劉瑛，周江堡

(攀枝花市婦幼保健院兒科，四川 攀枝花617000)

八肽膽囊收縮素對缺氧缺血性細(xì)胞損傷模型的干預(yù)作用

劉瑛，周江堡

(攀枝花市婦幼保健院兒科，四川 攀枝花617000)

目的 研究八肽膽囊收縮素(CCK-8)對缺氧缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用，以及凋亡過程中對神經(jīng)生長因子(NGF)蛋白及NGF mRNA表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)新生大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞7d，作為空白對照組(A組)，用50μmol/L谷氨酸浸泡處理后建立缺氧缺血細(xì)胞損傷模型(B組/模型組)，將CCK-8分別以濃度1×10-6mol/L (C組)、1×10-7mol/L(D組)、1×10-8mol/L(E組)進(jìn)行干預(yù)，作用后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，采用原位末端標(biāo)記技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測NGF蛋白表達(dá)，原位雜交技術(shù)檢測NGF mRNA表達(dá)。結(jié)果A組細(xì)胞有少量凋亡，凋亡率為(8.49±4.54)%，C組和D組細(xì)胞凋亡率分別為(3.87±5.64)%、(7.84±4.19)%，較B組的(17.53±6.93)%明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而E組凋亡率為(13.27±3.41)%，與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；A組未檢測出NGF蛋白表達(dá)(OD值0)，C組[OD值(0.343 2±0.006 81)]和D組[OD值(0.301 2±0.001 87)]較B組[OD值(0.2 83 7±0.007 69)]NGF蛋白表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，E組[OD值(0.275 2±0.003 73)]與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；A組有少量NGF mRNA表達(dá)[OD值(0.286 6±0.004 41)]，C組[OD值(0.347 4±0.010 04)]和D組[OD值(0.329 4±0.019 22)]較B組[OD值0.301 2±0.001 87)]NGF mRNA表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，E組[OD值(0.296 8±0.003 78)]與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論CCK-8能夠抑制缺氧缺血細(xì)胞模型凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷的程度，其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與促進(jìn)NGF蛋白及NGF mRNA表達(dá)增加有關(guān)。

膽囊收縮素；細(xì)胞凋亡；干預(yù)

近年來，有許多國內(nèi)外研究表明，膽囊收縮素(CCK)是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子，具有神經(jīng)保護(hù)作用[1]。CCK的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制目前尚不明確，學(xué)者們對此說法不一，其研究多數(shù)還在起步階段，目前無統(tǒng)一定論。本實驗通過外源性CCK-8干預(yù)體外培養(yǎng)的缺氧缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，探究對神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)生長因子(NGF)表達(dá)的影響，探討CCK的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 本實驗所用新生SD大鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，主要試劑有：CCK-8(美國Sigma公司)、谷氨酸(上海生物工程有限公司)、DMEM/F12培養(yǎng)基(德國Biochrom公司)、NGF免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，NGF原位雜交試劑盒及TUNEL試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

1.2 原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞 取新生＜24 h的SD大鼠大腦皮層組織，剪碎后放入DMEM/F12培養(yǎng)液中，胰酶反應(yīng)、過濾、離心后，取細(xì)胞組織加入含15%胎牛血清的培養(yǎng)液，然后充分吹打均勻成細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)板中接種培養(yǎng)(密度：1×105細(xì)胞/mL)，再置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，孵育48 h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天，10 μmol/L的阿糖胞苷加入培養(yǎng)液予以抑制非神經(jīng)細(xì)胞增殖，以后每3 d更換1次培養(yǎng)液。

1.3 實驗分組 將細(xì)胞隨機(jī)分空白對照組(A組)、谷氨酸處理組(B組/模型組)、1×10-6mol/L的CCK-8處理組(C組)、1×10-7mol/L的CCK-8處理組(D組)和1×10-8mol/L的CCK-8處理組(E組)，每組6孔。

1.4 建立缺血缺氧損傷細(xì)胞模型 細(xì)胞培養(yǎng)7 d后將培養(yǎng)液吸出，細(xì)胞爬片用50 μmol/L谷氨酸+ D-Hanks液浸泡處理，30 min后用DMEM洗兩遍，再用1/2DMEM/F12(含15%胎牛血清)加入1/2原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h?？瞻讓φ战M的細(xì)胞爬片則用D-Hanks液(未加谷氨酸)浸泡處理30 min，其余步驟相同。

1.5 施加CCK-8藥物處理 實驗C、D、E組加入CCK-8，在加谷氨酸前1 h加入，分組加入1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L的不同濃度CCK-8的培養(yǎng)液，處理1 h后吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞爬片用DMEM/ F12洗兩遍，再用谷氨酸+D-Hanks液浸泡處理，30 min后取出細(xì)胞爬片，用D-Hanks液洗細(xì)胞2遍后，再加入含不同濃度CCK-8的原培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h?？瞻讓φ战M和谷氨酸處理組不予CCK-8處理，僅以D-Hanks洗2遍，其余步驟相同。

1.6 檢測指標(biāo)及方法 各組細(xì)胞生長至第9天時用于檢測。

1.6.1 神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 各組細(xì)胞爬片均用0.01%吖啶橙染色，封片處理后在熒光顯微鏡下觀察。

1.6.2 檢測NGF蛋白表達(dá)和NGF mRNA表達(dá) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測NGF蛋白表達(dá)，NGF mRNA表達(dá)則采用原位雜交技術(shù)，所有步驟均參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.3 檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡 采用原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡，所有步驟均參照試劑盒說明書進(jìn)行。陽性細(xì)胞：藍(lán)紫色顆粒狀物著色于胞核內(nèi)(凋亡細(xì)胞)。陰性細(xì)胞：細(xì)胞核、胞漿不著色。隨機(jī)取10個高倍鏡視野計凋亡細(xì)胞數(shù)目，并計算各組細(xì)胞的凋亡百分率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 在熒光顯微鏡下，A組呈現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)基本正常，胞質(zhì)和胞核可見均勻的熒光染色，神經(jīng)細(xì)胞之間的網(wǎng)狀連接較為完整，B、E組見部分細(xì)胞變形，細(xì)胞核及核染色質(zhì)固定、縮小，可見細(xì)胞內(nèi)的凋亡小體；C、D組見大部分細(xì)胞形態(tài)維持較好，核、質(zhì)無明顯改變，凋亡細(xì)胞較少，見圖1。

2.2 細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果TUNEL檢測各組細(xì)胞凋亡率的結(jié)果見表1。數(shù)據(jù)表明，C組、D組有抑制凋亡的作用，且與濃度呈正相關(guān)，濃度越高，作用越強(qiáng)，而E組則沒有作用。

2.3 NGF蛋白和mRNA表達(dá)檢測結(jié)果NGF蛋白和mRNA表達(dá)檢測結(jié)果顯示見表1。數(shù)據(jù)顯示，C組、D組NGF蛋白表達(dá)和NGF mRNA表達(dá)明顯增高，與濃度呈正相關(guān)，濃度越高，表達(dá)越強(qiáng)。而E組與B組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

表1 各組細(xì)胞NGF蛋白及mRNA表達(dá)及細(xì)胞凋亡率比較(±s)

表1 各組細(xì)胞NGF蛋白及mRNA表達(dá)及細(xì)胞凋亡率比較(±s)

注：與B組比較，aP＜0.05。

組別NGF蛋白(OD值)NGF mRNA(OD值)細(xì)胞凋亡率(% A組B組C組D組E組F值P值0 0.283 7±0.007 69 0.343 2±0.006 81a0.301 2±0.001 87a0.275 2±0.003 73 1 150.14＜0.05 0.286 6±0.004 41 0.301 2±0.001 87 0.347 4±0.010 04a0.329 4±0.019 22a0.296 8±0.003 78 58.64＜0.05 8.49±4.54 17.53±6.93 3.87±5.64a7.84±4.19a13.24±3.41 6.45＜0.05

3 討論

CCK是廣泛存在于人體的胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種腦腸肽。CCK的最小活性片段為CCK-8，是CCK在神經(jīng)系統(tǒng)的主要存在形式。綜合近年來多項研究結(jié)果，歸納CCK-8的神經(jīng)保護(hù)作用主要為：減輕缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷[2]，抑制癲癇發(fā)作[3]，延緩神經(jīng)細(xì)胞老化[4]，提高認(rèn)知、空間、學(xué)習(xí)、記憶功能[5]，減輕局部腦缺血再灌注損傷[6]等等。

有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血性腦損傷引起谷氨酸過度蓄積，與不同類型受體作用，造成神經(jīng)元興奮性損傷甚至死亡[7]。本實驗采用谷氨酸處理的細(xì)胞模型來模擬缺氧缺血性細(xì)胞損傷，予CCK-8干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)接近正常神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率明顯下降，這證明CCK-8能夠抑制皮層神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度，增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)修復(fù)功能，有拮抗谷氨酸的神經(jīng)興奮性毒性作用。同時，實驗給予外源性CCK-8干預(yù)后，NGF蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加，且對CCK-8有濃度依賴性，這提示CCK-8可能通過刺激NGF表達(dá)增加而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對CCK的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了一些深入的研究，以期在藥理上為腦損傷保護(hù)劑的研究提供一些新思路。有學(xué)者綜合研究結(jié)果說明，CCK與NGF在神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)和修復(fù)方面有密切的相關(guān)性[8]。學(xué)者們公認(rèn)的是，NGF對腦的正常發(fā)育和功能維持起著重要作用[9]。已有許多研究發(fā)現(xiàn)，NGF對缺氧缺血性腦損傷有抑制損傷程度、促進(jìn)損傷修復(fù)的作用，是人們較為熟知的神經(jīng)保護(hù)因子。由于NGF不能通過血腦屏障，需采用顱內(nèi)插管或輸注泵的方式腦內(nèi)給藥，此為創(chuàng)傷性操作且副反應(yīng)較大，因此采用CCK-8促進(jìn)NGF合成和表達(dá)，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)的功效，這對缺血缺氧性腦損傷來說是一種新療法的嘗試。目前，CCK和NGF的藥理學(xué)研究都還在試驗階段，人們在細(xì)胞水平及器官水平、離體及在體方面對二者的相關(guān)性等進(jìn)行了大量的臨床研究，人們對CCK神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制也會有更深入的研究，為CCK在今后的臨床治療和藥理應(yīng)用提供更多的理論和實驗依據(jù)。

綜上所述，CCK-8能夠抑制缺氧缺血細(xì)胞模型凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷的程度，其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與促進(jìn)NGF蛋白及NGF mRNA表達(dá)增加有關(guān)。

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Intervention effect of cholecystokinin-8 on hypoxic-ischemic cell damage model.

LIU Ying,ZHOU Jiang-bao. Department of Paediatrics,Panzhihua Maternal and Child Health-Care Hospital of Sichuan Province,Panzhihua 617000, Sichuan,CHINA

ObjectiveTo investigate the intervention effect of cholecystokinin-8(CCK-8)on hypoxic-ischemic cell damage model,and to explore its effect on expression of nerve growth factor(NGF)protein and NGF mRNA in the neurons during apoptosis.MethodsNeonatal rat cerebral cortical neurons cultured in vitro for 7 d were selected as the blank control group(group A).Hypoxic-ischemic cell damage models(group B)were established by 50 mol/L glutamic acid soaking.The models treated with 1×10-6mol/L,1×10-7mol/L,1×10-8mol/L were enrolled as group C,D,E, respectively,followed by continuous culture for 24 h.The apoptosis rate of the cells of five groups was detected by in situ end labeling technique,and the expression of NGF protein was detected by immunocytochemistry.The expression of NGF mRNA was detected by in situ hybridization technique.ResultsThe apoptosis rate of group A,group C and group D were respectively(8.49±4.54)%,(3.87±5.64)%and(7.84±4.19)%,which were significantly lower than(17.53± 6.93)%in group B(P＜0.05).The apoptosis rate of group E was(13.27±3.41)%,which showed no significant difference with(17.53±6.93)%in group B(P＞0.05).The expression of NGF protein was not detected in the group A(OD value:0). NGF protein expression was significantly increased in group C(OD value:0.343 2±0.006 81)and group D(OD value: 0.301 2±0.001 87)than that in group B(OD value:0.283 7±0.007 69),and the differences were statistically significant (P＜0.05).There were no significant differences between group E(OD value:0.275 2±0.003 73)and group B(P＞0.05). There was a small amount of NGF mRNA expression in the group A(OD value:0.286 6±0.004 41).NGF mRNA expression were significantly increased in group C(OD value:0.347 4±0.010 04)and group D(OD value:0.329 4±0.019 22) than group B(OD value:0.301 2±0.001 87),and the differences were statistically significant(P＜0.05).There were no significant differences in NGF mRNA expression between group E(OD value:0.296 8±0.003 78)and group B(P＞0.05). ConclusionCCK-8 can suppress apoptosis of hypoxic-ischemic cell damage model,which neuroprotective mechanism was related to the increased expression of NGF protein and NGF mRNA.

Cholecystokinin;Apoptosis;Intervention

R-332

A

1003—6350（2017）02—0180—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.02.003

2016-07-03)

周江堡。E-mail：zhoujb1115@yahoo.com.cn