張曉俊　李承德　王煜　孫宏偉　毛淑梅

[摘要] 目的 探討伴發(fā)抑郁行為后支氣管哮喘大鼠體內(nèi)P物質(zhì)、皮質(zhì)醇含量的變化。 方法 Wistar大鼠隨機分為對照組（C組）、哮喘組（A組）、哮喘伴發(fā)抑郁組（A+D組），采用卵蛋白（ovalbumin，OVA）激發(fā)法建立哮喘模型，通過慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）誘發(fā)抑郁，評價動物哮喘及抑郁表現(xiàn)，檢測大鼠血液及肺組織P物質(zhì)、皮質(zhì)醇的含量。 結(jié)果 ①伴發(fā)抑郁后，哮喘大鼠肺部病變進一步加重。②與C組比較，A組、A+D組大鼠血漿及肺組織P物質(zhì)含量均顯著升高（P < 0.05），且A+D組水平高于A組（P < 0.05）。③與C組比較，A組血液及肺組織皮質(zhì)醇含量明顯降低（P < 0.05）；而與A組比較，A+D組血液及肺組織皮質(zhì)醇含量顯著升高（P < 0.05）。 結(jié)論 OVA激發(fā)復(fù)合CUMS可制備支氣管哮喘伴發(fā)抑郁大鼠模型，該模型P物質(zhì)、皮質(zhì)醇含量均較單純哮喘發(fā)生明顯變化。

[關(guān)鍵詞] 支氣管哮喘伴發(fā)抑郁；模型；P物質(zhì)；皮質(zhì)醇

[中圖分類號] R562.25 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（c）-0021-05

Influence of bronchial asthma with coexisted depression on levels of cortisol and substance P in rats

ZHANG Xiaojun1 LI Chengde1 WANG Yu1 SUN Hongwei2 MAO Shumei1

1.Department of Pharmacology， Weifang Medical College The Key Laboratory of Applied Pharmacology in Shandong Province， Shandong Province， Weifang 261053， China； 2.Department of Applied Psychology， Weifang Medical College， Shandong Province， Weifang 261053， China

[Abstract] Objective To detect the changes in levels of cortisol and substance P in rats of asthma with coexisted depression. Methods Wistar rats were randomly divided into the control group （group C）， asthma group （group A） and asthma with coexisted depression group （group A+D）. The group A and group A+D were sensitized with ovalbumin for 4 weeks. Then the group A+D was exposed to a CUMS procedure for another 4 weeks. Asthmatic manifestations and depressive-like behaviors were investigated. Levels of substance P and cortisol were measured by radioimmunoassay. Results ①The asthmatic manifestations of group A+D were worse than the group A. ②Rats in group A and group A+D had much higher levels of substance P than the rats in group C （P < 0.05）； group A+D had even higher substance P levels than group A （P < 0.05）. ③Levels of cortisol in group A significantly decreased if compared to the group C （P < 0.05）； however， levels of cortisol in group A+D significantly increased if compared to the group A （P < 0.05）. Conclusion Ovalbumin excitation combined with CUMS can establish asthma with coexisted depression moldel in rats， which had higher levels of substance P and cortisol than the rats only with asthma.

[Key words] Bronchial asthma with coexisted depression； Rat model； Substance P； Cortisol

支氣管哮喘是一種發(fā)病率很高的呼吸系統(tǒng)疾病[1-2]，眾多支氣管哮喘患者伴發(fā)抑郁情緒，而抑郁在哮喘的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中發(fā)揮著重要的作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，單發(fā)哮喘或單發(fā)抑郁時體內(nèi)P物質(zhì)含量均升高，此外哮喘時皮質(zhì)醇分泌減少，而抑郁時皮質(zhì)醇分泌增加[5]。當(dāng)患有哮喘伴發(fā)抑郁時P物質(zhì)、皮質(zhì)醇將如何變化未見報道。本研究擬建立支氣管哮喘伴發(fā)抑郁的大鼠模型，觀察其P物質(zhì)、皮質(zhì)醇含量的變化，探索其對哮喘的影響，為疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠，雄性，24只，體重200～220 g，購自山東大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK（魯）2003-0004。大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后，隨機分為對照組（C組）、哮喘組（A組）、哮喘伴發(fā)抑郁組（A+D組），每組8只，每籠4只飼養(yǎng)。

1.1.2 藥品試劑與儀器 卵蛋白（OVA，美國Sigma公司）；氫氧化鋁（淄博化學(xué)試劑公司）；P物質(zhì)、皮質(zhì)醇放免試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）；霧化泵（德國PARI公司）；BH6020型組合式γ計數(shù)器（北京核儀器廠）；大鼠敞箱、游泳箱、大鼠束縛盒、明暗顛倒裝置均根據(jù)文獻[6-7]自制。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 將24只Wistar大鼠隨機分為對照組（C組）、哮喘組（A組）、哮喘伴發(fā)抑郁組（A+D組）。哮喘模型制備過程：分組后，大鼠腹腔注射致敏液（1 mL/只，含OVA 100 mg，氫氧化鋁200 mg），2周后大鼠接受連續(xù)4周的霧化吸入1% OVA（每天20 min，流量40 mL/20 min），4周后改為每5天接受霧化吸入1次[7]。A組不予以慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）。A+D組：以A組相同的方式誘發(fā)哮喘，完成4周霧化吸入OVA后，予以大鼠4周的CUMS，刺激包括夾尾180 s，束縛1 h，禁水48 h，禁食48 h，冷水游泳5 min（4 ℃），電擊足底（電壓30 V，電擊15 s后間歇5 s）共進行120 s，熱環(huán)境5 min（45 ℃），噪聲干擾2 h，晝夜節(jié)律和光照性質(zhì)改變，鼠籠傾斜，潮濕墊料等[7-8]。對照組致敏與激發(fā)均以生理鹽水取代OVA，不予以CUMS。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fuid，BALF）分類細胞及計數(shù) 處死大鼠后，迅速分離一側(cè)肺臟，以生理鹽水進行充分灌洗，收集灌洗液，3000 r/min離心10 min，分類計數(shù)BALF中炎癥細胞。

1.2.3 肺組織病理變化 取大鼠另一側(cè)新鮮肺組織，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肺組織炎癥細胞浸潤等病理變化；1%鋨酸固定小塊肺組織，超薄切片并進行鈾鉛染色，電子透射顯微鏡下觀察肺Ⅱ型細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.4 糖水偏好度實驗 正式測試前先訓(xùn)練大鼠飲用1%蔗糖水。禁食禁水24 h后，每只大鼠分別予以兩瓶液體，分別為純水與1%蔗糖水，大鼠自由攝取液體2 h，計算每瓶液體的消耗量。糖水偏好度=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%。該實驗在模型制備前后分別測試1次。

1.2.5 Open-field實驗 將大鼠置于敞箱（100 cm×100 cm×80 cm，均分為25格）中心，大鼠在安靜環(huán)境中自由探索3 min，對大鼠活動情況進行錄像，然后由經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員計數(shù)大鼠水平活動及垂直活動得分[4]。測試每只后，用70%酒精對敞箱進行清潔處理。該實驗在模型制備前后分別測試1次。

1.2.6 P物質(zhì)、皮質(zhì)醇含量測定 實驗結(jié)束時，各組大鼠于8∶00～10∶00經(jīng)頸總動脈取血2 mL置于防凝管，加入抑肽酶40 μL，3000 r/min離心10 min，血漿分裝后置于-80℃保存。取肺組織進行勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液分裝置于-80℃保存。P物質(zhì)、皮質(zhì)醇含量測定嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞計數(shù)

由表1可見，與C組比較，A組、A+D組大鼠BALF中巨噬細胞、嗜酸粒細胞、淋巴細胞及中性粒細胞計數(shù)顯著升高（P < 0.05）；與A組比較，A+D組大鼠上述炎癥細胞數(shù)量進一步升高（P < 0.05）。

2.2 大鼠肺組織HE染色

C組大鼠肺泡輪廓清晰完整，間隔形態(tài)無異常，未見顯著炎癥細胞浸潤；A組大鼠肺泡輪廓欠清晰，部分肺泡擴張，肺泡壁明顯水腫、增厚，可見大量炎癥細胞浸潤；A+D組大鼠肺泡破壞較A組進一步加重，肺泡壁水腫增厚更加顯著，炎癥細胞浸潤更加明顯。見圖1。

2.3 電鏡觀察大鼠肺Ⅱ型細胞超微結(jié)構(gòu)情況

A組大鼠肺Ⅱ型細胞線粒體明顯腫脹，線粒體嵴模糊，板層小體結(jié)構(gòu)受損，染色質(zhì)聚集深染；A+D組大鼠肺Ⅱ型細胞結(jié)構(gòu)破壞較A組更加顯著，線粒體腫脹明顯，線粒體嵴斷裂，板層小體結(jié)構(gòu)受損，排空現(xiàn)象明顯。見圖2。

2.4 三組大鼠糖水偏好度比較

由表2可見，造模前C組、A組及A+D組大鼠糖水偏好度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；造模后，與C組比較，A+D組大鼠糖水偏好度顯著降低（P < 0.05），而A組無顯著變化（P > 0.05）。

2.5 各組大鼠Open–field實驗活動得分情況

由表3可見，造模前C組、A組及A+D組大鼠水平活動得分及垂直活動得分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05）；造模后，與C組比較，A+D組大鼠水平活動得分及垂直活動得分均顯著降低（P < 0.05），而A組無顯著變化（P > 0.05）。

2.6 各組大鼠P物質(zhì)含量變化

由表4可見，與C組比較，A組、A+D組大鼠血漿及肺組織P物質(zhì)含量均顯著升高（P < 0.05），且A+D組水平顯著高于A組（P < 0.05）。

2.7 各組大鼠皮質(zhì)醇含量變化

由表4可見，與C組比較，A組血液及肺組織皮質(zhì)醇含量明顯降低（P < 0.05）；而與A組比較，A+D組血液及肺組織皮質(zhì)醇含量顯著升高（P < 0.05）。

3 討論

本實驗參考了目前普遍采用的OVA致敏激發(fā)方法[7]略加改進制備哮喘模型，在此基礎(chǔ)之上，采用文獻中廣泛應(yīng)用的CUMS法[7-8]進一步使動物出現(xiàn)抑郁。實驗結(jié)果顯示，A組及A+D組大鼠具有哮喘病的一般表現(xiàn)及肺組織病理改變等特性，后者尚出現(xiàn)糖水?dāng)z取下降、Open–field實驗中大鼠水平活動得分及垂直活動得分顯著下降，表明兼?zhèn)淞艘钟舻奶卣鳎崾鞠榘l(fā)抑郁模型制備成功。

P物質(zhì)是一種非腎上腺素能非膽堿能物質(zhì)，報道顯示哮喘時體內(nèi)P物質(zhì)含量升高[9]。研究表明，過高濃度的P物質(zhì)可收縮氣道平滑肌，增加微血管壁通透性，促進黏膜水腫的形成，激活嗜酸粒細胞等，促進了哮喘的病理過程。而NK1拮抗劑可以通過阻斷P物質(zhì)與NK1受體結(jié)合，而改善哮喘表現(xiàn)[10]。本實驗結(jié)果顯示，A組大鼠P物質(zhì)顯著升高，與上述觀點一致。而本研究中尚發(fā)現(xiàn)A+D組大鼠體內(nèi)P物質(zhì)含量較A組進一步升高，與此一致的是A+D組大鼠哮喘表現(xiàn)進一步加重，說明P物質(zhì)的變化可能是抑郁加重哮喘的一個重要因素。此外，有報道顯示，P物質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要傳遞傷害性刺激，與應(yīng)激密切相關(guān)[11-12]，它可通過與中樞NK1受體結(jié)合而發(fā)揮效應(yīng)。NK1受體廣泛分布于杏仁核、下丘腦、海馬、紋狀體及韁核等部位[13]，P物質(zhì)與NK1受體的分布總體上相對應(yīng)[14]。而這些部位均參與了應(yīng)激反應(yīng)及情感行為控制的調(diào)節(jié)，如抑郁和焦慮。據(jù)此推斷，哮喘時體內(nèi)過高的P物質(zhì)與上述部位的NK1受體結(jié)合，引起患者的抑郁情緒，由此可見P物質(zhì)是抑郁和哮喘病理過程的一個共同通路，這可以解釋臨床上哮喘患者為什么易伴發(fā)抑郁。據(jù)此，筆者建議采用P物質(zhì)受體阻斷劑來治療哮喘伴發(fā)抑郁，可以同時起到阻止哮喘與抑郁發(fā)展的雙重療效。而P物質(zhì)受體阻斷劑在2004年國際神經(jīng)精神藥理學(xué)大會上被推薦為治療抑郁癥最有前途的一個新型藥物。

HPA軸在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，研究顯示，哮喘時該軸被抑制，皮質(zhì)醇分泌減少[15]。此外文獻報道，抑郁時因應(yīng)激而損傷了海馬，海馬對HPA軸的抑制作用明顯減弱，從而HPA軸亢進，皮質(zhì)醇分泌增加[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，A組大鼠血液皮質(zhì)醇含量較C組顯著降低，與文獻報道相一致[17-18]；A+D組皮質(zhì)醇較A組明顯升高，說明此時體內(nèi)HPA軸被激活，理論上這將有利于哮喘的恢復(fù)，但這與臨床上哮喘伴發(fā)抑郁患者病情相對較重以及本研究中A+D組哮喘病變更重的現(xiàn)象相違背。有研究顯示，心理應(yīng)激可以改變哮喘動物糖皮質(zhì)激素受體的數(shù)目以及受體對激素的敏感性[19-20]，這也可能也是本研究中雖然A+D組皮質(zhì)醇含量較高，但哮喘仍重于A組的原因。

綜上所述，哮喘伴發(fā)抑郁時P物質(zhì)及皮質(zhì)醇均發(fā)生了顯著變化，P物質(zhì)受體阻斷劑可能是較理想的治療哮喘伴發(fā)抑郁的藥物之一。

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（收稿日期：2016-06-11 本文編輯：程 銘）