng)病變引起的認(rèn)知缺陷可能與IGF-1缺乏有關(guān)[4]。本實(shí)驗(yàn)擬通過給予老年小鼠海馬注射IGF-1，研究老年鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的變化及其學(xué)習(xí)記憶能力的改變，以探討外源性IGF-1對老年小鼠認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24個(gè)月齡C57/BL6小鼠40只，雌雄各半，體重30～35 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分組為對照組（12只）、生理鹽水組（14只）和IGF-1組（14只）。

1.1.2 試劑與儀器 重組人IGF-1（美國Chem i con公司），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-brom o-2-deoxyuridi ne，BrdU）（美國Si gm a公司），小鼠抗BrdU單克隆抗體（德國Cal bi ochem公司），小鼠抗胰島素樣生長因子-1受體（i nsul i n-l i ke growt h f act or 1 recept or，IGF-1R）單克隆抗體（美國Sant a Cruze公司），山羊抗小鼠免疫球蛋白 G/異硫氰酸熒光素（美國Bi oworl d公司），尼氏染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），M orri s水迷宮系統(tǒng)（美國Act i m et ri cs公司），小鼠跳臺(tái)儀（D．rT-2）（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），腦立體定位儀（美國Davi d Kopf Inst rum ent s公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 立體定位注射 小鼠經(jīng)麻醉后，固定于腦立體定位儀上，頭頂部去毛，消毒皮膚，頭頂部正中切口，暴露前囟，按小鼠腦立位圖譜，坐標(biāo)為（AP：0.02 m m，M L：8.50 m m，DV：22.50 m m），注射2μl IGF-1。留針5 m i n，慢慢退出注射器，退針2 m i n。對照組注射等量的生理鹽水。

1.2.2 BrdU給藥 先配制好10 m g/m l BrdU溶液，按預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)給各組小鼠腹腔注射BrdU。給藥劑量為每次50 m g/kg，腹腔注射6次，1次/12 h，連續(xù)3 d，最后1次注射24 h后灌注固定取腦。

1.2.3 W es t ern bl ot檢測 海馬組織加入適量的蛋白裂解液，勻漿器勻漿，靜置15 m i n，4℃、8 000 r/m i n離心20 m i n，吸取上清。蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度，加入相應(yīng)量的4×十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液，沸水煮5m i n處理蛋白。等量蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（pol yacryl am i de gel el ect rophoresi s，SDS-PAGE）分離后，用半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%牛血清白蛋白封閉后加入抗體，IGF-1R抗體（1∶600），4℃孵育過夜。洗滌后加入相應(yīng)的二抗[IRD yeTM680 cm標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體（1∶1 000）]，室溫避光孵育1 h，洗膜。Odyssey激光成像系統(tǒng)掃描，結(jié)果以圖像處理儀分析處理。

1.2.4 BrdU免疫熒光染色 小鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定，取腦，固定過夜。經(jīng)30%蔗糖脫水沉糖，行冷凍切片，切片厚10 μm，先以2 m ol鹽酸溶液處理使DNA變性，37℃ 30 m i n，以pH=8.5的0.1 m ol硼酸室溫中和10 m i n，10%山羊血清封閉40 m i n，滴加一抗，BrdU抗體（1∶500），4℃孵育過夜。滴加熒光二抗（1∶100）孵育1.5 h，封片并于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 尼氏染色 凍切片10 μm充分晾干，70%酒精脫脂＞4 h，入蒸餾水洗數(shù)分鐘；0.05%焦油紫醋酸水溶液染色數(shù)分鐘（鏡下觀察），100%酒精1 m i n，二甲苯透明，封片。

1.2.6 M orri s水迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)室溫度保持在24～26℃，水面高過安全平臺(tái)1cm，水溫保持在20～22℃。將小鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄其在90 s內(nèi)找到安全平臺(tái)的時(shí)間（潛伏期）。如果大鼠在90 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)人員用手牽引至平臺(tái)上，讓大鼠停留20 s，再放回籠中，潛伏期記作90 s。實(shí)驗(yàn)1～7 d，3次/d，其中第1～4天為訓(xùn)練期，第5～7天為定位航行測試，第8天，為空間探測能力評估。第8天，移去平臺(tái)，讓小鼠自由游泳120 s，并記錄下120 s內(nèi)小鼠穿過平臺(tái)位置的次數(shù)，作為空間探測能力評估。

1.2.7 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) M orri s水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠休息5 d，進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，測試各組小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能。實(shí)驗(yàn)時(shí)，保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)安靜，維持室溫在24～26℃。將參加實(shí)驗(yàn)的各組小鼠先放入反應(yīng)箱內(nèi)自由活動(dòng)5 m i n，熟悉環(huán)境。然后接通銅柵電源（0.25 m A，交流電流），小鼠受到電擊后其正常反應(yīng)是尋找安全跳臺(tái)以躲避電擊。記錄各組小鼠跳下安全跳臺(tái)的時(shí)間（潛伏期）和5 m i n內(nèi)受到的電擊次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)），作為記憶測試成績。實(shí)驗(yàn)時(shí)，若小鼠停留在安全跳臺(tái)的時(shí)間＞5 m i n，其潛伏期以5 m i n計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用圖像軟件Phot oshop 5.0對圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，資料用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析（One-W ay，ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬內(nèi)IGF-1R蛋白的表達(dá)

提取IGF-1組、生理鹽水組及對照組海馬蛋白，做W est ern bl ot檢測，結(jié)果顯示，IGF-1組海馬內(nèi)IGF-1R蛋白相對表達(dá)量（0.44±0.04）高于生理鹽水組（0.31±0.04）及對照組（0.29±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.372，P=0.038）。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬IGF-1R蛋白的表達(dá)

2.2 海馬內(nèi)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)的變化

以BrdU標(biāo)記海馬內(nèi)新增殖的細(xì)胞，免疫熒光染色結(jié)果顯示，IGF-1組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)（14.00±0.57）高于生理鹽水組（4.00±1.00）及對照組（4.00±0.57），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.258，P=0.006）。見圖2。

2.3 海馬內(nèi)尼氏染色結(jié)果

以尼氏染色法觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞的分布，結(jié)果顯示，IGF-1組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)（329.00±4.91）高于生理鹽水組（254.00±6.11）及對照組（257.00±3.28），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.362，P=0.008）。見圖3。

2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測試，在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，與生理鹽水組及對照組比較，IGF-1組小鼠搜索平臺(tái)潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.189，P= 0.023）；穿過平臺(tái)的次數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.486，P=0.017）。見圖4。

2.5 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與生理鹽水組及對照組比較，IGF-1組小鼠基礎(chǔ)錯(cuò)誤次數(shù)減少（F=6.726，P=0.020），潛伏期延長（F=21.328，P=0.031）。見圖5。

圖2 各組小鼠海馬齒狀回BrdU免疫熒光染色結(jié)果

圖3 各組小鼠海馬齒狀回尼氏染色結(jié)果

圖4 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=12±s）

3 討論

老化過程常常伴隨著記憶的減退，甚至病理狀態(tài)的改變[4-6]。在老年大腦中，發(fā)現(xiàn)有很多與年齡相關(guān)的變化，如突觸傳遞的損傷，神經(jīng)傳遞素的合成和釋放，長時(shí)程增強(qiáng)作用，葡萄糖的利用，受體濃度等[7-9]。一直以來，海馬被認(rèn)為是大腦中參與學(xué)習(xí)記憶等活動(dòng)最主要的一個(gè)結(jié)構(gòu)，在老年動(dòng)物海馬功能的一系列改變中，最顯著的變化是齒狀回活性的減弱[10]。

IGF-1是一種在大腦功能中有多種作用的多肽，廣泛表達(dá)于大腦多個(gè)部位，且在海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生和突觸形成具有重要作用。隨著年齡的增長，老年動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力呈現(xiàn)衰退現(xiàn)象，這可能與腦中IGF-1的濃度下降有關(guān)。LEE等[11]研究表明，IGF-1和IGF-1R在老年小鼠海馬中的表達(dá)下降。然而，也有研究表明，IGF-1水平在老年鼠和年輕鼠中并未有差異[12]，盡管這個(gè)問題至今還存在爭議，但是IGF-1在動(dòng)物衰老過程及海馬認(rèn)知能力上的作用不容忽視。已有文獻(xiàn)證實(shí)，IGF-1通過與其受體結(jié)合，提升細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性，從而激活絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3激酶信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞周期、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖等[13]。本課題組前期利用過表達(dá)IGF-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，研究表明，IGF-1在體內(nèi)可以促進(jìn)成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化，從而促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[14]。IGF-1還影響神經(jīng)元成熟過程包括神經(jīng)傳遞素的產(chǎn)生，以及電生理活性等多個(gè)方面[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，老年鼠側(cè)腦室注射IGF-1后，海馬內(nèi)受體蛋白IGF-1R的表達(dá)會(huì)提高，并且新增殖細(xì)胞數(shù)和神經(jīng)元數(shù)也明顯增多，這提示外源性IGF-1在老年鼠體內(nèi)與受體結(jié)合，并促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖和神經(jīng)元產(chǎn)生。

目前，關(guān)于海馬神經(jīng)發(fā)生與認(rèn)知能力的相關(guān)性還有一些爭議，有報(bào)道表明，認(rèn)知缺陷與海馬全部或部分神經(jīng)發(fā)生功能的喪失密切相關(guān)，COUILLARD等[16]認(rèn)為，神經(jīng)發(fā)生不是學(xué)習(xí)能力的必要因素，但可以促進(jìn)其功能。ANDERSON等[17]認(rèn)為，老化過程與神經(jīng)發(fā)生及IGF-1水平的降低有關(guān)，注射IGF-1的老年大鼠其腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生會(huì)增加并且認(rèn)知障礙得到一些恢復(fù)。筆者的行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，給予外源性IGF-1注射后，可以提高老年小鼠的學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的認(rèn)知能力，但I(xiàn)GF-1是否直接通過促進(jìn)老年鼠海馬的神經(jīng)發(fā)生等活動(dòng)來提高認(rèn)知功能，還不能十分確定，或許是有一定關(guān)系，但仍需進(jìn)一步研究，這也是目前為止還存在爭議的一個(gè)問題。但本研究結(jié)果表明，IGF-1可以促進(jìn)老年小鼠的學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知能力的提高。

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（童穎丹 編輯）

Effect of exogenous insulin-like growth factors 1 on cognitive function in aged mice*

Lian-lian Wu1,Hong-hua Yuan2,Xiao-rong Zhu1
(1.Laboratory Animal Center;2.Research Center for Neurobiology, Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu 221004,China)

ObjectiveTo investigate the the effects of insulin-like growth factor 1 (IGF-1)on cognitive function in aged mice after microinjection of IGF-1.MethodsIGF-1 was injected into the lateral ventricles of aged C57/BL6 mice.The expression of IGF-1R was assayed by Western Blot.The proliferative cells of the hippocampal dentate gyrus were marked by 5-bromodeoxyuridine (BrdU)immunofluorescence.The neurons of the hippocampal dentate gyrus were determined by Nissl staining.Morris water maze and step-down test were performed to evaluate the cognitive function of the aged mice.ResultsWestern blot results showed that the protein level of IGF-1R increased in the IGF-1 treated group compared with the control group(P＜0.05).BrdU immunofluorescent results revealed BrdU-positive cells were obviously increased in the IGF-1 treated group compared to the control group(P＜0.05).Nissl staining revealed the increased number of neurons in the IGF-1 treated group compared with the control group(P＜0.05).Morris water maze test showed that escape latency of the IGF-1 treated group was significantly shorter than that of the control group after training,and the number of times through the platform was significantly larger than that of the control group (P＜0.05).Step-down test showed that the number of times of basal errors was dramatically smaller,and the latency was significantlylonger in the IGF-1 treated group compared with the control group(P＜0.05).ConclusionsAfter injection of IGF-1,the neurocognitive functions of aged mice were improved,so we may indicate that IGF-1 may improve the cognitive function in aged mice.

insulin-like growth factors 1;aged mice;5-bromo-2-deoxyuridine;Morris water maze;cognitive function

1005-8982（2017）03-0022-05

R 322.81

A

2016-05-31

江蘇省自然科學(xué)基金（No：BK2010180、BK20151151）

朱孝榮，E-m ai l：zxr1967@126.com；Tel：0516-83262060